中 国 畜 牧 兽 医 卷 度过高等诱因引起 猪关节炎主要表现为病猪生长缓慢 饲料转化率降低 种猪繁殖性能降低 关节肿大 化脓 肿胀逐渐变软 破溃后流出黄绿色或浅绿色脓汁 软骨坏死 共济失调 抽搐 严重时死 亡 本试验从云南 个猪场采集有猪关节炎症状的病猪病料进行分离培养 生化试验 药敏试验 动物致

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1 中国畜牧兽医! " # 云南猪关节炎细菌性病原的分离鉴定 周玉照 张小苗 柴 俊 李三平 张娜娜 张以芳 云南农业大学动物科学技术学院 昆明 摘 要 本试验旨在了解云南 个猪场猪关节炎的细菌性病因及其耐药性 通过分离培养 生化试验 药敏试验 动物致病性试验及 # 鉴定 对 个猪场出现猪关节炎症状的样品进行了分析 结果显示 " 和 个猪场共 份样品中 检出金黄色葡萄球菌 份 阳性率分别为 和 检出链球菌 份 阳性率分别为 和 混合感染阳性率分别为 和 因此 金黄色葡萄球菌是导致 " 两猪场猪关节炎的主要细菌性病原 链球菌是导致 两猪场猪关节炎的主要细菌性病原 两种细菌对菌必治 米诺环素和环丙沙星较敏感 对多种抗生素产生了耐药性 关键词 猪关节炎 金黄色葡萄球菌 链球菌 # 鉴定中图分类号 文献标识码 文章编号!#! # ' #!!';# # #!!'" #.. " '.. - ## '#- 4 - #!!- " # (9 (( 484(4 ( 44(4( 4(((4( ( ( 4( 4 ( 4(4( 44(47(9 (( 4# ( 4 4 8( 7 (4(( (( 48(44 ( ( 8((!###4(4(4(4( 8(( "(( 4(7( 8((!!###4(4(4(4( 8(( (( 4(7;9( ( 4 4( 8(( (( 4(7(((!###8 4(4( 4 ( 8 ( 44"!!###8 4(4( 4( 8 ( 44 84(8((( (4(4 (4 9 (7( 9 (4 444 ( 44 -!44!###!!### # ( 4 4 随着养猪业规模化和集约化的发展 猪关节炎日趋流行并呈世界性分布 虽然该病所致的死亡率不高 但是影响猪生长发育和外观 给养猪业造成极 大的经济损失 因此 探究引起猪关节炎的病原 对于临床上对症治疗具有重要的指导意义 大量研 究发现引起猪关节炎的病原菌有副猪嗜血杆菌 猪链球菌 葡萄球菌 化脓隐秘杆菌 巴氏杆菌 猪丹毒 杆菌 该病一年四季均有发生 潮湿多雨季多发 主要由环境卫生条件差 消毒措施不当 饲喂管理欠佳 气温骤变和猪群拥挤等应激 圈舍内空气湿 收稿日期 基金项目 云南省重点新产品开发 云南省院士专家工作站建设项目 " 作者简介 周玉照 男 云南宣威人 硕士生 研究方向 动物微生物与免疫学 张小苗 女 云南保山人 硕士生 研究方向 分子病原学与免疫学 周玉照与张小苗对本文具有同等贡献 并列为第一作者 通信作者 张以芳 男 云南曲靖人 教授 研究方向 动物微生物与免疫学 7

