检验医学 2014 年 8 月第 29 卷第 8 期 LaboratoryMedicine,August2014,Vol29.No 值 ) 对减少假阳性和假阴性, 确保试验的敏感性和特异性具有重要意义 [3] 研究表明受试者工作特征 (receiveroperatingcharacter

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唱松
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1 826 文章编号 : (2014) 中图分类号 :R 文献标志码 :A DOI: /j.isn ROC 曲线对 ELISA 检测丙型肝炎抗体阳性判断值的确定和分析唐婧, 包建玲, 孟存仁, 张朝霞 ( 新疆医科大学第一附属医院医学检验中心, 新疆乌鲁木齐 ) 摘要 : 目的采用受试者工作特征 (ROC) 曲线确定和分析 2 种不同酶免分析系统酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测丙型肝炎抗体 ( 抗 HCV) 的阳性判断值 (Cut of) 方法收集 202 份血清, 用重组免疫印迹法 (RIBA) 确认抗 HCV, 同时采用国产 addcareelisa1100 全自动酶免分析系统 ( 简称 addcareelisa1100) 和进口 TECAN+FAME 组合的酶免分析系统 ( 简称 TECAN+FAME 酶免系统 ) 检测抗 HCV, 对吸光度 (A) 值绘制 ROC 曲线, 得出 ELISA 检测抗 HCV 在本实验室的最佳 Cut of 值结果以 RIBA 结果为金标准,ROC 曲线分析结果显示,addcareELISA1100 检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为 0.448, 敏感性为 99.3%, 特异性为 96.7%, 约登指数为 0.960,ROC 曲线下面积为 0.998,TECAN+FAME 酶免系统检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为 0.406, 敏感性为 99.3%, 特异性为 96.7%, 约登指数为 0.960,ROC 曲线下面积为结论采用 ROC 曲线分析得到两种不同酶免分析系统 ELISA 检测抗 HCV 的 Cut of 值分别为和 0.406, 检测抗 HCV 的灰区分别设定为 ~0.448 和 0.140~0.406, 均可优化检测性能关键词 : 丙型肝炎抗体 ; 酶联免疫吸附试验 ; 重组免疫印迹法 ;cut of 值 ; 受试者工作特征曲线 Confirmationandanalysisofthecut ofvalueinhepatitiscantibodydeterminedbyelisawithreceiver operatingcharacteristiccurve TANGJing,BAOJianling,MENGCunren,ZHANGZhaoxia. (CenterforClinical Laboratory,theFirstAfiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUrumqi830054,China) Abstract:Objective Toconfirm andanalyzethecut ofvalueinanti hepatitisc virus(hcv) antibody determinedby2diferentkindsofenzyme linkedimmunosorbentasay(elisa)analysissystemswithreceiveroperating characteristic(roc)curve.methods Atotalof202seraconfirmedbyrecombinantimmunoblotasay(RIBA)were determinedbydomesticaddcareelisa1100automaticanalysissystem andimportedcombinedtecan withfame ELISAanalysissystemforanti HCVantibody.ROCcurvewasdrawnwithabsorbance(A)bySPSS17.0software,and theoptimalcut ofvaluewasobtained.results AccordingtotheresultsofROCcurve,RIBAasthegoldenstandard, theoptimalcut ofvalueswere0.448inaddcareelisa1100automaticanalysissystemand0.406intecan+fame