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1 第 36 卷第 3 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2014 年 3 月 Vol.36 No.3 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Mar 文章编号 : (2014) 犬源空肠弯曲杆菌的分离鉴定及药敏试验 封海波 1, 樊静 2, 刘娟 1, 宋振辉 1 1. 西南大学 ( 荣昌校区 ) 动物医学系, 重庆荣昌 ;2. 四川抗菌素工业研究所, 成都 摘要 : 空肠弯曲杆菌是一种分布十分广泛的人畜共患病原菌, 能随粪便排出体外. 本研究随机采集了病犬的血便 8 份, 进行该病原菌的分离 鉴定, 结果分离到 3 株, 检出率为 37.5%. 药敏试验显示该菌对头孢哌酮 头孢曲松 庆大霉素 洛美沙星 氟哌酸敏感, 对阿莫西林 头孢唑啉氨苄西林中等敏感, 对复方新诺明 林可霉素等耐药. 关键词 : 犬血便 ; 空肠弯曲杆菌 ; 分离 ; 鉴定 ; 药敏试验中图分类号 :S 文献标志码 :A 空肠弯曲杆菌为一群微需氧的革兰氏阴性弯曲样或螺杆样细菌, 广泛存在于畜禽的肠道 生殖道及 口腔中.1931 年国外学者首先从腹泻牛的粪便中分离到空肠弯曲杆菌 [1], 此后国内外陆续从猪 牛 羊 犬 猫等 30 多种动物体中检出.20 世纪 70 年代初期, 比利时和英国学者先后证实该菌能引起人的 急性腹泻, 我国学者从 20 世纪 80 年代开始对空肠弯杆菌进行研究, 均证实该菌是人和动物急性腹泻常 [2] 见和重要的病原菌. 在目前的犬病临床上腹泻病例很常见, 但人们往往只注重病毒的检测和预防, 而 忽视细菌的感染和致病作用. 为了探讨犬血便中空肠弯曲杆菌的感染情况及其对药物的敏感性, 本课题 组进行了相关研究. 1 材料和方法 1.1 主要仪器和试剂样本及来源 : 在重庆市部分动物医院门诊部采集 8 例犬腹泻粪便, 取样后 2h 内进行细菌的分离培养. [3] 主要试剂 : 布氏血琼脂, 麦康凯培养基, 联合抗生素 (TMP 万古霉素 多粘菌素 B) 及抗生素药敏纸片 ( 购于成都博科生物试剂有限公司 ); 革兰氏染色试剂 各种生化试剂及生化微量反应管 ( 购于杭州天和微生物试剂有限公司 ). 微需氧培养设备 : 大体积干燥皿, 蜡烛, 凡士林, 焦性没食子酸和无水碳酸钠. 1.2 细菌的分离培养将采集犬粪便样品先以 0.65μm 的微孔滤膜过滤, 然后取滤液用无菌棉拭子蘸取稀释液在布氏血琼脂培养基平板上涂匀, 在 37 培养箱中静置 2min 后置于加入焦性没食子酸和无水碳酸钠的厌氧罐中 37 1 收稿日期 : 基金项目 : 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 (XDJK2013C136); 中央高校基本科研业务费博士启动项目 (SWU113091); 国家自然科学基金面上项目资助 ( ). 作者简介 : 封海波 (1981 ), 男, 内蒙古赤峰人, 博士研究生, 讲师, 主要从事临床兽医学研究. 通信作者 : 刘娟, 教授.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 36 卷 培养 24h [1,4]. 