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1 年 月湖南师范大学自然科学学报 & & 第 卷第 期 < ( $ -(.#$ # ($ $ ) 7$.,#.- ' & 089& &. $& &&& 竹鼠志贺氏菌的分离及致病性研究 江华超 项 勋 高 辉 郑小惠 段 纲 常 华 云南农业大学动物医学院 中国昆明 摘 要 对云南某竹鼠养殖场发病死亡竹鼠进行肠道致病菌分离培养 经培养基分离纯化 革兰氏染色 生化鉴定 0 扩增以及测序分析 表明该致病菌为志贺氏菌 将纯化的菌株进行小鼠致病性研究和药敏试验分析 显示该菌对小鼠具有很强的致病作用 经病理切片观察发现该菌会引发多种器官及肠道充血或出血 该菌对喹诺酮类药物和头孢类药物高度敏感 关键词 竹鼠 志贺氏菌 分离鉴定 药敏试验 致病性研究中图分类号 & " 文献标识码 文章编号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竹鼠 以竹为食而得名 归属脊椎动物亚门 哺乳纲 啮齿目 竹鼠科 竹鼠属鼠类动物 主要栖息于我国中南部的竹林 马尾松林及山地阳坡草丛地下穴中 多昼伏夜出 竹鼠体大肉多 味道鲜美 营养丰富 毛皮绒厚柔软 具有较高的经济价值 竹鼠还具有很高的药用价值 竹鼠肉具有促进人体白血球和毛发生长 增强肝功能 防止血管硬化和延缓衰老等功效 鼠油可治疗烫伤 烧伤等病 近年来 竹鼠在中国被大规模养殖 已成为具有经济效益的养殖产业之一 但在其养殖过程中 肠杆菌科细菌的致病性影响一直严重威胁其生产品质 志贺氏菌也属于其中之一 只是关于竹鼠的研究报道较少 志贺氏菌是常见的肠道病原菌 归于肠杆菌科 志贺氏菌属 主要经口感染 最常见的症状是发烧 恶心 呕吐 胃抽筋 肠胃气胀 水泻或便秘 并能继发溶血性尿毒症 下行肾衰竭 中枢神经系统失调等 本试验从发病竹鼠肠道内容物分离得到志贺氏菌 对其进行形态 生化 测序 药敏以及致病性试验研究 为探讨 收稿日期 基金项目 国家重点研发计划专项资助项目 3 0 云南农业大学学生科技创新创业行动基金项目 3 通信作者 + ).! $1!(? & )

2 第 期 江华超等 竹鼠志贺氏菌的分离及致病性研究 志贺氏菌病的细菌学和分子生物学诊断提供科学依据 并通过动物攻毒试验进行该菌的致病性分析 为竹鼠养殖做好该菌的防治提供指导 8 材料与方法 98 样品来源 8 云南某竹鼠养殖场疑似肠道有细菌感染的病死竹鼠 剖解 挑取肠道内容物若干 9 8 培养基和试剂 6 肉汤 6 琼脂 麦康凯琼脂 革兰氏染色液 生化试剂购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司 药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司 细菌 0 提取 等相关试剂盒购于天根生化科技 北京 有限公司 细菌 0 通用引物购于生工生物工程 上海 股份有限公司 9'8 细菌的分离培养 纯化及形态鉴定 挑取采集的肠道内容物接种到 6 肉汤中 置于 恒温水浴摇床培养箱! 蘸取 6 肉汤培养的菌液划线接种到 6 琼脂上 置于 恒温培养箱培养! 观察菌落生长情况 再挑取 6 琼脂中典型的单个菌落分别接种到 6 肉汤中 置于 恒温水浴摇床培养! 