中国畜牧兽医卷禽致病性大肠杆菌 &9 $ %#( #1 ##&,-*) 是导致禽大肠杆菌病的重要病因主要临床表现为急性败血症卵巢炎输卵管炎眼球炎心包炎肝周炎气囊炎脐炎等大肠杆菌病的发病率和死亡率较高每年给世界养禽业带来严重损失作为一种重要的肠外致病性菌可能是人

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河评刁
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1 中国畜牧兽医 0! " # 鸭致病性大肠杆菌分离鉴定及其相关致病性分析邓伯雄刘情邓安元李文文宋志刚余琼陈光芬刘述皇刘亚刚西南民族大学生命科学与技术学院成都西昌市畜牧局西昌西昌市华宁农牧科技有限公司西昌云南大理市畜牧工作站大理摘要为研究鸭大肠杆菌的致病性及相关生物特性本试验从西昌市某规模化鸭场采集病料通过传统分离培养及理化性质鉴定分离得到株鸭致病性大肠杆菌对株鸭致病性大肠杆菌进行血清型鉴定药敏试验相关毒力基因检测血清型鉴定结果显示优势血清型为 0 / 和占分离株 > 血清型 0 占株鸭致病性大肠杆菌的 > 为该鸭场流行的致病血清型对种兽医临床常用药物的药敏试验结果显示株鸭致病性大肠杆菌均对阿米卡星庆大霉素和多黏菌素敏感对头孢曲松等种药物较敏感对利福平等种药物耐受大肠杆菌相关毒力基因检测结果显示! 3&)&, ', 及,, 基因携带率均为 >' 基因携带率 0>$00 基因携带率 > 各项研究结果为有效防控鸭大肠杆菌病提供了重要科学依据并为大肠杆菌深入研究奠定了基础关键词鸭致病性大肠杆菌分离鉴定耐药性致病性中图分类号 / B 文献标识码, 文章编号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收稿日期基金项目国家农业科技成果转化资金项目国家科技部农业项目规模化养鸭场标准化健康养殖技术示范与推广作者简介邓伯雄 00 男广东增城人硕士生研究方向微生物与免疫 *1!" 1131 通信作者刘亚刚 00 男四川成都人博士教授研究方向畜禽传染病与免疫学 *1!( /1

2 中国畜牧兽医卷禽致病性大肠杆菌 &9 $ %#( #1 ##&,-*) 是导致禽大肠杆菌病的重要病因主要临床表现为急性败血症卵巢炎输卵管炎眼球炎心包炎肝周炎气囊炎脐炎等大肠杆菌病的发病率和死亡率较高每年给世界养禽业带来严重损失作为一种重要的肠外致病性菌可能是人尿道源致病性大肠杆菌 "'9 $ %# ( # ##& -*) 和新生儿脑膜炎大肠杆菌 #$!1#%$ ( # ##&*) 的潜在贮藏体可见禽类是人源肠外致病性大肠杆菌 #:$'$# $!9 $ %#( # ##&*:-*) 的一个传播媒介因此加强中国禽致病性大肠杆菌的防制和监控对养禽业发展及公共卫生安全具有重要意义本研究通过采集西昌市某规模化养鸭场的病料分离鉴定出株鸭大肠杆菌通过血清型鉴定药敏试验毒力基因检测为有效防制大肠杆菌病提供科学依据材料与方法, 病料及菌株具有典型病变的内脏器官参考菌株为 ) )) 00 B B B 大肠杆菌 7 株 83", B '9 B 81) B 9 9, B B 株均由西南民族大学动物医学四川省重点实验室保存, 主要试剂麦康凯琼脂培养基 5 培养基伊红美蓝培养基 ( 培养基均购自英国 : 公司三糖铁培养基肠杆菌科细菌微量生化鉴定管均购自杭州微生物试剂有限公司 C 2 -) $#' : +(+, ' #' 均购自天根生化科技北京有限公司核酸染料琼脂糖均购自公司肠道致病性大肠杆菌抗原血清购自宁波天润生物有限公司, 分离鉴定无菌取病死鸭肝脏心脏等内脏器官接种于麦康凯琼脂培养基? 培养 / 挑选粉红色边缘光滑的疑似大肠杆菌进行革兰氏染色镜检将符合大肠杆菌形态特征的菌株接种至伊红美蓝培养基? 培养 / 观察平板生长的菌落培养后取暗蓝黑色并带有金属光泽的典型菌落划线接种于麦康凯琼脂培养基上? 培养进一步纯化并将疑似大肠杆菌进行硫化氢甲基化反应葡磷胨水 - 试验尿素枸橼酸盐赖氨酸鸟氨酸半固体琼脂等项微量生化鉴定, 血清型鉴定将大肠杆菌纯培养物先与多价血清做玻片凝集试验若为阳性再用个所属的单价血清与原处取培养物做玻片凝集试验以确定菌群如与某个单价血清凝集随机选择个以上菌落再与该血清进行玻片凝集试验仍为阳性时将菌落移种至三糖铁培养基在恒温箱? 培养 / 后观察结果并制成浓菌液后于? 水浴加热 1 然后与相应单价血清做玻片凝集试验结果仍为阳性即可定型诊断,0 相关毒力基因检测 +, 模板制备运用酚氯仿法进行 +, 模板制备溶于 ( 无菌水于? 保存引物设计与合成根据文献对产气菌素 "$, 3 铁载体受体 ' &, ',,,'$0066 基因设计引物引物序列见表引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 -) 反应采用 -) 方法对分离菌株进行毒力基因检测 -) 反应体系 (C 2 -) $#' :A ( 上下游引物 91! ( 各 (+, 模板 ( 无菌水 / (-) 反应条件 0? 预变性 1 0? 变性退火退火温度见表? 延伸个循环? 延伸 1? 保存至结束以参考菌株为阳性对照以 5 为阴性对照, 药敏试验对分离菌株进行阿米卡星庆大霉素多黏菌素氟苯尼考四环素甲氧苄啶头孢曲松头孢噻呋多西环素磺胺甲基异恶唑链霉素等种药物的药敏试验并以大肠杆菌标准菌株, ))0 为质控菌株将受试菌株与质控菌株涂布于麦康凯琼脂培养基复苏后挑取单个菌落接种于无菌 (? 恒温箱培养与麦氏比浊管比浊相同菌落计数约 C / )1( 时用灭菌棉签蘸取菌液均匀涂布于 5 平板上每个平板贴张药敏片? 恒温箱培养 / 观察结果耐药判定结果以美国临床实验室标准委员会 ))( )( 年推荐的标准进行

