38 谢昆, 等 : 奶牛隐性乳房炎链球菌的分离鉴定及药敏试验 并为后续的试验做好准备 1 材料与方法 1.1 材料 试验材料为新鲜牛奶, 在蒙自市奶牛养殖户的 4 头奶牛采集 8 份牛奶样品, 然后带回实验室置于 4 冰箱保藏备用 1.2 培养基 血液琼脂培养基 : 蛋白胨 10g, 牛肉膏 3g

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1 上海农业学报 2015,31(5):37 41 ActaAgriculturaeShanghai DOI: ?j.isn 文章编号 : (2015) 奶牛隐性乳房炎链球菌的分离鉴定及药敏试验 谢昆 1,2, 蒋成砚 1,2, 王会英 1, 周文树 1, 唐秀华 1 1, 汪镜 ( 1 红河学院生命科学与技术学院, 云南 ; 2 云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室, 云南 ) 摘要 : 从云南省蒙自地区奶牛乳样中采集病原菌, 通过细菌培养, 进行形态和生化试验鉴定及药敏试验 结果表明 : 从牛奶中分离得到的 7 株链球菌 ( 编号为 MZ1 MZ7), 按照传统的形态学和生理生化并参照 常见细菌系统鉴定手册,2 株是无乳链球菌 (Streptococusagalactiae)(MZ1 和 MZ6) 3 株是乳房链球菌 (S.uberis) (MZ4 MZ5 和 MZ7) 和 2 株停乳链球菌 (S.dysgalactive)(MZ2 和 MZ3); 这些菌株对四环素 头孢噻吩 环丙沙星和苯唑西林 4 种药物敏感, 对庆大霉素 万古霉素和青霉素 3 种药物敏感性较低 关键词 : 奶牛 ; 链球菌 ; 分离鉴定 ; 药敏试验 Identificationandantibioticsensitivitytestofdairycow recesivemammitisstreptococcus XIEKun 1,2,JIANGCheng yan 1,2,WANGHui ying 1,ZHOUWen shu 1,TANGXiu hua 1,WANGJing 1 ( 1 FacultyofLifeScienceandTechnology,HongheColege,Yunnan661199,China; 2 YunnanHigher Learning In stitutionkeylabofgood QualityandHigh EficiencyCropCultureandSafetyControl,Yunnan661199,China) Abstract:Thepathogenicbacteriaseparatedfrom freshmilkinthemengziareaofyunnanprovincewere morphologicalyandbiochemicalyidentifiedviabacterialculture,andtheirsusceptibilitiesto7commonantibiot icswerealsotested.theresultsshowedthatthe7separatedstreptococcusstrains(mz1 MZ7)wererespectively 2strainsofStreptococusagalactiae(MZ1andMZ6),3strainsofS.uberis(MZ4,MZ5andMZ7)and2strainsof S.dysgalactive(MZ2andMZ3)accordingtotraditionalmorphology,physiologyandbiochemistryaswelasThe