combinedelisaanalysissystem.theirsensitivities,specificities,youdenindicesandareasunderroccurvewere 99.3%,99.3%;96.7%,96.7%;0.960,0.960and0.998,0.998.Conclusions Thecut ofvaluesare0.448 and0.406inthe2analysissystemswithbyroccurve,andtheambiguousregionsare and The2ELISAanalysissystemscanoptimizetheperformanceofdetection. Keywords:Anti hepatitisc virusantibody;enzyme linkedimmunosorbentasay;recombinantimmunoblot asay;cut ofvalue;receiveropeartingcharacteristiccurve 丙型肝炎病毒 (hepatitiscvirus,hcv) 感染引起的丙型病毒性肝炎呈全球分布, 大约有 1.7 亿人为 HCV 感染者, 占世界人口的 3%, 且发展中国家高于发达国家 [1] 丙型肝炎病毒抗体( 抗 HCV) 是目前应用最广泛的用于流行病学调查临床丙型肝炎患者筛查和诊断的检测项目, 为丙型肝炎的早发现早治疗提供了可靠的依据 [2] 酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbent asay,elisa) 是抗 HCV 检测最常用的方法在免疫定性测定中, 确定合适的阳性判断值 (Cut of 基金项目 : 卫生部医药卫生科技发展研究中心专项课题 ( ) 作者简介 : 唐婧, 女,1988 年生, 学士, 主要从事丙型肝炎的免疫学新进展研究通讯作者 : 张朝霞, 联系电话 :

2 检验医学 2014 年 8 月第 29 卷第 8 期 LaboratoryMedicine,August2014,Vol29.No 值 ) 对减少假阳性和假阴性, 确保试验的敏感性和特异性具有重要意义 [3] 研究表明受试者工作特征 (receiveroperatingcharacteristic,roc) 曲线是设定 Cut of 值的最佳方法 [4] 我们采用 ROC 曲线确定实验室两种不同酶免分析系统检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值, 以提高 ELISA 检测抗 HCV 的敏感性和特异性材料和方法一研究对象使用盲法收集 2013 年 3 月至 2013 年 5 月新疆医科大学第一附属医院医学检验中心血清标本 202 份, 分离血清, 置 -80 保存待测标本来源对象年龄 1~82 岁, 男 93 例, 女 109 例, 其中 132 份来自肝病科门诊和住院患者 70 份来自普通门诊患者和体检者二仪器与试剂 addcareelisa 1100 全自动酶免分析系统 ( 简称 ddcareelisa1100, 烟台生物科技有限公司 );TECAN 加样系统 ( 瑞士帝肯公司 );FAME 后处理系统 ( 瑞士哈美顿公司 ) 抗 HCV 确证试剂盒 [ 重组免疫印迹法 (recombinantimmunoblot asay,riba)] 由北京万泰生物药业股份有限公司提供 ( 批号为 RC ); 抗 HCV 诊断试剂盒由 (ELISA) 北京万泰生物药业股份有限公司提供 ( 批号为 C ) 所有试剂均在有效期内使用, 按说明书操作三方法 1. 标本检测对 -80 保存待测的 202 份血清标本分别用上述指定厂家的抗 HCV 诊断试剂 (ELISA) 和抗 HCV 确证试剂 (RIBA) 进行抗 HCV 测定和抗 HCV 确认, 记录吸光度 (A) 值, 其中 ELISA 分别用 addcareelisa1100 和 TECAN+ FAME 组合酶免分析系统 ( 简称 TECAN+FAME 酶免系统 ) 进行检测检测前两种系统均进行了校准和性能验证 2.RIBA 确认结果判定条带强度的判读和结果的解释见表 1 和表 2 表 1 RIBA 抗 HCV 反应条带强度的判读标准条带强度分值空白小于对照线 1 的强度 +/- 等于对照线 1 的强度 1+ 大于对照线 1 的强度 2+ 表 2 RIBA 抗 HCV 反应结果的判读标准显示条带分析结果未出现 HCV 抗体特异条带强度 HCV 抗体阴性 1+ 及以上至少出现 2 种 HCV 抗体特异条带 HCV 抗体阳性强度 1+ 及以上仅出现 1 种 HCV 抗体特异条带强 HCV 抗体不确定度 1+ 及以上注 :HCV 抗体特异条带种类包括 Core 蛋白 NS3 蛋白 NS4 蛋白 (NS4 1 和 NS4 2), 其中任意 1 条或 2 条条带强度 1+ 及以上认为出现 NS4 特异性条带 NS5 蛋白 3. 