用接菌针挑取少量样品接至 1.5 ml 改良布氏肉汤, 微需氧 (5% O2,5% CO2,85% N2), 42 培养 24h. 1.3 细菌的鉴定 [1,5] 形态学及染色特性试验观察在布氏血琼脂培养基平板上培养 1~3d 后长出的菌落形态, 革兰氏染 [3] 色后镜检. 用压滴法检查分离物的运动性. 培养特性试验将布氏血琼脂培养基平板上的菌落纯化后分别接种麦康凯琼脂培养基 普通营养琼脂培 养基和血琼脂培养基后, 于 37 培养 24~48h, 观察并记录实验结果. 生化试验首先进行氧化酶和过氧化氢酶试验, 若为阳性则在微需氧环境中进行以下试验 :3.5% 氯化 钠的耐受性试验 42 和 25 生长试验 硝酸盐还原试验 糖类代谢试验 柠檬酸盐试验 TSI 试验. 病原鉴定按 伯杰氏细菌鉴定手册 第 8 版的方法 [6], 及法国生物梅里埃 (APt) 细菌鉴定方法执行. 将 纯培养菌分别接种于生化反应管 微量发酵管及 AP120E 反应管,37 培养一定时间, 按说明进行判定. 1.4 动物试验 用生理盐水将血平板上的培养物洗下, 混匀, 稀释成体积单位约 CFU/mL, 接种 2 月龄幼犬, 每只 5mL 口服, 同时分别以生理盐水作为对照. 记录发病及死亡情况. 1.5 药物敏感性试验 用 K-B 法做药敏试验 [3], 用灭菌棉拭子将布氏肉汤培养物涂布于布氏血琼脂培养基平板. 将选用 的药敏纸片分别贴于布氏血琼脂培养基平板表面, 于微需氧条件下 37 培养 48h, 观察结果并测量 抑菌圈直径. 2 结果 例血便样品分离结果 ( 表 1) 表 1 犬血便的空肠弯杆菌检测结果 编 号 CQR-1 CQR-2 CQR-3 CQR-4 CQR-5 CQR-6 CQR-7 CQR-8 品种 京巴 喜乐蒂 小鹿犬 金毛犬 博美犬 吉娃娃 杂交犬 昆明犬 年龄 2 月 3 月 1 岁 2 月 2 岁 2 月 8 月 3 月龄 分离结果 注 : + 为阳性 ; 为阴性. 2.2 细菌的分离及培养特性 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 培养物在布氏血琼脂培养基平板上长出 2 种类型的可疑菌落. 一种为针尖大 小圆形 隆起 边缘光滑 灰白色 半透明和不溶血的菌落 ; 另一种为低平 边缘不整齐 灰白色半透明的 菌落, 菌落常沿划线方向扩散, 并趋于密集融合生长. 运动性检查发现 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 有活动 性, 染色镜检呈革兰氏阴性弯曲样杆状, 两个形成短链时呈特征性的 S 形和 海鸥展翅 形. 培养特性实验将布氏血琼脂培养基平板上的菌落纯化后, 分别接种麦康凯琼脂培养基 普通营养琼脂 培养基和血琼脂培养基, 于 37 培养 24~48h, 结果在血琼脂培养基平板 普通营养琼脂培养基平板上可 见到典型的菌落形态,CQR-1 和 CQR-8 在麦康凯上微弱生长,CQR-6 在麦康凯上不生长. 根据分离菌株 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 的形态特性和培养特性疑似空肠弯曲杆菌. 2.3 生化试验 取 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 的新鲜培养物进行生化试验 ( 表 2). 根据分离菌株 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 的形态特性 染色特性 培养特性和生化特性确定为空肠 弯曲杆菌.