CommonManualofDeterminativeBacteriology;Altheabovestrainsweresusceptibletotetracycline,cefoxitin, ciprofloxacinandoxacilin,butlowsusceptibletogentamicin,vancomycinandpenicilin. Keywords:Dairycow;Streptococcus;Isolationandidentification;Drugsensitivetest 奶牛乳房炎是一种常见的 复杂的疾病 在奶牛的饲养过程中是发病率最高 流行最快 造成损失最大的疾病之一 根据症状表现分为临床性乳房炎和隐性乳房炎 2 种, 引起奶牛乳房炎的原因有物理因素 化学因素 机械因素 微生物的感染等 在引起乳房炎的各种因素中, 微生物的感染又占相当大的比例, 目前报道过的病原菌多达 80 余种, 其中链球菌是主要的致病菌之一 [1 2] 链球菌具有溶血能力, 革兰氏阳性, 直径小于 2.0μm, 成圆形或卵圆形, 长排列成链状或成双, 可产生各种毒素或酶, 导致人 家畜及野生动物的各种疾病 ; 不仅是奶业发展的障碍, 也时刻危害着人类的健康 引起奶牛乳房炎的链球菌属主要分为无乳链球菌 停乳链球菌 乳房链球菌 化脓链球菌和兽疫链球菌等, 在患有隐性乳房炎奶牛牛乳中可分离得到 [3 4] 目前, 奶牛乳房炎在世界各地均有发生, 各国都在研究寻找防治乳房炎的方法, 有抗生素疗法 疫苗 ( 灭活苗 减毒活疫苗 亚单位疫苗 基因工程疫苗 核酸疫苗 ) 免疫佐剂 卵黄抗体 中草药防治等, 但防治效果不佳 隐性乳房炎由于不表现任何症状往往难以诊断, 多采用的方法是由乳汁的 ph 检查碱性的高低, 从而判断炎症的程度 [5] 本试验通过革兰氏染色和细菌的生化鉴定, 糖发酵试验,CAMP 试验鉴定出引起奶牛乳房炎的病原菌, 并进行药敏试验 为预防奶牛乳房炎和治疗奶牛乳房炎提供可靠的依据, 收稿日期 : 基金项目 : 云南省科技厅应用基础研究面上项目 (2010ZC151,2010CD088), 红河学院博士专项项目 (XJ15B13) 作者简介 : 谢昆 (1975 ), 男, 博士, 副教授, 研究方向 : 动物生物化学与分子生物学 E mail:xk_biology2@126.com

2 38 谢昆, 等 : 奶牛隐性乳房炎链球菌的分离鉴定及药敏试验 并为后续的试验做好准备 1 材料与方法 1.1 材料 试验材料为新鲜牛奶, 在蒙自市奶牛养殖户的 4 头奶牛采集 8 份牛奶样品, 然后带回实验室置于 4 冰箱保藏备用 1.2 培养基 血液琼脂培养基 : 蛋白胨 10g, 牛肉膏 3g, 氯化钠 5g, 琼脂 10g, 调节 ph 至 7.3±0.1, 蒸馏水定容至 1000mL 煮沸溶解后高压灭菌 15 20min, 冷却至 50, 加入已经预热的血液, 摇匀后倒到平板 1.3 细菌分离培养及纯化 将采集的奶样涂片, 革兰氏染色后, 初步检验是否有链球菌, 分别将采集初步检验带有链球菌的牛奶划线于血液营养琼脂平板上,37 恒温箱中培养 24h 观察生长情况, 然后从血液营养琼脂平板上挑取菌落形态可疑的进行革兰氏染色, 将细菌形态为链珠状占多数的菌落再进行纯培养,37 培养 24h 后观察结果, 重复以上步骤染色再进行纯培养, 直到革兰氏染色镜检细菌形态一致 待菌株生长良好后, 仔细观察菌落形态 1.4 细菌形态鉴定 革兰氏染色 将牛奶中分离的细菌进行革兰氏染色确定是阳性菌还是阴性菌 镜检 挑选形态典型的个体, 放到显微镜下观察, 菌体被革兰氏染色染成紫蓝色的为阳性, 染成红色的为阴性, 凡革兰氏染色为阳性, 菌体成连珠状的暂定为链球菌 生理生化鉴定 将分离到的革兰氏染色为阳性, 菌体成链珠状的细菌, 做 6.5% 氯化钠 七叶苷 棉籽糖 马尿酸钠 蕈糖 水杨素 菊糖 甘露醇 