质量控制 ELISA 检测每一批分别设定 2 个阴性对照 2 个阳性对照和 1 个质控, 其中阴性对照孔 A 值 0.08, 阳性对照孔 A 值 0.50, 否则实验无效, 质控孔 S/CO 值在 2.39~4.96 的范围内 RIBA 检测每一批分别设定 1 个阴性对照和 1 个阳性对照, 其中阴性对照出现对照线 1 和对照线 2, 阳性对照出现 Core NS3 NS4 1 NS4 2 NS5 对照线 1 和对照线 2, 且每条试验结果中对照线 1 和对照线 2 均必须出现, 如果对照线 1 和对照线 2 均不出现或仅出现 1 条, 则此条的检测结果无效试验均有良好的质量控制 4.Cut of 值的验证 EP12 A 文件 Cut of 值的验证方法 :(1) 准备具有临界值浓度和浓度在临界值 ±20% 的标本, 标本的量要充足, 以保证同一份样本能重复测定 20 次 ;(2) 重复测定每个标本 20 次, 计算出每个标本的阴性和阳性百分比 ; (3) 估计的临界值是否准确, 如果准确, 同一份样本重复测定的结果应该有 50% 阳性和 50% 阴性结果 ;(4) 临界值 ±20% 的浓度范围是否位于该实验方法的 95% 区间, 当临界值 +20% 浓度的标本检测阳性率 95%, 且临界值 -20% 浓度的标本检测结果阴性率 95%, 则该浓度范围该方法 95% 区间 ; 此时, 标本浓度在临界值 ±20% 浓度范围之外就能得到稳定的检测结果四统计学方法采用 SPSS17.0 软件进行统计分析用抗 HCVA 值做 ROC 曲线, 计算曲线下面积, 并探讨其最佳临界值即约登指数最大时的 Cut of 值, 且约登指数为敏感性与特异性之和减去 1, 从而确定抗 HCV 诊断价值最大时的 Cut of 值用配对四格表卡方检验探讨 ROC 曲线确定的两种不同酶免分析系统 ELISA 检测抗 HCV 最佳 Cut of 值下的检测结果的差异 P<0.05 为差异有统计学意义

3 828 结果一 RIBA 确认检测结果 RIBA 检测结果为阳性 142 份, 阴性 60 份其中 142 份 RIBA 阳性标本 5 个抗原区条带强度分布情况见表份 RIBA 阳性标本中,Core 蛋白 NS3 蛋白 NS4 1 蛋白 NS4 2 蛋白和 NS5 蛋白阳性的分别有 142 份 141 份 80 份 16 份和 68 份, 其中强度为 2+ 的分别有 125 份 (88%) 121 份 (85%) 61 份 (43%) 9 份 (6%) 和 56 份 (39%), 强度为 1+ 的分别有 17 份 (12%) 20 份 (14%) 19 份 (13%) 7 份 (5%) 和 12 份 (8%) 表份 RIBA 阳性标本 5 个抗原区条带强度分布情况抗原强度 Core NS3 NS4 1 NS4 2 NS5 空白 / 二 ROC 曲线分析结果以 RIBA 检测结果为参照, 绘制两种酶免分析系统不同阳性判断值的 ROC 曲线 addcare ELISA1100 检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为 0.448, 敏感性为 99.3%, 特异性为 96.7%, 约登指数为 0.960,ROC 曲线下面积为 0.998, 见图 1 TECAN+FAME 酶免系统检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为 0.406, 敏感性为 99.3%, 特异性为 96.7%, 约登指数为 0.960,ROC 曲线下面积为 0.998, 见图 2 两种系统不同临界值时的敏感性和特异性见表 4 和表 5 对比两种系统采用 ROC 图 1 addcareelisa1100 检测抗 HCV 的 ROC 曲线图图 2 TECAN+FAME 酶免系统检测抗 HCV 的 ROC 曲线图表 4 addcareelisa1100 不同临界值下的敏感性和特异性临界值敏感性特异性注 : 为最佳 Cut of 值表 5 TECAN+FAME 酶免系统不同临界值下的敏感性和特异性临界值敏感性特异性注 : 为最佳 Cut of 值