3 第 3 期 封海波, 等 : 犬源空肠弯曲杆菌的分离鉴定及药敏试验 3 表 2 分离菌的主要生化特征 生化项目 菌株菌株生化项目 CQR-1 CQR-6 CQR-8 CQR-1 CQR-6 CQR-8 触酶 CATALASE 阿拉伯糖 ARA 硫化氢 H2S 甘露糖 MNE 柠檬酸盐 CIR % NaCl 中生长 氧化酶活性 OX % 甘氨酸中生长 硝酸盐还原 NIT 马尿酸盐水解 HIP 葡萄糖 GLU 培养 半乳糖 GAL 培养 鼠李糖 RHA 培养 棉籽糖 RAF 动物实验结果 感染犬在接种后 8h 发病,48h 内出现死亡, 未死亡者也表现出精神沉郁, 呕吐, 稀便中含有血液, 有 发热现象, 死亡犬剖检均发现空肠 回肠 结肠有大量出血点. 在发病及死亡的幼犬粪便中分离到与接种 菌类似的细菌, 其生长特性和生化特性与接种菌相同 ( 表 3). 表 3 分离菌的动物发病试验结果 菌别 动物品种 动物数 犬体质量 /kg 接种量 死亡率 CQR-1 犬 /5 CQR-6 犬 /5 CQR-8 犬 /5 2.5 药敏试验 根据药敏纸片的判定标准, 判定空肠弯曲杆菌分离株 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 均对头孢哌酮 头孢曲 松 庆大霉素 洛美沙星 氟哌酸 环丙沙星 利福平高度敏感 ; 对阿莫西林 氨苄西林 头孢唑林 头孢他 啶 卡那霉素 氧氟沙星中等敏感, 对复方新诺明 磺胺间甲氧嘧啶 林可霉素 红霉素 甲硝唑耐药. 此 外,CQR-6 菌株对氨苄西林耐药,CQR-8 菌株对恩诺沙星耐药 ( 表 4). 表 4 药敏试验结果 ( 抑菌圈直径 /mm) 药敏片名 含量 /( μg 片 -1 IU 片 -1 ) 菌 CQR-1 CQR-6 CQR-8 阿莫西林 AMO 氨苄青霉素 AMP 头孢唑啉 CEF-V 头孢他啶 CAZ 头孢哌酮 CFP 头孢曲松 CRO 复方新诺明 SMZco 磺胺间甲氧嘧啶 SMM 庆大霉素 CEN 丁胺卡那霉素 AKN 林可霉素 LI 红霉素 ERY 卡那霉素 KAN 氧氟沙星 OFL 诺美沙星 LOM 恩诺沙星 EN 氟哌酸 NOR 环丙沙星 EIF 泰乐菌素 TYL 利福平 RFA 甲硝唑 MTR 株

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 36 卷 3 讨论 1) 本研究用烛缸法从 8 例犬血便中成功分离出了 3 株空肠弯曲杆菌, 检出率为 37.5%. 本次烛缸 [7] [8] 法试验显示该菌的生长时间在 48h 左右, 与刘岗等和孔繁林等的研究结果一致. 各地报道的空肠 弯曲杆菌感染率有明显差异. 总的来说, 健康鸡 鸭的检出率 65% 左右大于健康猪的检出率 (50% 左 右 ), 大于健康牛的检出率 (10% 左右 ), 大于健康人的检出率 (5% 以下 ) [8-11] ; 幼龄动物的感染率大于成 [12] 年动物的感染率. 2) 空肠弯曲杆菌分离株 CQR-1,CQR-6 和 CQR-8 对头孢类 青霉素类和喹诺酮类的部分药物敏感, [9,12] 对磺胺类 林可酰胺类耐药. 研究显示各地菌株的药敏性存在很大差异. 近年来临床上出现了不少 耐药株, 有研究报道动物的耐药株比率要小于人的耐药株 [13], 有的研究报道红霉素和庆大霉素仍为治 [12] 疗空肠弯曲菌腹泻的首选药物. 在本试验中 3 株分离菌均对磺胺类 大环内酯类耐药, 其中 1 株对氨 苄西林耐药. 可见不同地区菌株的药敏性差异明显, 临床上对该病的治疗建议使用当地菌株的高敏药物 以达到快速治疗的目的. 由于长期使用固定的抗生素容易使细菌产生耐药性, 在治疗时可以考虑与其他 抗生素交替使用. 3) 大量研究表明空肠弯曲杆菌与腹泻 吉兰 巴雷综合征 反应性关节炎等疾病相关, 可并发赖特尔 综合征 ( 尿道 眼 关节综合症 ) [13], 对人类健康构成很大威胁. 近年来空肠弯曲杆菌性肠炎被定为全球新 出现的主要传染病之一 [14], 患病或带菌的畜禽是此病的主要传染源, 可以通过直接接触和污染环境使人类 致病. 有报道称农村人口的空肠弯曲杆菌带菌率 ( 成人为 1.3%, 儿童为 3.0%) 远高于城市人群 ( 成人为 0.6%, 儿童为 1.4%) [15], 饲养宠物的人群带菌率 (11.24%) 大于未饲养宠物的人群 (4.14%), 跟畜禽的接 [16-17] 触频率是导致这种现象出现的重要原因之一. 本实验从发生腹泻的宠物犬粪便中所分离的 3 株菌均 具有致病力, 因此临床对犬腹泻病例的诊断应考虑是否由空肠弯曲杆菌引起或与其他致病原并发感染. 鉴 于该菌对人的健康也有潜在威胁, 建议养犬的家庭要随时注意犬的健康状况, 有病及时就诊, 定期对环境 进行消毒, 避免与犬太过亲密接触, 特别是幼儿. 参考文献 : [1] 杨正时, 房 海. 人及动物病原细菌学 [M]. 石家庄 : 河北科学技术出版社,2003: [2] 谭立志, 詹利生, 赵绮霞, 等. 空肠弯曲菌感染及其药物敏感性研究 [J]. 