山梨醇 海藻糖 乳糖各种糖类发酵试验,CAMP 试验将金黄色葡萄球菌和链球菌交叉划线培养 24h, 然后根据 常见细菌系统鉴定手册 来确定所属的种 药敏试验 将采集到的牛奶初检含有链球菌和分离到的菌体制成的菌悬液涂布在血液琼脂平板上, 取各种药敏片贴附在含菌的琼脂平板上, 置于 37 恒温箱中培养 24h 后测抑菌圈的直径, 根据抑菌圈的大小确定菌株对药物的敏感性 2 结果与分析 2.1 牛奶中链球菌的分离 从 8 份样品中, 分离出 7 株链球菌, 采用传统的形态学和生理生化鉴定, 鉴定出 3 个种, 分别是无乳链球菌 (S.agalactiae)2 株, 乳房链球菌 (S.uberis)3 株, 停乳链球菌 (S.dysgalactive)2 株 2.2 培养特性 生长温度 37,pH ,3 种菌的营养要求较高, 普通培养基上生长不良, 需添加血液 血清等 在血液琼脂培养基上长成直径在 mm, 灰白色, 表面光滑, 边缘整齐的小菌落 3 种菌都具有溶血能力, 溶血圈的大小依各菌株而异 在血清肉汤中生长, 初呈均匀浑浊, 后因细菌形成长链呈颗粒状沉淀管底, 上清是透明的 2.3 形态特征 表 1 分离的菌落特征描述 Table1 Morphologicalcharacteristicsofisolatebacterialcolonies 分离株 菌落形态特征 菌体形态及排列 乳房链球菌 菌落约 0.8mm, 隆起, 灰白色, 边缘整齐的闪光小菌落 链状短, 有时成对的排列, 无荚膜 停乳链球菌 菌落约 0.5mm, 隆起, 灰白色, 边缘整齐的闪光小菌落 链状较短, 通常 5 7 个相连, 无荚膜 无乳链球菌 菌落约 0.4mm, 隆起, 灰白色, 边缘整齐的闪光小菌落 长链状, 通常 8 10 个相连, 无荚膜

3 上 海 农 业 学 报 图 1 乳房链球菌的菌落形态 F 1 C n m ph g y S ub 图 2 乳房链球菌的菌体形态 F 2 Th m S ub 图 3 停乳链球菌的菌落形态 F 3 C n m ph gys d y g 图 4 停乳链球菌的菌体形态 F 4 Th m S d y g 图 5 无乳链球菌的菌落形态 F 5 C n m ph g ys g 图 6 无乳链球菌的菌体形态 F 6 Th m S g 39 2 4 链球菌的糖发酵特性和 CAMP试验分析与种的鉴定 将分离到的 7株链球菌菌株 进一步做糖发酵试验和 CAMP试验 表 2为菌株的糖发酵试验结果 根据图 1 6的菌落形态及菌体形态和表 2的糖发酵试验结果 参考 兽医微生物学 来鉴定菌株所 属的种 可以得到 MZ1和 MZ6是同一种菌株 鉴定为无乳链球菌 MZ2和 MZ3为同一种菌株 鉴定为停 乳链球菌 MZ4 MZ5和 MZ7为同一种菌株 为乳房链球菌 2 5 药敏试验结果 选用万古霉素 庆大霉素 环丙沙星等 7种常见药物对分离菌株做药敏试验 24h后测量其抑菌圈直 径 参照美国临床实验室标准委员会 19 9 4年制定的抗菌素敏感度判断标准 NCCLS 199 4 判断抑菌结

4 40 谢昆, 等 : 奶牛隐性乳房炎链球菌的分离鉴定及药敏试验 果 抑菌环直径 >15mm 为高敏感度抑菌作用, 用 +++ 表示 ;10mm< 抑菌环直径 <15mm 为中度敏感抑菌作用, 用 ++ 表示 ;5mm< 抑菌环直径 <10mm 为低敏感度抑菌作用, 用 + 表示 ; 抑菌环直径 <5mm 为无抑菌作用, 用 - 表示 6.5% 的高盐肉汤 马尿酸钠 七叶苷 表 2 菌株的糖发酵试验结果 Table2 Sugarfermentationtestsofbacterialstrains 甘露醇 山梨醇 乳糖 棉籽糖 MZ (+) MZ MZ MZ4 (+) (+) + (+) + (+) (+) - MZ5 (+) (+) + (+) + - MZ MZ7 (+) (+) + (+) + (+) (+) - 注 : + 表示阳性反应, 在 CAMP 试验中表示出现箭头状溶血区 ; - 表示阴性反应, 在 CAMP 试验中表示不出现箭头状溶血区 ; (+) 表示反应缓慢 水杨苷 果糖 木糖 表 3 药敏试验抑菌圈的直径 Table3 Diameterofbacteriostaticzoneindrugsensitivetest 麦芽糖 阿拉伯糖 MZ1 MZ2 MZ3 MZ4 MZ5 MZ6 MZ7 万古霉素 庆大霉素 头孢噻吩 环丙沙星 苯唑西林 青霉素 四环素 表 4 抑菌效果评估 Table4 Evaluationofbacteriostaticefects MZ1 MZ2 MZ3 MZ4 MZ5 MZ6 MZ7 万古霉素 庆大霉素 头孢噻吩 环丙沙星 苯唑西林 青霉素 四环素 从表 3, 表 4 中可知 : 头孢噻吩 环丙沙星 苯唑西林和四环素显示出较好的抑菌效果, 而庆大霉素 万古霉素和青霉素的抑菌效果不理想,3 种链球菌对这些药物表现出不同程度的耐药性 3 结论与讨论 3.1 分离培养基的选择 根据链球菌所在的生存环境等的不同可以选择不同的培养基进行分离 [6] 致病的链球菌对培养基的要求较高, 在普通的培养基上生长不良, 要在添加有血清和血液培养基上才能生长, 而兔血在试验中较易取得, 在血液琼脂培养基上链球菌的菌落形态比较明显, 所以本试验采用添加兔血的血液琼脂培养基进行分离 3.2 链球菌的分离结果 本试验从蒙自奶牛养殖户采集到 8 份牛奶样品进行细菌分离, 从中分离到 7 株链球菌, 采用传统的形态学和生理生化分别鉴定, 根据试验结果, 参照 常见细菌系统鉴定手册 和 兽医微生物学, 从牛奶中分离到的 7 株细菌符合链球菌的细菌, 分离出无乳链球菌 (S.agalactiae)2 株, 乳房链球菌 (S.uberis)3 株, 停乳链球菌 (S.dysgalactive)2 株 [7] 3.3 药敏试验结果 菊糖 CAMP 试验 从试验结果可以知道不同的细菌的药物敏感程度不同, 通过药敏试验可以选择药敏性高的药品对奶 mm

5 上海农业学报 41 牛乳房炎进行一定的防治和治疗 分离到的菌株对头孢噻吩 环丙沙星 苯唑西林和四环素的敏感程度较高, 而对庆大霉素 万古霉素和青霉素的敏感程度较低 本试验只对 7 种药物进行试验, 为了在治疗过程中降低链球菌的抗药性产生, 可以做较广谱的药敏试验而获得更多抗菌药物, 在采用药物交叉试验获得更好的治疗效果, 从而可以降低抗药性产生 参考文献 [1] 杨晓莉, 王桂琴, 侯鹏琴, 等. 奶牛乳房炎链球菌的分离鉴定及药敏试验 [J]. 黑龙江畜牧兽医,2010,5(3): [2] 张海宝, 王学理, 吴金花, 等. 奶牛乳房炎链球菌 pgk 基因的克隆与序列分析 [J]. 中国病原生态学杂志,2011,26(2): [3] 钱科, 仇华磊, 孙怀昌. 致奶牛乳房炎链球菌快速鉴别及耐药试验用选择培养液的培养特性研究 [J]. 中国兽医杂志,2008,44(2): [4] 王晓兰, 王静梅, 剡跟强. 致奶牛乳房炎链球菌新疆分离株的 α 半乳糖苷酶酶活性测定及分析 [J]. 石河子大学学报,2011,29(3): [5] 刘兴华, 李宝玲. 奶牛乳房炎临床症状及预防措施 [J]. 奶牛杂志,2006(62): [6] 梁瑞琴, 刘强. 奶牛乳房炎链球菌的分离与鉴定 [J]. 畜牧与饲料科学,2009,30(2):64. [7] 芮萍, 马增军, 房海, 等. 奶牛乳房炎链球菌的耐药性检测 [J]. 动物医学进展,2011,32(1): ( 责任编辑 : 程智强 )

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