5月14期

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1 中国农学通报 0,8():009 Chinese Agricultural Science Bulletin 猪 Ⅱ 型链球菌分离鉴定与药敏试验, 魏静元, 刘丽丽, 张巧灵 ( 辽宁省分析科学研究院, 沈阳 00; 辽宁省技术标准工程技术研究中心, 沈阳 00; 铁岭市动物疫病预防控制中心, 辽宁铁岭 000; 吉林大学畜牧兽医学院, 长春 00) 摘要 : 自某市猪场采集的病料中分离出了 株猪链球菌, 进行血清型鉴定及毒力 耐药性研究 通过细菌分离培养 生化试验 PCR 试验及耐药性对分离菌进行试验 鉴定此 株全为链球菌, 其中 株为猪链球菌 型 对 株猪链球菌 型进行小鼠毒力试验及药敏试验, 结果表明 : 分离的 株猪链球菌 型对小鼠均有毒力, 分离菌株对万古霉素 利福平 氨苄西林 头孢拉定高度敏感, 对复方新诺明 红霉素 卡那霉素 克林霉素 链霉素 强力霉素 青霉素 G 四环素 新霉素耐药 关键词 : 猪链球菌 ; 分离鉴定 ; 药敏试验 ;PCR 中图分类号 :S8.6 文献标志码 :A 论文编号 :0066 Isolation and Identification of Streptococcus Suis serotypes and Susceptibility Test Wei Jingyuan,, Liu Lili, Zhang Qiaoling ( Liaoning Province Academy of Analytic Science, Shenyang 00; Liaoning Province Engineering Research Center for Technology Standard;Shenyang 00; Tieling City Center for Animal Disease Control and Prevention, Tieling Liaoning 000; College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 006) Abstract: strains of Streptococcus suis were isolated from patients in a farm somewhere. These strains were identified by culture characteristics biochemical test, PCR analysis. The results showed that the strains were all Streptococcus suis and strains were SS. Mice virulence and drug susceptibility test result s showed that these SS strains were lethal to mice and highly sensitive to Vancomycin, rifampin, ampicillin and cephradine. Key words:streptococcus suis; isolation and identification; drug sensitivity test; PCR 0 引言猪链球菌 (Streptococcus suis,ss) 是重要的人畜共患病病原, 在世界范围内广泛流行, 有 Ⅰ Ⅱ 两个型, 其中以 Ⅱ 型猪链球菌 (SS) 流行最广, 危害最严重, 可引起大多数动物和人的败血症 脑膜炎 心内膜炎 关节炎及突发性死亡,SS 可通过创口感染人, 引起链球菌 [] 中毒性休克综合征和链球菌脑膜炎综合征 00 年 6 月下旬, 四川资阳等地发生 SS 疫情, 死亡猪 67 头 此次疫情中人感染病例 0 例, 死亡 8 例, 是迄今 [6] 为止发生的全球最大的一次猪链球菌病 采集长春 某大型猪场的病 死猪病料, 进行细菌分离, 分离出了 株猪链球菌 经细菌分离培养 生化试验 PCR 试验, 鉴定 株全为链球菌, 其中 株为猪链球菌 型 对 株猪链球菌 