衡阳医学院学报,1991,19(2): [3] 中国农业科学院, 哈尔滨兽医研究所. 兽医微生物学 [M]. 北京 : 中国农业出版社,1982: [4] 姚火春. 兽医微生物学实验指导 [M]. 北京 : 中国农业出版社,2002: [5] 张万芹, 康冀川, 王开功.35 株产甲烷细菌的产气效能研究 [J]. 西南师范大学学报, 自然科学版,2011,36(4): [6] 布坎南 RE, 吉本斯 N E. 伯杰氏细菌鉴定手册第八版 [M]. 北京 : 科学出版社,1984: [7] 刘 岗, 史彩霞, 吴 润. 禽空肠弯杆菌分离培养的影响因素 [J]. 中国兽医科技,2002,32(10):9-13. [8] 孔繁林, 朱 江. 玉溪市腹泻患者空肠弯曲菌检测结果分析 [J]. 云南医药,1981,5: [9] 战师珍, 李国新, 石恩禄, 等. 天津市人 畜 禽空肠弯曲杆菌感染的流行病学调查 [J]. 天津医药,1990,7: [10] 孟佩云, 武应学, 周朝益, 等. 调查报告空肠弯曲菌肠炎的调查 [J]. 云南部队医药,1990,9: [11] 周英顺, 王红宁, 杨 鑫. 规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征感染混合细菌研究 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2011, 33(4): [12] 卢 玲, 郁庆福. 不同来源的空肠弯曲菌对 20 种抗生素敏感性调查 [J]. 中国人兽公患病杂志,1990,6(3): [13] 肖 政, 孙万邦, 姚新生. 空肠弯曲菌相关疾病的研究进展 [J]. 国外医学儿科学分册,2003,,30(2):71-73.

5 第 3 期 封海波, 等 : 犬源空肠弯曲杆菌的分离鉴定及药敏试验 5 [14] 程玉兰, 候培森, 田本淳. 全球新出现的主要传染病及其流行特点 [J]. 中国健康教育,2003,19: [15] 刘正学, 刘云峰, 李德舜. 几株城市污水优势降解细菌的初步鉴定 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2007,29(3): [16] 吴润, 刘岗, 余世红. 人和畜禽的空肠弯杆菌分离培养及带菌状况调查 [J]. 中国兽医科技,2000,30(1): [17] 李林双. 细菌 F 质粒转移实验的有效方法的研究 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版,1989,14(2): IsolationandIdentificationofCampylobacterjejuni from CanineandItsAntimicrobialSusceptibility FENG Haiḇo 1, FAN Jing 2, LIU Juan 1, SONGZheṉhui 1 1. DepartmentofVeterinaryMedicine,SouthwestUniversity (RongchangCanpus),Chongqing402460,China; 2.SichuanIndustrialInstituteofAntibiotics,Chengdu610052,China Abstract:Campylobacterjejuniisakindofpathogenicbacteriaofzoonosis,whicharewidespreadinanimals,andcanbeevacuatedwithdejecta.Inastudyreportedinthispaper,threestrainsofC.jejuniwere isolatedandidentifiedfromeightbloodystools,whichweresampledrandomlyfromiḻdogs.theisolating ratewas37.5%.asusceptibilitytestshowedthatthebacteriaweresensitivetocefoperazone,ceftriaxone,gentamicin,lomefloxacinandnorfloxacin,moderatelysensitivetoamoxicilin,cephazolinandampicilin,andtoleranttotrimethoprim-sulfamethoxazoleandlincomycin. Keywords:caninebloodystool;Campylobacterjejuni;isolation ;identification;susceptibilitytest 责任编辑夏娟

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 36 卷

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