蘸取 6 肉汤培养的菌液之字划线接种到麦康凯琼脂上 置于 恒温培养箱培养! 纯化培养后进行革兰氏染色 生化试 验及氧化酶鉴定试验 9 8! 分子生物学鉴定 挑取纯化培养的单个菌落接种于 6 肉汤中 摇床培养! 后吸取 菌液稀释 倍 按照煮沸法制备细菌 0 模板 利用细菌通用引物 进行 0 基因片段扩增 取细菌 0 模板 ) 的上下游引物各 & )) '1 & )) / * B 6( # & 7 * 0 聚合酶 & 加入灭菌超纯水至 反应参数 预变性 ).$ 变性 退火 延伸 ).$ 循环 次 终延伸 ).$ 取 反应产物 用 &@ 琼脂糖凝胶电泳经凝胶成像系统拍照 将阳性 扩增产物回收纯化后送生工生物工程 上海 股份有限公司测序 98 致病性研究 将鉴定好的菌株接种 * 6 血清肉汤 置于 恒温水浴摇床培养! 之后 ).$ 离心 ).$ 弃上清液 用无菌生理盐水制成细菌悬浮液 利用 & 麦氏比浊单位确定悬浮菌液的浓度为 & B 个 实验组 只小白鼠腹腔注射 & ) 菌液 对照组 只小白鼠腹腔注射 & ) 灭菌生理盐水 正常饲喂 周 观察其发病情况 并制作病理切片对比观察 将攻毒致死的小鼠固定在动物解剖台上 取心 肝 脾 肺 肾 肠 立即分装 的多聚甲醛中 / 及以上固定 固定好的组织取出 修整为 & ) 大小的均匀组织块 石蜡包埋 经切片后脱蜡水化 伊红染色后经脱水 透明并封片 镜检观察 9 8 药敏试验 8 采用纸片琼脂扩散法进行药敏分析 将纯化培养的菌液 涂布于不含抗生素的平板 再贴上药敏片 置于 恒温培养箱培养! 本试验采用的药物包括 环丙沙星 恩诺沙星 头孢氨苄 头孢吡喹 诺氟沙星 氨苄西林 林可霉素 复方新诺明 新霉素 万古霉素 氯霉素 四环素 卡那霉素 药敏试验以有 无抑菌环或抑菌圈 直径 )) 而定 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为准 按美国临床实验室标准化研究所 9 的标准判定为敏感 中敏 9 或耐药 8 98 形态鉴定 该菌在 6 琼脂生长呈两端顿圆 微凸 光滑湿润 边缘整齐 大小约为 & & )B ) 的小菌落 见图 彩图见封三 该菌在麦康凯培养基上长呈两端顿圆 微凸 光滑湿润 边缘整齐 中等大小 无色至粉红色大小的菌落 见图 6

3 !!!!!!!!!!!!!!!湖南师范大学自然科学学报!!!!!!!!!!!!!!!!!第 '" 卷 '' *V革兰氏染色镜检 该菌染色后经显微镜油镜下观察呈两端钝圆$中等大小$散在排列的红色! 革兰氏阴性杆菌 " 菌落$ 无芽 孢$无荚膜! 见图 "$彩图见封三" ( 图!!分离株在不同培养基的生长特征 图 *!分离株在革兰氏染色后光学显微镜油镜检 W!V^ ] 3 6 G 6A G W*VVP A PR A ^ A 6 9V生化试验V 该菌对葡萄糖'麦芽糖'蔗糖'半乳糖' 水杨素' 七叶苷' %+ 半乳糖苷' 棉子糖' 葡萄糖铵' 硝酸盐! 还原 " ' 氧化酶试验反应呈阳性$对乳糖'木糖'山梨醇'卫矛醇'鼠李糖'肌醇'苯丙氨酸'蛋白胨'鸟氨酸脱羧酶'赖氨 酸脱羧酶'<P 反应呈阴性*它不能利用丙二酸盐'西蒙氏枸橼酸盐或者葡萄糖酸盐作为唯一的碳源$ 在 k./ 中不生长$不能产生 S"?$不能分解尿素! 