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 度过高等诱因引起 猪关节炎主要表现为病猪生长缓慢 饲料转化率降低 种猪繁殖性能降低 关节肿大 化脓 肿胀逐渐变软 破溃后流出黄绿色或浅绿色脓汁 软骨坏死 共济失调 抽搐 严重时死 亡 本试验从云南 个猪场采集有猪关节炎症状的病猪病料进行分离培养 生化试验 药敏试验 动物致病性试验及 # 鉴定 以期为这 个猪场找出引起此次猪关节炎的病因 为该病的治疗提供科学依据 材料与方法. 样品来源 年 月至 年 月采自云南 个猪场出现猪关节炎症状病猪的肝脏 脾脏 肾脏 肺脏 淋巴结及关节浓汁 共 份. 材料营养琼脂培养基 伊红美蓝琼脂培养基 麦康凯琼脂培养基 培养基 (84 琼脂平板 血琼脂平板 多黏菌素 萘啶酮酸 革兰氏染色液 生化鉴定管 细菌 提取试剂盒 胶回收试剂盒均购自天根生化科技 北京 有限公司 健康小白鼠由昆明医科大学惠赠. 细菌分离培养无菌采取 个猪场病猪肝脏 脾脏 肾脏 肺脏 淋巴结及关节浓汁接种于血清肉汤 恒温培养 革兰氏染色并镜检 将镜检有 双球菌或短链状球菌的血清肉汤培养液划线于血琼脂平板 (84 琼脂平板 恒温培养 挑取平板上的单个可疑菌落进行革兰氏染色 镜检 接种于 培养液中纯化培养 将镜检有 葡萄串状球菌的血清肉汤培养液接种于血琼脂平板 麦康凯平板 伊红美蓝平板 恒温培养 挑取平板上的单个可疑菌落进行革兰氏染色 镜检后 接种于血清肉汤纯化培养. 生化试验取 个猪场纯培养菌液分别加入到葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖 甘露糖 阿拉伯糖 菊糖 水杨苷 山梨醇 甘露醇 七叶苷等生化鉴定管中 恒温培养 记录试验结果 其生化试验断定标准 葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖 甘露糖 阿拉伯糖 菊糖 水杨苷 山梨醇 甘露醇阳性为黄色 阴性为紫色 七叶苷阳性为棕黑色 阴性为棕色. 药敏试验将纯培养菌液分别接种到血清肉汤和 培 养基 恒温培养 使用浓度梯度稀释活菌计数法调整菌液含菌数为 个 ' 取菌液均匀涂布于营养琼脂平板上 加盖放置 待平板稍干后 用镊子将药敏纸片平放在平板上 并轻压使其紧贴平板表面 每个平板贴 张药敏纸片 药敏片有阿米卡星 链霉素 米诺霉素 环丙沙星 菌必治 庆大霉素 克林霉素 林可霉素 氯霉素 先锋 D 头孢呋肟 头孢孟多 壮观霉素和青霉素 且两纸片相距 纸片与平板边缘不小于 贴好纸片的平板于 培养 后 观察并测量抑菌圈直径 根据抗微生物药物敏感性试验执行标 准! 判定结果. 动物致病性试验取 只健康小白鼠 随机分成 组 每组 只 试验组分别接种分离的纯培养菌液各 ' 空白对照组注射 ' 生理盐水 接种后每天观察小白鼠的发病和死亡情况 连续观察 并对发病和死亡的小白鼠进行细菌分离鉴定. 4" 鉴定 引物设计与合成 根据 ( 中 # 基因保守序列 应用!(!(( 软件设计 对引物 引物序列 #A """" A # #A "" "" " " A 引物由昆明硕擎生物科技有限公司合成!"# 扩增 分离菌株分别用血清肉汤和 培养基培养至对数期 按细菌 提取试剂盒操作说明提取总 利用!"# 扩增菌株的 # 基因片段!"# 反应体系 '9' ' 9 ' ( ' # ' # #'!' ' '!"# 反应条件 预变性 变性 退火 延伸 个循环 延伸 扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳鉴定 序列分析 将!"# 产物纯化后送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序 利用 ' 将分离菌株的 # 基因序列同 ( 数据库中的典型菌株 # 序列进行同源性比对 绘制系统发育树 结果与分析. 镜检结果将血清肉汤初步培养的菌液划线于血琼脂平