型进行小鼠毒力试验及药敏试验, 结果表明 : 分离的 株猪链球菌 型对小鼠均有毒力, 分离菌株对万古霉素 利福平 氨苄西林 头孢拉定高度敏感, 对阿莫西林 氟哌酸 环丙沙星 罗红霉素 黏杆菌素 庆大霉素 乳酸诺氟沙星 壮观霉素中度敏感, 对复方新诺明 红霉素 卡那霉素 克林霉素 链霉素 氯霉素 强力霉素 青霉素 G 四环素 新霉素耐药 基金项目 : 国家自然科学基金 (09770); 科学前沿与交叉学科创新项目 (00907) 第一作者简介 : 魏静元, 男,97 年出生, 辽宁铁岭人, 助理研究员, 博士 研究方向为生物分析与比较医学 通信地址 :00 辽宁省沈阳市万柳塘路 0 号辽宁省分析科学研究院, abc88@yahoo.com.cn 收稿日期 :00, 修回日期 :0009

2 06 中国农学通报 材料. 病料采自长春市某猪场疑似链球病死猪的肝 脾 肺 心血 肾 心包液和关节囊液 ( 关节炎型 ). 主要试剂及仪器改良马丁培养基购自南京一基生化科技有限公司 Rapid ID STREP 试条购自长春宝泰克公司, 参考菌株 ATCC969( 猪链球菌 ) ATCC9( 大肠杆菌 ) 购自中国药品生物制品鉴定所, 猪链球菌 Ⅱ 型 99 株来自军事医学科学院军事兽医研究所 青霉素钾等 种药敏纸片分别购自上海卫生技术服务公司生物试剂所和上海伊华医学科技有限公司 普通琼脂平板 鲜血琼脂平板 血清肉汤培养基按常规方法制 [7] 备 Taq plus mix 购自天根公司. 实验动物 6~0 g 健康小白鼠 0 只 ( 吉林大学实验动物中心提供 ) 方法. 细菌的分离.. 直接涂片镜检形态结构 染色特性与运动性无菌条件下, 将所采病料分别涂片 ( 心血涂片, 脾 肝 肺 淋巴结等组织脏器触片或涂片 ), 干燥, 固定, 革兰氏染色, 镜检, 观察其形态特征.. 细菌的分离培养无菌采取病料于鲜血琼脂平板上划线分离,7 需氧培养 h, 挑取平板上单个菌落作纯培养 单个菌落经涂片 染色 镜检, 证实为纯培养物, 贮存备用. 细菌形态及生化鉴定.. Rapid ID STREP 试条对链球菌的快速鉴定将疑似菌株接种于 Rapid ID STREP 试条上,7 培养 h 后分别加入 VPA VPB FB 和 NIN 试剂, min 后立即在 ATB 细菌鉴定仪上读取结果.. 培养特性试验分离菌接种于血清肉汤 普通琼脂平板 鲜血琼脂平板和麦康凯琼脂平板等培养基中,7 有氧培养观察其生长表现 同时另一组置于厌氧罐中 [8] 7 培养观察.. 生化试验分离菌经 h 鲜血琼脂平板纯培养后, 得到的纯培养物进行糖发酵试验及其他生化试验 蔗糖 山梨醇 乳糖 棉实糖 菊糖 葡萄糖 水杨苷 麦芽糖 木糖 肝糖 肌醇 鼠李糖 硫化氢,0.% 美兰牛乳,6.% 氯化钠, 淀粉, 甘油, 明胶, 马尿酸钠和 VP 试验.. 玻片凝集试验取经 Rapid ID STREP 试条鉴定为猪链球菌的分离株的 h 的血清肉汤培养物菌 体, 结晶紫染色, 常规方法用猪链球菌 Ⅱ 型标准阳性血 清作玻片凝集试验, 同时设立细菌悬液对照及血清对 照.. 溶血试验平板法 : 将菌株接种于含有 % 兔鲜血 琼脂平板,7 培养 h, 菌落周围出现明显溶血环者 视为溶血阳性 接种法 : 将菌株接种于血清马丁肉汤, 7 培养 h, 取 0 μl 菌液倍比稀释于 96 孔微量滴 定板上后与等体积 % 兔红细胞混合,7 培养, h 后 观察结果 [90] [] []..6 PCR 鉴定参照 Okwumabua 等 Smith 等和 徐引弟 [] 的方法, 根据猪链球菌 gdh 基因 (No. AF968) 序列和猪链球菌 Ⅱ 型 cpsj 基因 (No. AF889) 序列分别设计引物 (gdh 基因 : 上游引物 ' GCAGCGTATTCTGTCAAACG', 下游引物 ' CCATGGACAGATAAAGATGG', 扩增目的片段长 度 : 689 bp; cpsj 基因 : 上游引物 ' TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG', 下游引物 ' GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG', 扩增目的片 