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2 艾滋病病毒 HIV 抗体筛查试验 ELISA 试验 化学发光法 快速检测 补充试验 抗体确证试验 : 免疫印迹试剂 (WB) 和条带免疫试验 (RIBA) 核酸试验 : 核酸定性和核酸定量试验

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4 病毒外层为脂蛋白包膜 : 上有 gp120 外膜蛋白和 gp41 跨膜蛋白 病毒核心部分 : RNA 逆转录酶 p17 内膜蛋白, p24 衣壳蛋白

5 HIV-1 通过 gp120 与靶细胞表面 CD4 分子和趋化因子受体结合

6 HIV 生活周期 吸附 - 穿入 - 脱壳 - 生物合成 - 组装成熟和释放

7 吸附 :HIV 外膜 gp120 与 T4 细胞 单核 - 巨噬细胞和其他带 CD4 受体的细胞结合 穿入和脱壳 : HIV 进入宿主细胞, 脱壳 逆转录 : 病毒 RNA 逆转录转为 c-dna 整合 : 病毒 cdna 与宿主 DNA 整合 翻译, 装配, 芽生 : 形成病毒蛋白, 装配病毒颗粒, 从宿主细胞膜芽生出新病毒

8 基因类型 蛋白类型 蛋白种类 抗体种类 Gag 基因 gag 核蛋白 P55 P55 抗体 P24 P24 抗体 P17 P17 抗体 Env 基因 env 包膜蛋白 gp160 gp160 抗体 gp120 gp120 抗体 gp41 gp41 抗体 Pol 基因 pol 蛋白 P66 P66 抗体 P51 P51 抗体 P31 P31 抗体

9 HIV 抗体检测可用于诊断 血液筛查 监测等 以诊断为目的的检测是为了确定个体 HIV 感染状况, 包括临床检测 自愿咨询检测 根据特殊需要进行的体检等 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播 HIV, 包括献血员筛查和原料血浆筛查 以监测为目的的检测是为了解不同人群 HIV 感染率及其变化趋势, 包括各类高危人群 重点人群和一般人群

10 血清 / 血浆 / 全血 滤纸干血斑 口腔黏膜渗出液 尿液

11 国家食品药品监督管理局注册批准 有效期内 酶联免疫试剂应批批检合格 选择敏感性和特异性高的试剂

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15 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 化学发光或免疫荧光试验 (CIA/IFA) : 采用发光或荧光底物, 用发光或荧光仪测定结果 快速检测 (RT) 及其它检测试验 (1) 明胶颗粒凝集试验 (PA) (2) 免疫渗滤试验 (3) 免疫层析试验

16 HIV 抗体检测试剂 ( 第三代 ): 检测 HIV-1/2 抗体 HIV 抗原抗体联合检测试剂 ( 第四代 ): 可同时检测血液中 HIV-1P24 抗原和 HIV-1/2 抗体 用酶标仪测定结果 有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定

17 第一代 四代艾滋病酶联免疫试剂比较 solid phase 病毒裂解液 HIV-1 conjugate -IgG 抗体 specific detection of IgG 抗体 HIV-1 第二代 病毒裂解液重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 IgG 抗体 IgG 抗体 HIV-1 / -2 第三代 病毒裂解液重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O 病毒裂解液重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O 第四代 病毒裂解液重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab 病毒裂解液重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体 IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原

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20 第一 二 代 Y Y 第三代 Y 第四代 Y Y Y 固相 血清标本 酶标记 物

21 HIV 抗原 IgM 抗体 IgG 抗体 4 th 代 3 rd 代 1 st -2 nd 代 检测线 <= 窗口期 => => =>

22 阴性对照 阴性 阳性对照 质控 阳性

23 临界值概念 : 将检测的阳性和 ( 或 ) 阴性对照的 OD 值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值 判断标准 : 标本 OD 值与临界值的比值大于等于 1(S/CO 1) 为阳性 ( 对间接法及双抗原夹心法 ) 注意 : 不同厂家 不同方法临界值计算公式不同 如 :cutoff=0.15+ MAX(Nc,0.08) cutoff=0.1+nc

24 问题可能的原因 ( 非试剂盒本身的原因 ) 1. 加样本及试剂量不准 2. 加样过快, 孔间发生污染 测定的重复性差 3. 加错样本 4. 加样本和试剂时, 加在孔壁上部非包被区 5. 温育时间 洗板 显色时间不一致 6. 酶标仪滤光片问题

25 问题可能的原因 ( 非试剂盒本身的原因 ) 白板 ( 阳性对照不显色 ) 全部板孔都有显色 1. 漏加酶结合物 2. 洗液配制问题, 量筒不干净含酶抑制物 3. 漏加显色剂 A 或 B 4. 终止液当显色剂使用 1. 洗板不干净 2. 加底物的吸头被酶污染 3. 洗板液受酶污染 4. 由于仪器或加样头造成的交叉污染