3 期邓伯雄等鸭致病性大肠杆菌分离鉴定及其相关致病性分析表引物信息 $ - #!$ *!- ' 引物名称引物序列 < < 退火温度? 产物大小 9 -'1#'1# -'1#' #="##,#! %$#19#' $"'# -'" $ ;# 83", ), )) ) )) 0 83", ),,,),,,) '9,,,) ),)),) '9 )) ), ))) 81),,,,, ) ),,, 0 81) ),,,,) 9 9,,,),,) ),,,,) 0 9 9, ) ),,),,,),,,,),,)),,), / ),,,), )),)) 00 ),),)),,))),,,) / 00,,)),,)),),,,), ), 2,),),,, ) ), / 2 ),, ))))) )),, 2 )),,),,),), ), / 0 2 )) ),,), ),) "$, ),), ),,,) "$, )),,),,, ) ), ),,))),,)),),, ), )),, )),,,!3 )),),), ),))!3 ),),)),,) ), ',, ))),,,,,),,)) )) ' ) ),,))))),) 19 ), ))),, )) ))) ),),), 0 19, ) )),) )),,) 结果与分析, 鸭致病性大肠杆菌分离鉴定经麦康凯琼脂培养基伊红美蓝培养基选择性培养特征性菌落革兰氏染色镜检为红色短杆菌疑似菌落经硫化氢苯丙氨酸葡萄糖酸盐蛋白胨水靛基质 - 枸橼酸盐尿素半固体琼脂动力葡萄糖产气赖氨酸鸟氨酸棉子糖山梨醇侧金盏花醇木糖项生化反应鉴定出株鸭致病性大肠杆菌,; 血清型鉴定株鸭致病性大肠杆菌的血清型鉴定结果显示 0 占 A > / 占 A > 占 A > 占 A > 占 A > 株为未定型占 A>, 鸭致病性大肠杆菌相关毒力基因检测 -) 产物经琼脂糖电泳验证后毒力基因 -) 扩增出相应的目的条带株鸭致病性大肠杆菌中! 3 &)&, ',,, 基因阳性率均为 A> 而 ' 基因阳性率 0A>$00 基因检出率低阳性率仅为 A>66 未被检出图, 鸭致病性大肠杆菌的药敏试验株鸭致病性大肠杆菌对替卡西林克拉维酸头孢曲松环丙沙星左氧氟沙星头孢噻呋新霉素卡那霉素多西环素恩诺沙星磺胺甲基异唑链霉素的耐药率介于 > 0> 之间而对氟苯尼考安普霉素利福平甲氧苄啶氨苄西林四环素的耐药率超过 > 其中利福平安普霉素的耐药率达到 0 > 和 > 表大部分菌株表现多重耐药现象可耐种以上药物耐种药物的菌株占 //> 表