4 检验医学 2014 年 8 月第 29 卷第 8 期 LaboratoryMedicine,August2014,Vol29.No 曲线确定的最佳 Cut of 值下的抗 HCV 检测结果, 差异无统计学意义 (P=1.000) 见表 6 表 6 两种系统检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值下的检测结果 ( 例 ) TECAN+FAME addcareelisa 酶免系统合计合计注 :addcareelisa1100 和 TECAN+FAME 酶免系统最佳 Cut of 值分别为三 Cut of 值的验证结果 addcareelisa1100 检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为一个 A 值约为的标本重复测定 20 次获得 50% 阳性结果和 50% 阴性结果一个 A 值约为 0.538( 临界值 +20%) 的标本重复测定 20 次获得的阳性率为 95% 一个 A 值约为 0.358( 临界值 -20%) 的标本重复测定 20 次获得的阴性率为 100% TECAN+FAME 酶免系统检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为一个 A 值约为的标本重复测定 20 次获得 50% 阳性结果和 50% 阴性结果一个 A 值约为 0.487( 临界值 +20%) 的标本重复测定 20 次获得的阳性率为 95% 一个 A 值约为 0.325( 临界值 -20%) 的标本重复测定 20 次获得的阴性率为 100% 讨论 ELISA 是目前临床检验中应用较为广泛的一种检测方法, 其判断测定结果的依据主要依靠所谓的阳性判断值, 即 Cut of 值虽然各厂家生产的 ELISA 试剂盒均提供 Cut of 值的计算方法, 但不同批试剂盒使用相同 Cut of 值多年使用同一 Cut of 值的现象普遍存在, 这显然存在不合理性由于试剂盒生产工艺的不均一性, 各批试剂盒的反应效果不尽相同, 所得的 Cut of 值应当不同此外, 环境温度加样体积误差洗板效果等方面均是影响 ELISA 检测性能的因素为此, 各实验室需自行设定并计算适合本实验室的 Cut of 值 [5] 本研究中的两种系统 (addcareelisa1100 和 TECAN+FAME 酶免系统 ) 虽然使用同一种抗 HCV 诊断试剂盒, 但是 addcareelisa1100 是加样后处理一体机, 有 2 个工作舱 ( 前后舱自动转板, 避免污染 ) 和 3 台独立洗板机 ( 前后舱均可使用, 每台洗板机均为 96 针洗板头, 洗板强度大效果好 ), 开放操作 ( 易受环境温度干扰 );TECAN +FAME 酶免系统是 TECAN 加样系统和 FAME 后处理系统组合的酶免分析系统, 人为转板, 易污染,2 台洗板机 ( 每台洗板机均为 24 针洗板头, 洗板效果较差 ), 后处理机内部操作 ( 受环境温度干扰小 ) 针对以上不同点, 本实验室有必要分别确定两种系统 ELISA 各自的检测抗 HCV 的 Cut of 值 Cut of 值的设定方法一般有标准差比率测定标本对阴性比值以阴性对照均值 ±2s 或 3s 百分位数法双质控 ROC 曲线等 [4] 不同的方法设定的 Cut of 值有一定的差异, 但都要综合考虑假阳性率和假阴性率在各种 Cut of 值的计算方法中,ROC 曲线法已得到了实验室的认可 [6] 该方法考虑了每一个可能的 Cut of 值, 因而能够更客观地评价诊断试验的诊断价值和确定最佳临界值本研究通过 ROC 曲线确定 addcareelisa 1100 检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为 0.448, 敏感性为 99.3%, 特异性为 96.7%, 约登指数为 0.960,ROC 曲线下面积为 0.998;TECAN+FAME 酶免系统检测抗 HCV 的最佳 Cut of 值为 0.406, 敏感性为 99.3%, 特异性为 96.7%, 约登指数为 0.960,ROC 曲线下面积为伍建宁等研究通过对 5709 份无偿献血者标本的抗 HCVELISA 检测的 A 值的统计和 RIBA 检测, 确认 Cut of 值以为宜, 与本研究所确定的 Cut of 值 (0.448 和 0.406) 相差较大其原因可能有 :(1)Cut of 值的设定方法不同, 伍建宁等的 Cut of 值的设定方法为百分位数法单侧 99%, 本研究 Cut of 值的设定方法为 ROC 曲线法 ;(2) 仪器与试剂不同, 伍建宁等使用 GenesisRSP 200 型全自动标本处理系统加样, 德国 BEPⅢ 全自动酶标仪进行后处理及检测, 本研究分别使用 addcareelisa 1100 和 TECAN + FAME 酶免系统检测, 伍建宁等研究抗 HCV ELISA 测定试剂盒购自厦门新创生物工程公司, 抗 HCV RIBA 3.0SIA 确认试剂盒购自美国 Chiron 公司, 本研究抗 HCVELISA 测定试剂盒和