3 ! 期 周玉照等云南猪关节炎细菌性病原的分离鉴定 板! b 恒 温 培 养 8!结 果 发 现 一 种 直 径 CC!边缘整齐(扁平(有光泽(不透明!菌落 周围 呈 落'分别挑取平板上的单个可疑菌落进行革兰氏染 透明!溶血环 的 金 黄 色 圆 形 菌 落一 种 在 P? 液 体培养基呈絮状沉淀!在血平板上呈微小圆形!透明 阳性球菌"图 =#!初 判 定 为 链 球 菌以 及 紫 色 典 型 葡萄串状的革兰氏阳性球菌"图?#!初 判定 为葡 萄 而略带灰白色小水 滴 状!有 明 显!溶 血 环 的 圆 形 菌 球菌' 色(镜检!结果显示有成双或成单排列短链状革兰氏 =!革兰氏阳性链球菌?!革兰氏阳性葡萄球菌 =! `A HC!# S=. #?! `A HC!# S= "( 图 #! 分离菌株镜检结果" (d # #!; = = =. 9 " (d # F!F!! 细菌分离培养结果 将上 述镜 检有 ` 双球 菌或短链状 球菌 的血清 凯康琼脂培养 基(伊 红 美 蓝 琼 脂 培 养 基! b 恒 温 培养 8 后!没 有 出 现 任 何 菌 落!确 定 为 金 黄 色 葡 肉汤培养液划线 P#""!V 琼脂平板! b 恒温 培养 8 后!长出灰白色菌落!确 定 为链球 菌将镜 萄球菌'? 和 4 两猪场金黄色葡萄球菌阳性率分别 为 ' _ 和 7' _ = 和 两 猪 场 链 球 菌 阳 性 率 检有 ` 葡萄串状球菌 的 血 清 肉 汤 培 养 液 划 线 于 麦 分别为 7' _ 和 ' _ "表 #' 表 #! 云南 个猪场细菌分离培养结果 IC #!? = 9C = [ 病料组织 G "C I 金黄色葡萄球菌 链球菌 混合感染 = "(. =. # Y W" T #-A H =场?场 4场 场 =场?场 4场 场 =场?场 4场 场!=!?!4!!=!?!4!!=!?!4! 肝脏 9 S A 脾脏 ; - 肾脏 ] "-U 肺脏 9I-X 淋巴结 9UC8-#" 关节浓汁 # 8. I 总计 P# H 阳性率"_ # ( ( ' ' 7' ' 7' ' ' ' ' ' ' ' # SA H!F! 生化试验结果 结合镜检和分离培养结果!针对性的对 =( 猪 行结果判定!结 果 显 示 =( 猪 场 和?( 4 猪场的 优势菌株分别符合链球菌和金黄色葡萄球菌的生化 场和?( 4 猪场的优势菌株进行糖发 酵(触 酶 试 验 等 特性"表 #' 综 合 上 述 试 验 结 果!分 离 到 金 黄 色 葡 生化试验!参照伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册判 定 标 准 进 萄球菌 株!链球菌 ( 株'

4 中 国 畜 牧 兽 医 卷 表 云南 个猪场细菌生化试验结果 # ;!( #!'# #'!('! '#( # 生化试验 ( 4( 4 场 场 " 场 " 场 葡萄糖 ( 乳糖 ' 4 ( 蔗糖 ( 麦芽糖 ;4 ( 甘露糖 ; ( 阿拉伯糖 ( = = = = 菊糖 = = = = 水杨苷 = = 山梨醇 4 = = = = 甘露醇 ;4 = = 七叶苷 (( ( = = 触酶试验 " 4 4(7(4( 4 = = 阳性 = 阴性! 4(=(4(. 药敏试验结果分离菌株对 种抗生素的药敏试验结果显示 金黄色葡萄球菌对菌必治 米诺环素 环丙沙星和庆大霉素较敏感 对阿米卡星耐药率高达 其次是壮观霉素 链球菌菌株对米诺环素 阿米卡星 链霉素 环丙沙星和菌必治较敏感 对头孢孟多耐药率高达 其次是壮观霉素 两种菌株对壮观霉素的耐药率达到 对青霉素达到 表 同时发现 分离菌株对 种抗生素呈现不同程度的耐药性 且以多重耐药为主. 动物致病性试验结果由表 可知 个猪场所分离的金黄色葡萄球菌和 猪场分离到的链球菌均具有致病性 而 " 猪场分离到的链球菌无致病性.4" 鉴定结果 # 基因!"# 扩增结果 将 猪场分离到的致病性链球菌和 " 猪场分离到的不致病性链球菌进行 # 基因扩增 经 琼脂糖凝胶电泳获得大小约 的特异性目的条带 图 与预期结果相符 ;' ; ( 猪场 猪场 " ;' ; (" 图 4" 基因 扩增电泳图. #( ' #!!'4"