段长度 :7 bp), 引物由深圳华大公司合成 PCR 反 应体系采用天根 Taq plus 酶 反应条件 :9, min;9,0 s;9, min;7, s; 个循环 ; 最 后 7 延伸 min,pcr 产物经. 0% 琼脂糖凝胶电泳 检测 PCR 产物回收后测序..7 小白鼠致病性试验 0 只小白鼠, 随机分 6 组, 每 组 只 组为试验组, 组为对照组 试验前小白鼠 均饲养 天以证实健康方可使用 试验组和对照组小 白鼠腹腔分别接种分离菌血清肉汤培养物和血清肉 汤, 皆为 0. ml 各组注射后的小白鼠隔离饲养, 观 察小鼠的发病及死亡情况, 对死亡的小白鼠的肝 脾等 病变实质脏器进行细菌分离..8 药敏试验按美国临床实验室标准化委员会标 准, 采用纸片扩散法做药敏试验 药敏纸片包括阿莫 西林等 种常用抗生素药物 抑菌圈直径 <0 mm 为 耐药,0~ mm 为中度敏感,> mm 为高度敏感 结果与分析. 细菌鉴定.. 直接涂片镜检 革兰氏染色后镜检, 呈见单个 成双或长短不等 短链状排列的革兰氏阳性球菌, 近圆形或卵圆形, 链的 长短不等 ; 心血涂片中均见有呈单个 成双或长短不等 短链状排列的革兰氏阳性球菌 姬姆萨染色均未见荚 膜.. 细菌分离培养 菌体呈圆形 双球形或短链状, 液体培养物中多呈

3 魏静元等 : 猪 Ⅱ 型链球菌分离鉴定与药敏试验 07 长链状, 多由 8~ 个球菌排成链状, 无鞭毛, 不运动, 无荚膜, 无芽胞, 无粘液层, 无两极着色现象 将其涂片镜检, 同样可看到革兰氏阳性菌. 细菌形态及生化鉴定.. Rapid ID STREP 试条对链球菌的快速鉴定经 ATB 细菌鉴定系统检测 ( 见表 ) 证实所分离的 株细菌均为链球菌.. 培养特性试验分离菌在普通营养琼脂平板上仅在划线处见有灰白色 针尖大小菌落 血清肉汤中呈均匀浑浊生长, 菌膜无形成,8 h 后底部出现沉淀 鲜血琼脂平板 7 培养 h 后即形成表面光滑 圆形凸起 边缘整齐 露珠状小菌落, 颜色灰白, 透明 菌落外层有明显的 β 溶血环 表 分离菌的 Rapid ID STREP 试条检测结果 特性 特性 精氨酸 丙酮酸盐 葡萄糖 丙氨酸 APPA 半乳糖苷酶 半乳糖 葡萄糖酸酶 吡咯酮烷芳香胺酶 a 半乳糖 N 乙酰葡萄糖胺酶 碱性磷酸酶 甘氨酰 色氨酸酶 核糖 马尿酸盐 糖原 山梨醇 芽霉菌糖 乳糖 麦芽糖 海藻糖 蜜二糖 棉子糖 松三糖 蔗糖 甲基吡喃葡萄糖苷 L 阿拉伯糖 塔格糖产酸 D 阿拉伯糖醇 B 环糊精 脲酶 注 : 表示阳性, 表示阴性, 表示可疑.. 生化试验由表 可知, 待检分离菌株都能发酵葡萄糖 乳糖 麦芽糖 蔗糖 淀粉, 不能利用 6.%NaCl 甘露糖 山梨糖 肝糖 肌醇 木糖 阿拉伯糖, 与标准菌株相比具有典型的猪链球菌的生化特性, 因此可以确定其均为猪链球菌.. 玻片凝集试验将细菌悬液与各分型抗血清混合, 可立即见到明显的凝集现象, 但不与 Ⅰ 型及其他型抗血清出现凝集 阴性对照均未见凝集现象.. 溶血试验 种方法检测结果显示, 分离菌株皆表现溶血性..6 PCR 鉴定结果见图 凝胶图像所示目的片段大小与预期大小均一致,PCR 产物测序结果与猪链球菌 gdh 基因 序列和猪链球菌 Ⅱ 型 cpsj 基因序列同源性达 00% ( 序列比对略 )..7 小白鼠致病性试验感染 h 后小白鼠于开始死亡, 至 6 h 全部死亡 剖检见胸腔积液, 肾 脾和肝肿大, 心冠脂肪出血 以胸积液及心血涂片, 革兰氏染色镜检, 发现有大量革兰氏阳性球菌, 单个 成对或 ~8 个的短链分布 对照组小白鼠未见异常..8 药敏试验分离菌株对万古霉素 利福平 氨苄西林 头孢拉定高度敏感, 对阿莫西林 氟哌酸 环丙沙星 罗红霉素 黏杆菌素 庆大霉素 乳酸诺氟沙星 壮观霉素中度敏感, 对复方新诺明 红霉素 卡那霉素 克林霉素 链霉素 氯霉素 强力霉素 青霉素 G 四环 [] 素 新霉素耐药 讨论猪链球菌 (Streptococcus suis) 首次正式报道于