26 内源性干扰因素 外源性干扰因素

27 人血清标本中含有非特异性干扰物质, 可以不同程度影响检测结果 常见的有 : 类风湿因子 补体 嗜异性抗体 医源性诱导的抗体 自身抗体 溶菌酶 磷脂 药物小分子等

28 常常是由于血标本的采集 贮存等不当 所致 如标本溶血 细菌污染 标本贮 存时间过长 凝集不全 反复冻融等

29 分析 ELISA 测定中出现的假阳性或假阴性结 果时, 需综合考虑试剂因素 操作因素和 标本因素等

30 优点 : 准确性高 价格低廉 判断结果标准客观 结果便于记录和保存 用途 : 流行病学监测及临床大量标本的检测

31 采用发光或荧光底物 既可检测抗体, 也可联合检测抗原抗体 酶或荧光标记的 HIV 抗原或抗体, 加发光或荧光底物 用发光仪或荧光仪测定结果

32 快速检测 (RT) 及其它检测试验 (1) 明胶颗粒凝集试验 (PA) 将 HIV 抗原致敏明胶颗粒作为载体, 与待检样品作用, 混匀后保温 ( 一般为室温 ) 当待检样品含有 HIV 抗体时, 经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原 - 抗体反应, 根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果

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34 (2) 免疫渗滤试验 : 斑点免疫胶体金 ( 或胶体硒 ) 快速试 验 以硝酸纤维膜为载体 HIV 抗原点状固定在膜上 加待检样品 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点 有效试验的质控点必须显色

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36 以硝酸纤维膜为载体 HIV 抗原线状固定在膜上 待检样品 ( 血液 唾液或尿液 ) 沿着固相载体迁移 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带 有效试验的质控带必须显色 第四代快速试剂 (SD): 可区分抗原抗体的检测

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39 快速检测 (RT) 及其它检测试验 全血样品加 50ul 样品于样品垫中 手指血方法 15 分钟内读取结果 加一滴缓冲液 静脉血方法

40 质控条 病人条

41 优点 : 快速 单份标本检测 不需额外试剂或设备 操作简便缺点 : 肉眼判断较主观 价格较贵 结果不易保存 ( 建议拍照保存 )

42 检测目的 实验设施条件 价格 其他 : 检测数量 标本用量 复检问题 习惯等等

43 阴性 : 真阴性 假阴性 阳性 : 真阳性 假阳性 未感染或暴露于 HIV 病毒 注意窗口期 感染或暴露于 HIV 病毒 非特异性反应 操作失误 处理 : 筛查试验无反应报告为 HIV 抗体阴性 ; 有反应必须进行复检, 复检两次检测均无反应报告为 HIV 抗体阴性, 复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行 补充试验 ; 报告为 HIV 感染待确定, 不能出具阳性报告

44 是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体或者核酸确定艾滋病病毒感染的检测方法 补充试验包括抗体补充试验 ( 免疫印迹试验 条带 / 线性免疫试验 ) 和核酸补充试验 ( 核酸定性检测和核酸定量检测试验 )

45 确证试验的试剂 : 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准 在有效期内的试剂 确证样品 : 可采用血清 血浆 滤纸干血斑确证试验方法 : 免疫印迹试验 (WB) 和条带 / 线性免疫试验 (RIBA/LIA) 国内常用的确证试验方法是 WB 和 RIBA

46 公司试剂原理 新加坡 MP 亚太私人医药有限公司杭州澳亚生物技术有限公司上海英旻泰生物技术有限公司北京万泰生物药业股份有限公司 人类免疫缺陷病毒 (HIV1+2 型 ) 抗体检测试剂盒 ( 免疫印迹法 ) 人类免疫缺陷病毒抗体确证试剂盒 ( 免疫印迹法 ) 人类免疫缺陷病毒 (HIV 1+2 型 ) 抗体检测试剂盒 ( 免疫印迹法 ) 人类免疫缺陷病毒 (HIV 1+2 型 ) 抗体检测试剂盒 ( 重组免疫印迹法 ) WB WB WB RIBA Abbott Slot immunoblot strip RIBA Innogenetics INNO-LIA HIV I/II Score RIBA

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50 HIV 抗体 WB 确证实验结果 (MP) a b c d gp160 gp120 p55 p51 p66 gp41 p39 p31 P24 p17 血清对照 HIV-2 特异带 a 强阳性对照 (HIV-1 和 HIV-2) b 弱阳性对照 (HIV-1) c 阴性对照 d 典型的 HIV-2 血清阳性反应

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55 * 仅有 gp160 和 gp41 同时出现条带且显色较弱时, 建议对样本进行核酸检测, 或者 4 周后随访检测