见表 $" ( 表!V生化试验 D7<W!VT 3 葡萄糖 水杨素 葡萄糖铵 乳糖 尿素 鸟氨酸脱羧酶 麦芽糖 七叶苷 赖氨酸脱羧酶 蔗糖 氰化钾 木糖 半乳糖苷 %+ 丙二酸盐 硫化氢 半乳糖 西蒙氏枸橼酸盐 硝酸盐! 还原" 山梨醇 葡萄糖酸盐 <P 卫矛醇 苯丙氨酸 氧化酶试验 鼠李糖 棉子糖 肌醇 蛋白胨水!!注&+, 标注为阳性$+, 标注为阴性,V!% #23&1鉴定V 将细菌 $*? H/Z,.O扩增产物进行 $8 #d琼脂糖凝胶 电泳$观察得知& 大约在 $ )## 1P 处出现一条明亮的 H/Z 片段$与目的片段相符! 见图 &" ( 将回收纯化后,.O产物 测序! 序列号为 9k&)-%*"" 与 ^ 6T 6_ 中参考菌 $*? H/Z基因核苷酸序列进行同源性比较分析得知$ 该菌 $*? H/Z基因核苷酸序列与基因 ^ 6 T 6_ 中志贺氏菌的核苷 酸序列同源性达到 %%8 -d( H/Z 序 列 在 /.TW比 对 同 源 性$ 并 在 将细 菌 $*? 9C^Z* 上构建系统进化树分析得知$ 该菌与杆菌类的 $*? 9&HN" ### 9 _ * $$"$& 均为分离菌 $*? H/Z扩增 H/Z基因同源性为 $##d$与志贺氏菌的 $*? H/Z基因同 H/Z,.O扩增 图 9!分离株 $*? 源性为 %-d! 见图 '" ( 根据上述生化鉴定方法' 核酸序列 W9V$*? H/Z,.O AP 以及构建进化树分析$确定该株菌为志贺氏菌( "V致病性研究 攻毒组小鼠在接种后 $" 3 开始发病$"' 3 全部发病$主要表现为背毛凌乱'呼吸急促'精神沉郁等症状*

4 第"期!!江华超等&竹鼠志贺氏菌的分离及致病性研究 ') 接种 &" 3 后个别小鼠开始排粘稠血便$后加剧呈脓血样$接种后 '- 3 开始死亡$连续观察 ( G$共死亡 & 只$ 其余 $ 只 ( G 时仍有腹泻症状存在( 对照组观察 ( G 均正常( 攻毒 ( 天后两组小鼠全部进行解剖观察$发现 所有发病和死亡小鼠病变均相似$肠道出血尤为严重$ 整个肠袢变为紫红色$ 水肿! 见图 )Z$ 彩图见封三 " ( 解剖对照组小鼠$肉眼观察无病变出现( H/Z序列经 9C^Z* 软件 /`方法构建的进化树分析 图,!分离菌 $*? 6 R 6 R $*? H/Z Y@ 6 G 1R9C^Z* ] /`A 3 G 将各脏器经组织病理学观察$将切片于 '# f$# 倍镜下观察$可见功毒组小鼠心肌出血和心肌细胞坏死$ 心肌纤维断裂! 图 )T" *肝细胞变性坏死和肝索破坏$ 肝窦扩张充血! 图 )." * 脾脏出血和淋巴细胞坏死! 图 )H" *肺泡毛细血管充血$间质增厚$肺泡腔内少量炎性渗出! 图 )C" *肾脏中肾间质出血$肾小管上皮细胞变 性$肾小管肿胀和消失! 图 )J" *肠绒毛断裂$肠粘膜肌层'固有层毛细血管出血$ 粘膜上皮细胞坏死$ 肠固有 层及黏膜下结缔组织有浸润的炎性细胞! 图 )^$S$W $` "( 图 "!小鼠被攻毒分离菌后的病理变化及组织学观察 W"V, 3 I 6G 3 I 1 D 6 A G 1 V药敏试验 恩诺沙星'诺氟沙星抑制志贺氏菌的直径为 "* AA$环丙沙星'头孢吡喹'头孢他啶'新霉素'头孢氨苄抑 制志贺氏菌的直径为 $% j") AA$万古霉素'氨苄西林抑制志贺氏菌的直径为 $' j$* AA$ 林可霉素' 复方新 诺明'氯霉素'四环素'卡那霉素对志贺氏菌没有抑制作用! 见表 "" ( 9V讨论 近年来志贺菌在人类感染上报道较多$但在动物上主要是感染禽类$ 在竹鼠上报道较少( 本研究中$ 志 贺氏菌是从发病或死亡竹鼠的肠道中分离出的$经过形态和生化鉴定'$*? H/Z测序分析证明了该分离菌 与参考菌株志贺氏菌同源性较高$达 %-d$表明分离到一株竹鼠源性志贺氏菌(