4 08 中国农学通报 表 分离菌生化试验结果 标准 标准 试验项目 菌株 试验项目 菌株 蔗糖 山梨糖 肌醇 乳糖 0.% 美兰牛乳 棉实糖 6.% 氯化钠 菊糖 淀粉 葡萄糖 甘油 麦芽糖 明胶 木糖 VP 试验 肝糖 马尿酸钠 硫化氢 注 : 表示阳性反应, 表示阴性反应 M N W S 表 分离菌的药敏试验结果 0.7 bp 689 bp 药物名称 高敏 试验结果 / 个 (%) 中敏 M 耐药 M S N W 阿莫西林 (80) (0) 氨苄西林 0.6 kb 7 kb 复方新诺明氟哌酸 (0) (80) (00) M:00 bp;marker:s, 标准菌株 ;N, 阴性菌对照 ; W, 水对照 ;, 待测菌株 图 SS( 上图 ) 和 SS( 下图 ) 的 PCR 扩增结果 966 年, 是一种革兰氏阳性 溶血 兼性厌氧的球菌 在血平板上的菌落很小, 直径 ~ mm, 浅灰色或透明, 稍微带粘液样常呈单个或成对出现, 很少形成短链 根据其荚膜多糖抗原的不同, 将其划分为 种血清 [] 型, 即 ~ 和 / 型 ( 同时含有 Ⅰ 型和 Ⅱ 型抗原的菌 株 ) 与疾病最为相关的是猪链球菌 Ⅱ 型, 也是分离频 率最高的血清型 其中,Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅳ 型均可感染人, 因而其也是一种很重要的人畜共患病病原. 猪链球菌 Ⅱ 型荚膜多糖抗原 共有 个 ORF, 分别为 OrfZ OrfY OrfX, 和 cpsacpsk, 是已建立的检测猪链球菌 Ⅱ 型的 PCR 的主要目的基因, 比如 cpsh [6] 和 cpsj [,7] 基因 PCR 鉴定避免了猪链球菌生化鉴定困难的问题 Smith 等 建立的 PCR 方法仍不能明确地区分 Ⅰ 型与 型,Ⅱ 型 与 / 型 Marois 等建立了检测猪链球菌 Ⅱ 型和 / 型的复合 PCR 检测技术, 主要是针对细菌的 6SRNA 序列和 CPS 序列进行检测 Okwumabua 等根据 gdh 红霉素环丙沙星卡那霉素克林霉素链霉素氯霉素利福平罗红霉素黏杆菌素强力霉素青霉素庆大霉素乳酸诺氟沙星四环素头孢拉定万古霉素新霉素壮观霉素 0 (00) (80) (0) 基因的序列, 构建了一种可以扩增猪链球菌的所有血清型的 PCR 检测方法 PCR 技术明显地弥补了生化

5 魏静元等 : 猪 Ⅱ 型链球菌分离鉴定与药敏试验 09 鉴定的不足提高了鉴定效率和准确性. 细菌鉴定本是一项系统 复杂的技术工作商业性的鉴定系统 (ATB,API0) 的使用很大程度上代替了繁琐的手工操作, 提高了工作效率, 但大量的实验表明这些系统不完全适用于猪链球菌的鉴定, 其分辨率有待提高 但完全可以用于初步鉴定, 再辅以进一步的快速鉴定 ( 如 PCR) 则可以达到快速 准确. 由药敏试验结果结合临床治疗情况, 常见抗生素药物对猪链球菌 [8] Ⅱ 型的敏感性正呈下降趋势, 耐药谱扩大, 并呈多重耐药性现象, 主要与滥用药物及用药习惯有关 对于发病猪, 一般不采取治疗的方法, 而是按照兽医部门 猪链球菌病应急防治技术规范 的要求, 进行不放血扑杀处理, 对于同群猪立即进行强制免疫接种或用药物预防, 并隔离观察 天, 必要时对同群猪进行扑杀处理 在治疗早期, 可采用 ~ 种药物试验性治疗, 治疗原则为通过药敏试验, 筛选出敏感药物 在用药干预时应禁止长期使用同一种抗生素药物, 可几种交替 联合使用 参考文献 [] Chanter N,Jones P W,Alexander T J L.Meningitis in pigs caused by streptococcus suis a speculative review[j]. Vet Microbiol, 99,6:9. [] Gottschalk M, Segura M. The pathogenesis of the meningitis caused by Streptococcus suis: the unresolved questions[j]. Vet Microbiol, 000,76:97. [] Arends J P,Zanen H C.M eningitis caused by Streptococcus suis in human[j].rev Infect Dis,988,0:6. [] Mazokopakis E E, Koftericlis D P, Papadakis J A, et al First case report