4 / 中国畜牧兽医卷表药敏试验结果含药量药物片抑菌圈直径判断标准!"## # 结果 $% & 耐药 % 中敏 '# 敏感耐药率 % 中敏率 '# 敏感率替卡西林克拉维酸 ' ( ) * +(,- + + ))-)) ++. -() (+ 阿米卡星 /'0.( ) 1 ((-((+ + 庆大霉素 ( +. ) ((-((+ + 头孢曲松 %.( ), ))-)) 环丙沙星 1+( + + -*. + -)( ,+ 左氧氟沙星 2 3. ) 1 -.+,- + + (-.*+ 头孢噻呋 4.(,+( + ))-)) 氟苯尼考 42%.( +., 11-1,+..-..*+ 新霉素 5.( ,,-,*+)+ 卡那霉素 0/.(. ), )-, )+ -) ++ -,+ + 安普霉素 / %.. ) ) ((-((+ + 链霉素 % ( + ) -,)+ -) ++ )(- )+ 多西环素 5.( +. 1 ),-.+, *+ 恩诺沙星 % ) ++ (-.*+ 利福平 %4 1 * +( *1-.(+1+.- ( + 甲氧苄啶 ' ( 1, -),+++,- + + 磺胺甲基异唑 '6.(( +. 1 * ( +. -() (+ 多黏菌素 7 52.((,, + ((-((+ + 氨苄西林 /' (. ) 1, -),+++,- + + 四环素.( ), * )-( +(+ + -*. +

5 期邓伯雄等鸭致病性大肠杆菌分离鉴定及其相关致病性分析 0 +(+, ' #' 5 83",'9 81) 9 9, 00 2/20"$,!3'19 图大肠杆菌毒力相关基因检测电泳图!,'#' 6! $ '! #$ ' 表株鸭致病性大肠杆菌多重耐药统计表 4#! '!'# $#* # $' '#!$' 7* #/$! 耐药型 +'"%'#$$9 $#' 菌株数 8! $# 占总菌数百分比 >-#' # $ %# 耐 #$$$ #'"% 耐 #$$$$ '"% 耐 #$$$$ '##'"% 耐 #$$$8&#'"% 耐 #$$$ #&# '"% / 耐 #$$$#% $'"% 0 耐 #$$$#'"% / 耐 #$$$$# '"% 耐 #$$$#!#&# '"% / 耐 #$$$$ '$## '"% 讨论, 血清型分析株鸭致病性大肠杆菌血清型鉴定结果表明 0 占 A > / 占 A > 占 A > 占 A > 占 A > 株为未定型可能与本试验使用血清型种类及数量有限相关受试菌株血清鉴定结果表明一个鸭场可流行多种血清型已鉴定的菌株中优势血清型为 0 与吴信明等研究报道 0 在鸭场较为流行相似与于学辉等报道西南地区规模化鸭场鸭致病性大肠杆菌血清型以 / 0 和 0 为优势血清型及目前国内外研究报道鸭致病性大肠杆菌主要流行血 / 清型 / 和的情况不同其差异原因在于大肠杆菌血清型繁多所以各鸭场流行的优势血清型不尽相同各学者研究的结论具有地域相对性和时间相对性差异另一个不能回避的问题是本试验所用血清种类局限所以未定型的血清型较高因此所谓的优势血清型也只能是相对的优势此外还可能与大肠杆菌表面抗原变化引起血清型变异有关可见根据当地流行血清型防控大肠杆菌尤为重要且值得注意的是本试验中 / 及血清型在鸭群中鲜有报道对不常见的血清型深入研究可为防制致病性大肠杆菌病提供有效手段由于大肠杆菌致病性血清型的复杂性防控应针对血清型这一特殊变化因地因时施控, 耐药性分析大肠杆菌耐药性是个颇受关注的问题致病性大肠杆菌耐药表现也不相同存在时间性差异及地 0 区性差异该鸭场分离的大肠杆菌存在严重耐药现象甚至多重耐药对头孢曲松等种药物较敏