5 830 抗 HCVRIBA 确认试剂盒均购自同一家公司 ; (3) 标本来源不同, 伍建宁等研究标本来自 5709 份无偿献血者, 本研究标本来自 202 份临床检测者采供血系统血液筛检抗 HCV,Cut of 值的设定应略低于临床抗 HCV 检测, 这对于减少 HCV 的经输血传播具有重要意义抗 HCV 诊断试剂盒说明书上提供的 Cut of 值的计算公式为临界值 = 阴性对照孔 A 均值 ( 不足 0.02 按 0.02 计算 ) 因此通常情况下所计算出的 Cut of 值为 0.140, 与本研究所确定的 Cut of 值 (0.448 和 0.406) 相差较大若按照说明书上提供的 Cut of 值判断阴性和阳性标本, 虽然敏感性较高, 但是特异性较低, 即易出现假阳性再者, 由于 ELISA 方法学上的缺陷, 抗 HCV 检测出现假阳性的原因有 :(1) 高球蛋白血症 [4] ; (2) 类风湿因子 (RF) 的干扰, 如血清或血浆标本中存在 RF, 则其可与固相上的 IgG 和酶标记的 IgG 结合, 从而出现假阳性反应 ;(3) 标本中超氧化物歧化酶的干扰 ;(4) 用于固相包被的 HCV 基因工程抗原不纯 [8] ;(5) 试剂保存运输等环节的影响 [9] 因此会增加临床抗 HCV 检测的误诊率若按照本研究确定的 Cut of 值判断阴性和阳性标本, 虽然敏感性降低, 但是特异性升高, 即易出现假阴性抗 HCV 检测出现假阴性的原因有 : (1)HCV 感染后到抗体的出现有一个较长的窗口期 ( 平均为 6~12 周 ) [10] ;(2)HCV 感染的其它阶段因此会提高临床抗 HCV 检测的漏诊率 ELISA 技术本身在 Cut of 值的设置上存在局限性, 也就是说在 Cut of 值周围一定区域内, 测定结果难以明确判断是阴性还是阳性, 即所谓的灰区, 而这个灰区到底有多大, 在国内使用的 ELISA 试剂盒中均无说明这种一刀切的判断方式所得到的结果存在假阴性的可能综上所述, 虽然从理论上而言,ROC 曲线是设定 Cut of 值的最佳方法, 但是由于 ELISA 测定通常有较大的变异, 其每次测定的 Cut of 值都会有所差异, 因此需要控制 Cut of 值的批间变异, 但在实际应用中有一定的局限性 [3] 因此, 综合抗 HCV 诊断试剂盒说明书上提供的 Cut of 值 (0.140) 和经 ROC 曲线确定的两种系统的 Cut of 值 (0.448 和 0.406) 的诊断性能, 将本实验室 addcareelisa1100 和 TECAN+FAME 酶免系统检测抗 HCV 的灰区分别设定为 0.140~0.448 和 0.140~0.406 对于 ELISA 检测抗 HCV 中的灰区结果, 最好采用较为敏感和特异的方法进行复检, 以免误诊和漏诊有条件的实验室可以用确认试验对结果进行确认参考文献 [1] 王晓艳, 伊瑶, 陈斯勇, 等. 丙型肝炎病毒的病毒学检测方法 [J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2011,25(2): [2] 马文昭. 丙型肝炎病毒抗体的检测及临床意义 [J]. 中国现代医生,2008,46(13):159. [3] 康炜, 辛娜, 尤涛, 等.ROC 曲线对 ELISA 法检测 HBsAg 阳性判断值的确定及应用评价 [J]. 现代检验医学杂志,2010,25(6): [4] 李金明. 临床酶免疫测定技术 [M]. 北京 : 人民军医出版社,2005:104. [5] 凌月明, 杜丕波, 黄伟, 等. 应用 ROC 曲线分析确定乙肝表面抗原 cut of 值 [J]. 实用医技杂志, 2006,13(14): [6] GalD,NielsenK.Comparisonofsomemethodsfor determiningcutofvaluesforserologicalasays:a retrospectivestudyusingthefluorescencepolarization asay[j].jimmunoasayimmunochem,2001,22 (2): 伍建宁, 刘志泉. 采供血系统 ELISA 筛检丙型肝炎病毒抗体阳性判断值的设定及意义 [J]. 检验医学,2007,22(3): [8] WangTY,KuoHT,ChenLC,etal. Useof polymerasechain reaction forearly detection and managementof hepatitis C virus infection after needlestickinjury[j].annclinlabsci,2002,32 (2): [9] 傅立强, 桑列勇, 蒋国瑾.ELISA 试剂检测抗 HCV 反应性结果分析 [J]. 检验医学,2012,27(7): [10] 谢立, 黄德庄, 时洪波, 等. 用酶联免疫夹心法测定肝炎患者血清丙型肝炎抗原 [J]. 中华检验医学杂志,2005,28(11): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 )

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人