5 期 周玉照等 云南猪关节炎细菌性病原的分离鉴定 表 个猪场细菌抗生素的耐药率!! 金黄色葡萄球菌 链球菌 总计 耐药菌株数 株 抗菌药物 耐药率 '! 场 场 场 场 "#! "# "# "# 耐药菌株数 株 耐药率 '! 场 场 场 场 "#! "# "# "# 耐药菌株数 株 药率 '! 场 场 场 场 "#! "# "# "# 阿米卡星! ( ( ( ( 链霉素 - (.- ( - ( ( - ( 米诺环素. - ( ( ( ( ( ( 环丙沙星. ( ( (( ( ( 菌必治 ( - ( - ( ( - ( ( 庆大霉素 - ( ( (. ( ( 克林霉素 (( (-. (- ( 林可霉素 (. ( ( ( ( -( - 氯霉素 ( (. ( ( ( ( ( ( (. 先锋 ( ( - ( - (- - ( ( ( (. 头孢呋肟 ( (. ( ( - ( - ( ( 头孢孟多 ( ( (. - (. - (. -. 壮观霉素 (. (. - ( ( - -. 青霉素 (.- ( ( -

6 中!国!畜!牧!兽!医 卷! 表! 动物致病性试验结果 IC!4 = 7 组别 注射菌液 注射部位 注射剂量 存活情况 致病性 `A #I #-QH A H " JI #- #-"# ;I A S SH H 8#X U 组 `A #I = 场链球菌 = 场金黄色葡萄球菌 C9 C9 (8 相继死亡 (8 相继死亡 组 `A #I 组 #I `A? 场链球菌 C9 全存活 a #I 组 `A 组 `A #I? 场金黄色葡萄球菌 4 场金黄色葡萄球菌 C9 C9 (8 相继死亡 (8 相继死亡 ( 组 `A #I( #I 组 `A 4 场链球菌 场链球菌 C9 全存活 a C9 组 `A #I 场金黄色葡萄球菌 C9 (8 相继死亡 (8 相继死亡 7 组 `A #I7 生理盐水 C9 全存活 a!致病!a!不致病! H 8#X- a! D#H 8#X- ' ('!(;AD= 基 因 序 列 的 同 源 性 比 对 分 析!! 将上述 4 产 物 进 行 纯 化 后 进 行 测 序' 参 照 崔 号 GL ' 和' #同源性高达 77' _! 与粪链球菌" `-?H-. 登 录 号 (' #同 源 性 照仙 7报 道 的 方 法 利 用?9=;P 将 测 序 得 到 的 (;AD=基因序列同 `-?H-. 数据库中 典型 菌株 达 7' _ "图 ( #'= 场分离菌株与化脓性链球菌 的 (;AD= 序列进行同源性比对分析'结果显示 " ` -?H-. 登录号 9D7' #同 源 性 达 ' _ 场分 离 菌 株 与 化 脓 性 链 球 菌 "` -?H-. 登 录 号? 场 分 离 菌 株 与 粪 链 球 菌 "`-?H-. 登 录 号 GL ^ 和 ' #同 源 性 高 达 77' 7_! =f7(7' #同源高达 7' _ "图 ( (#'因此!所测 场分 离菌 株属 于粪 链球 菌! 的?( 4 =( 场菌 株 属 于 与粪链球菌" `-?H-. 登 录 号 (' #同 源 性 达 7' _ 4 场分离菌株与粪链球菌" ` -?H -. 登录 化脓性链球菌' 图!Y" A 场分离菌株 #GH4 序列同源性比对分析!#GH4 = 9 9 YA9 F 7= 7 关的关节炎'链球 菌(葡 萄 球 菌 和 副 猪 嗜 血 杆 菌 是! 讨! 论 细菌性猪关节炎发病机理是病原菌经消化道或 引起关节炎的最常见病原体'链球菌广泛存在于自 然界!也存在于猪 的 鼻 腔(喉 分 泌 物 及 扁 桃 体!一 般 呼吸道侵入机体!通 过 血 液 循 环!定 居 四 肢 关 节!引 情况下不会引起 母 猪 发 病!但 在 母 猪 产 仔(哺 乳 时! 起猪关节发 炎(肿 胀(机 能 障 碍 ' 猪 关 节 炎 主 要 存在于母猪体内的链球菌可能经损伤的皮肤(鼻腔( 有链球菌关节炎(支 原 体 关 节 炎(猪 丹 毒 关 节 炎(风 口腔侵入仔猪体内 而 使 仔 猪 感 染 发 病!给 猪 场 带 来 湿性关节炎(病毒性 关 节 炎 及 与 其 他 败 血 性 感 染 有 的经济损失不容忽视 '