of Streptococcus suis septicaemia and meningitis from Greece. European Journal of Neurology, 00, (6):8789. [] Lopreto C, Lopardo H A, Bardi M C, et al Y M. Primary Streptococcus suis meningitis: first case in humans described in Latin America. Enfermedades Infecciosasy Microbiologia Clinica, 00,():0. [6] 卫生部, 农业部. 四川省猪链球菌病疫情评估报告 (Z).00,8:. [7] 曹澎泽. 兽医微生物学及免疫学技术 [M]. 长春 : 吉林科学技术出版 社,99:68. [8] 廖延雄. 兽医微生物实验诊断手册 [M]. 北京 : 中国农业出版社, 99. [9] Gottschalk M,Lacouture S,Dubreuil J D.Charactionof Streptococcus Suis capsular type haemolysin[j].microbiol,99, :899. [0] Jacobs A.Identification,purification and characterization of a thiolactivated hemolysin of Streptococcus Suis[J].Infect Immun, 99,6():778. [] Okwumabua O,O Connor M,Shull E.A polymerase chain reaction (PCR) assay specific for Streptococcussuis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[j].fems Microbiol Lett, 00,8():798. [] Smith H E,Veenbergen V,van der Velde J,et al.the cps genes of Streptococcus suis serotypes,,and9:development of rapid serotype specific PCR assays[j].j Clin Microbiol,999,7: 6. [] 徐引弟, 王治方, 朱文豪, 等. 河南省规模化猪场猪链球菌 型的分 离鉴定和药敏试验 [J]. 中国畜牧兽医,00,7():7. [] 赵志慧. 猪链球菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因研究 [D]. 哈尔滨 : 东北农业大学,009. [] Higgins R,Gottschalk M,Boudreau M,et al.description of six new capsular types(9) of Streptococcus suis[j]. Vet Invest,99(7) : 006 [6] 姜焱, 张敬友, 王凯民, 等. 猪链球菌 型荚膜基因 PCR 快速检测方 法的建立及试剂盒的研制 [J]. 生物技术通报,006( 增刊 ). [7] 赵战勤, 胡睿铭, 吴斌, 等. 猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研 究 [J]. 畜牧兽医学,007,8():768. [8] Marie J, Morvan H, BerthelotHerault F,et al. Antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from swine in France and from humans in different countries between 996 and 000 [J]. Antimicrob Chemother, 00,0:009.

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