56 原因 :HIV 感染早期 HIV 感染晚期非特异性反应污染依据 : 流行病学资料 ; 临床表现 ;WB 条带等处理 : 核酸检测 2-4 周后随访带型消失或无进展出现新带型重采血

57 18 个月以下婴幼儿的 HIV 诊断 HIV 抗体 母亲 HIV 抗体经胎盘进入胎儿, 出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性, 不一定是感染 出生时母亲的抗体,80~90% 在生后 9~12 个月消失, 出生后 18 个月基本上全部消失 18 个月后儿童 HIV 抗体仍然阳性, 视为自身感染产生的抗体

58 适用于 : HIV 感染产妇所生婴幼儿 ; 母亲 HIV 感染状态不详, 儿童出现 HIV 相关临床表现, 临床怀疑 HIV 感染的儿童 婴儿 12 个月时进行 HIV 抗体检测阴性排除感染, 纳入正常儿童保健 ; 阳性者继续追踪随访, 至 18 个月再次进行 HIV 抗体检测, 结果阴性排除感染

59 试剂 -1 有反应 无反应 试剂 1 双份或双孔检测或两种试剂 均有反应一有反应, 一无反应 均无反应 补充实验 报告 HIV 抗体阴性 图 2 使用抗体检测试剂的检测流程

60 不区分抗原抗体的检测试剂 有反应 无反应 抗体双份或双孔检测 均有反应一有反应, 一无反应 均无反应 补充试验 HIV-1 核酸试验或 P24 抗原试验或 2-4 周后随访 报告 HIV 抗体阴性 P24 抗原阴性 图 3 使用不区分抗原抗体联合检测试剂的检测

61 区分抗原抗体检测试剂 抗体有反应抗原有反应 抗体有反应抗原无反应 抗体无反应抗原无反应 抗体无反应抗原有反应 抗体检测 * 抗体检测 * 无反应 均有反应一有反应一无反应 均有反应一有反应一无反应 无反应 补充试验 报告 HIV 抗体阴性, HIVP24 抗原阴性 HIV-1 核酸试验或 2~4 周后随访 图 4 区分抗原抗体检测试剂筛查检测流程

62 免疫印迹试验 (WB/RIBA) 不确定 阴性 阳性 出现 HIV-2 指示带 核酸试验或 2-4 周后随访 报告 HIV-1 抗体阴性 报告 HIV-1 抗体阳性 根据情况进一步检测 HIV-2 图 5 免疫印迹试剂 (WB/RIBA) 试验流程

63 HIV-1 核酸检测 HIV-1 核酸定性检测 HIV-1 核酸定量试验 低于检测限 高于检测限 有反应报告 HIV-1 核酸阳性 无反应报告 HIV-1 核酸阴性 报告低于检测限 >5000c ps/ml, 报告检测值 5000cp s/ml 重新采样检测 图 8 HIV 核酸试验流程

64 定性检测结果有反应, 报告 HIV-1 核酸阳性 ; 无反应, 报告 HIV 核酸阴性 定量检测结果低于检测限, 报告低于检测限 ; 检测结果大于 5000CPs/ml, 报告检测值 ; 检测结果低于等于 5000CPs/ml, 尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测, 报告检测值 临床医生可结合临床及流行病史 CD4+T 淋巴细胞检测值或者 HIV-1 抗体随访检测结果等进行诊断或排除诊断

65 HIV1/2 抗体或抗原抗体联合检测试验 无反应 有反应 方案 1 相同样本相同试验双孔复试 方案 2 复试结果无反应 -,- 复试结果有反应 -,+;+,+ 阴性报告血液检测合格 图 9 血液抗原抗体筛查试验流程 反应性报告血液检测不合格 如需进一步检测, 参照临床诊断检测策略

66 NAT 检测 NAT 单人份检测 NAT 混样检测 有反应 无反应 有反应 反应性报告血液检测不合格 如需进一步检测, 参照临床诊断检测策略 按说明书拆分检测 无反应 阴性报告血液检测合格 图 10 血液核酸 HIV 试验流程

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68 艾滋病感染孕妇所生儿童 无反应 12 个月进行 HIV 抗体筛查试验有反应 用另一种筛查试剂再次检测 无反应 有反应 18 个月时再进行 HIV 抗体筛查试验无反应有反应试剂 1 双份或双孔检测 无反应 有反应 报告 HIV 抗体阴性 无反应 抗体补充试验 报告 HIV 抗体阳性 有反应 不确定 提供咨询, 继续随访, 进行核酸检测等补充试验 图 12 艾滋病感染产妇所生儿童 HIV 抗体检测流程

69 根据目的选择检测方法及检测策略 严格遵守实验室标准操作程序 (SOP) 结果判定以试剂盒说明书为标准 筛查试验有反应, 须作补充试验

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