7 ! 期 周玉照等云南猪关节炎细菌性病原的分离鉴定 图!Y" A 场分离菌株 #GH4 遗传进化树!J7 = C #GH4 9 9 YA9 F 图 (!4" 8 场分离菌株 #GH4 序列同源性比对分析 F (!# GH4 = = 7 图!4" 8 场分离菌株 #GH4 遗传进化树!J7 = C #GH F!! 本研究通过对云 南 个 养 猪 场 7( 份 出 现 猪 关 节炎症状的病猪样品进行细菌分离培养(生化试验( 果 显 示? 场 分 离 菌 株 与 `-?H-. 登 录 号 为 GL ^ 和 ^ 同 源 性 高 达 77 ^7_ 4 药敏试验(动物致病性试验!结果表明 个猪场检出 金 黄 色 葡 萄 球 菌 份!阳 性 率 分 别 为 ^_ ( 场分 离 菌 株 与 `-?H-. 登 录 号 为 GL ^ 和 ^ 同源 性 高 达 77 ^_ = 场 分 离 菌 株 与 ^_ ( 7 ^ 和 ^_ 检 出 链 球 菌 ( 份!阳 性率分别为 7 ( ^_ ^_ ( ^_ 和 ^_ 混合 `-?H-. 登录号 为 9D7 ^ 同 源 性 达 ^_ 场 分 离 菌 株 与 登 录 号 为 `-?H-. =f7(7 ^ 感 染 阳 性 率 分 别 为 ^_ ( ^_ ( ^_ 和 ^_ '为进一步了解 个猪场分离到的链球菌属 同源 性 高 达 7 ^_ ' 所 以?( 4 场分离菌株属于粪 于哪种类型!试验又采用了 (;AD= 鉴定!测序结 链球菌! =( 场分离菌 株 属 于 化 脓 性 链 球 菌' 由 此 得出!金黄色葡萄球菌是导致?( 4 两猪 场 猪 关 节 炎

8 中 国 畜 牧 兽 医 卷 的细菌性病原 化脓性链球菌是导致 两猪场猪关节炎的细菌性病原 部分猪同时继发感染金黄色葡萄球菌 目前 大部分猪场主要通过抗生素来治疗该病 但由于抗生素的滥用 导致细菌出现耐药 性 本研究对分离到的金黄色葡萄球菌和链球菌进行了 种抗生素的耐药性分析 结果表明金黄色葡萄球菌对菌必治 米诺环素 环丙沙星和庆大霉素较敏感 对阿米卡星耐药率高达 其次是壮观霉素 链球菌对米诺环素 阿米卡星 链霉素 环丙沙星和菌必治较敏感 对头孢孟多耐药率高达 其次是壮观霉素 两种菌株对壮观霉素的耐药率达到 对青霉素达到 可见分离菌株对 种抗生素呈现不同程度的耐药性 且以多重耐药为主 本研究从细菌性病原的角度对猪关节炎的病因进行了初步的分析 通过分离鉴定发病猪场致病细菌 并对分离菌株进行药敏试验 # 鉴定和序列分析 为进一步分析当地猪场发生猪关节炎的复杂病因和临床治疗提供一定的科学依据 菌分离与鉴定 吉林畜牧兽医 鲁杏华 何世成 谈志祥 等 猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定 中国畜牧兽医 张乔挺 猪关节炎型链球菌病 农家参谋 李 彬 蔡 鹏 猪关节炎症状疾病的鉴别诊断 中国畜牧兽医文摘 顾海丰 关节炎型猪链球菌病的诊治 湖北畜牧兽医 孙长贵 抗微生物药物敏感性试验执行标准 第 版信息增刊 布坎南 # 吉本斯 伯杰氏细菌鉴定手册 ; 第版 北京 科学出版社 崔照仙? 翠仙 周玉照 等 乳扇制品中乳酸杆菌的分离鉴定及 # 序列同源性分析 中国微生态杂志 杜维军 牛朝美 孔祥建 等 猪急性关节炎型链球菌病的诊治 养殖与饲料 郝天斌 陈雨田 猪非溶血性关节炎型链球菌病的诊治 中国兽医科技 ( ' 4( 参考文献 商景峰 猪关节炎的病因分析和防治 今日养猪业 姜 杰 张永立 邱永敏 等 引起猪关节炎的葡萄球 4 (4( ( ( 4((4( (4 8((!#! 责任编辑 吴 艳

第 期 王 兴 涛 等 猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 种 猪 精 液 分 离 株 的 鉴 定 及 进 化 分 析 病 料 毒 株 及 细 胞 试 剂 引 物 设 计 提 取 及 基 因 克 隆 及 测 序

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