6 中国畜牧兽医卷感对利福平等种药物耐受株鸭致病性大肠杆菌仅对阿米卡星庆大霉素及多黏菌素敏感但不能作为首选药物种敏感药物的药动学机理相似口服几乎不吸收若是该鸭场中鸭群表现有消化道症状可利用这种药物在肠道中的高药物浓度用于治疗由此应选择较为敏感的环丙沙星左氧氟沙星新霉素等作为该鸭场的首选药物通过统计试验菌株中最多耐种药物平均耐种药物耐种药物的菌株数目占 //> 由于不合理应用抗生素使得细菌耐药性逐渐上升如本研究药敏试验中利福平和安普霉素的耐药性甚高可能与临床长期大剂量使用该药有关另一方面细菌间的外源性耐药基因传递大肠杆菌生物被膜形成代谢途径改变使耐药性增强因此通过药敏试验了解耐药动态选择合适药物改变用药环境和给药方式进行治疗对降低耐药性和减少耐药菌株有重要作用, 毒力基因分析禽大肠杆菌病是由多种致病因子作用的结果其致病因子包括黏附素肠毒素志贺毒素溶血素等毒素的形成与毒力基因密切相关目前通过测定! 3 &)&, 基因的多重 -) 方法可对禽致病性大肠杆菌做出快速诊断本试验中主要毒力基因组合形式为 ' B"$,B19 B B!3 B83",B'9B B9 9,' 基因阳性携带率为 0>' 基因存在于致病性血清型菌株中说明携带 ' 基因的菌株具有强毒力和较强的侵袭性 $00 基因检出率仅为 A> 本研究结果表明不同血清型可含有相同的毒力基因组合形式相同血清型可含有不同的毒力基因组合一般情况下黏附素会因菌种及菌株的不同而存在种类差异一种细菌只含有一种黏附素但某些菌株可同时携带并表达两种或两种以上黏附素本研究中通过 -) 方法检测出两株鸭致病性大肠杆菌同时携带 $00 B - 型菌毛黏附素基因这结果与张英等在国内报道的从仔猪腹泻粪样中分离到一株同时含和 00 两种黏附素的野毒株的结果有相似之处在产肠毒素大肠杆菌中除 33 编码基因位于染色体上其余黏附素基因均位于质粒上 00 作为一种重要的菌毛黏附素主要发现于哺乳动物中禽类鲜有报道 1#$ 等提出质粒在细菌进化过程中作用极为重要由此可推测禽大肠杆菌 $00 基因可能通过质粒传递而来另外 00 B 阳性菌主要黏附于宿主空肠和回肠段上皮细胞的微绒毛和刷状缘中而禽类肠道中是否存在特异性受体及其致病机理有待进一步探究本试验通过对鸭致病性大肠杆菌分离培养血清型鉴定药敏试验毒力基因检测为深入研究大肠杆菌潜在致病机理及防控大肠杆菌病提供参考参考文献陈伯伦鸭病北京中国农业出版社 / 4#!,,!'! ('$ #$! #&#'# ( # ##&#9$#1 9!3 #' $ # $$ # $ '$8! 3 6 -!&& 0 * #' )( 7!% 5#$!,&9 $ %# "'9 $ %# # ' 1#%$ "%( #1 ##&5! #!3'#! $# '#$ #3 6! 1!& *& &' " # "# & && 0 )1 7 (" #$!+#&#!91# $8 9#! 81"!$9!#:'#!$1#9!31#'#'#$ 3 8' 1"!$#" #$# $ 81' %# $ " %!8 '' #8# #6 *! -! #1"#!#' +#$ $)#$! # $8$ 81 1!9'# $' 8 &9 $ %# ( # ##&&'"!##8'" # ' 9 % $ $! 6 *&&' # "# & && / 0/00 于学辉程安春汪铭书等鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析 6 畜牧兽医学报 / 0 0 吴信明连洪梅王艳等 / 株鸭源大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 6 中国畜牧兽医 // / 胡青海刘晓文苗晋锋等当前我国鸭病的流行动态与防制对策 6 中国禽业导刊 / 0 李玲汪铭书程安春等雏鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定药敏试验及耐药性分析 6 中国兽医杂志张永信远东地区细菌耐药状况与对策 6 中国抗生

7 期邓伯雄等鸭致病性大肠杆菌分离鉴定及其相关致病性分析素杂志白灏冀辉韩先干等禽致病性大肠杆菌江苏安徽分离株的生物学特性分析 6 微生物学通报陆承平兽医微生物学第版北京中国农业出版社王亚君樊琛李一经 ' 基因与鸡源大肠杆菌致病性的相关 6 畜牧兽医学报 // 任士飞徐建生董国雄等细菌黏附研究进展 6 中国预防兽医学报 / 张英董国雄江美娟对 ) 株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究 6 江苏农学院学报 00 1#$ '3 5'; $!%# #$' 8#'-#' 9# $&#$''8# $8 9! #6 )! -"# & && / 责任编辑吴艳

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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