5 湖南师范大学自然科学学报 第 卷 志贺氏菌是肠道病原菌 可经口感染 这使得养殖场竹鼠发病率较高 而且症状主要是肠胃气胀 水泻 死亡率较高 但该菌的致病性未得到证实 所以本研究将该菌进行了动物试验 通过动物回归试验得知 该菌具有较强的感染力 小鼠被攻毒后主要表现为消化道出血 其中肠道出血尤为严重 这与送检竹鼠剖检完全一致 该致病细菌可能从食物中传播 如果将发病未死亡的竹鼠作为食物有可能将该菌传播给其它动物或人类 因此该菌在兽医公共卫生中应被视为危险的致病微生物 药敏试验分析表明 该菌对头孢吡喹 头孢他啶 头孢氨苄 诺氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星 新霉素敏感 此为该竹鼠养殖场合理用药提供了理论依据 表 8 药敏试验,% 9 80 (1 ( # # - # ( - 药物名称 直径 )) 药物名称 直径 )) 头孢吡喹 复方新诺明 头孢他啶 新霉素 头孢氨苄 卡那霉素 诺氟沙星 万古霉素 9 恩诺沙星 林可霉素 环丙沙星 氯霉素 氨苄西林 9 四环素 注 按美国临床实验室标准化研究所 9 的标准判定为敏感 中敏 9 或耐药 参考文献 刘克俊 万火福 张文明 等 & 竹鼠养殖业现状 前景及发展对策 < & 广西畜牧兽医 & + < G7&+ $ ). $.) ##/.$1) $ 1#)#$- $/ 2 2# - ) - < & ##/ #, & 8' 88 &!.1#. ' & $/ $ + #,.# 9$ & 付 叶妍琳 张海燕 等 & 竹鼠腹泻肠道细菌分离鉴定与药敏试验 < & 黑龙江畜牧兽医 & 崔庆刚 杨志远 杜永新 等 & 志贺氏菌的生化特性及检测方法的研究进展 < & 上海畜牧兽医通讯 & + &6.!#). -# -./#$ $ )#/. -#. < &<.$ -! & ' 009 < &6.!#). -# -./#$ $ )#/. -#. ' & # 3 -. $ /#) # & 徐义刚 李丹丹 刘忠梅 等 & 应用 0 8 方法特异性检测志贺氏菌 < & 中国畜牧兽医 & 王海艳 赵治国 崔 强 等 & 志贺氏菌检测和分群 方法的建立 < & 中国动物检疫 & ) & #$.-.,.-.$/# $-.).. 1#$- $# - # -)#$-.-#. 2 2 #/ -. $ ( # $-.).. < &9$/. $ <'#/ '.. & 周晓坤 马 佳 姚冬梅 等 & 合理利用药敏试验选择抗菌药 < & 中国执业药师 & 马筱玲 & 抗菌药物敏感性试验执行标准解读 < & 临床检验杂志 & 吕文强 & 人源福氏志贺菌对雏鸡的致病性及鸡肠组织 基因表达特性研究 0 & 郑州 河南农业大学 & 康静静 杨玉荣 梁宏德 & 志贺氏菌病发病机制的研究进展 < & 中国农业科学 & 吴德英 & 痢疾杆菌的药敏试验 < & 临床医药文献电子杂志 & 编辑 <

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