由振源等 : 利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型 1005 体 CXCR4 抗体 ( 购自 BD 公司 ), 其余试剂均为国产分析纯 Beckman EPICS XL 流式细胞仪 1.2 细胞培养购得 HCT116 细胞, 由本实验室传代保存细胞在 37 ºC 5%

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逸樊
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2012, 34(10): 技术与方法利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型由振源陈丹扬刘楚琪袁慧敏王红胜杜军 * ( 中山大学药学院微生物与生化药学实验室, 广州 ) 摘要该研究利用 TNF-α 诱导建立肿瘤细胞体外侵袭模型, 为进一步的研究提供基础利用 20 ng/ml TNF-α 刺激结肠癌细胞 HCT116 7 d 后, 使用流式细胞术检测 HCT116 细胞的 CCR7 和 CXCR4 受体表达量的变化, 并利用 Transwell 小室检测 TNF-α 刺激对 CCL21 SDF-1 介导的细胞迁移与侵袭能力的影响实验结果显示, 20 ng/ml TNF-α 刺激 7 d 后的 HCT116 细胞的 CCR7 和 CXCR4 表达量均显著增加, 侵袭能力也增强, 且使 CCL21 SDF-1 介导的细胞迁移与侵袭能力显著增强结果说明了本实验利用 TNF-α 诱导 HCT116 细胞, 成功建立了 HCT116 的体外侵袭模型, 为接下来的研究提供了细胞模型基础, 也为进一步的药物筛选提供了基础关键词 TNF-α; CCR7; CXCR4; 侵袭模型结肠癌在全球女性中是第二大常见癌症, 男性 [1] 中是第三大常见癌症, 多发于发达国家虽然随着医学的发展, 手术治疗的治愈率有所提高, 但肿瘤的侵袭与转移仍是导致结肠癌患者死亡的最主要原 [2] 因, 因此在细胞水平上模拟建立结肠癌细胞侵袭转移的模型, 对于探究肿瘤侵袭转移能力的机理, 筛选抑制肿瘤细胞侵袭转移能力的抗癌药物具有重要意义近年来研究发现, 结肠癌患者自身分泌的 TNF-α 增多, 且与结肠癌细胞侵袭转移能力的增强呈正相 [3] 关此外, 用低剂量的 TNF-α 刺激多种肿瘤细胞, [4] [5] 如肾脏上皮癌细胞胰腺癌细胞, 均能够明显促进细胞发生侵袭转移以上研究结果表明, 利用 TNF-α 可能诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭转移模型研究表明, 在结肠癌中趋化因子受体 CCR7 [6-7] 和 CXCR4 [8] 的过表达与细胞的侵袭和转移能力的增 [9] 强有密切的关系, 可以用作为判断结肠癌肿瘤细 [10] 胞侵袭和转移情况的检测指标而趋化因子受体 CCR7 与其配体 CCL21 [11] 受体 CXCR4 与其配体 SDF-1 [12] 的结合则是促进结肠癌肿瘤细胞侵袭和转移到特定部位过程中的一个更为重要的因素趋化因子受体及其配体的结合, 进一步增强肿瘤细胞的迁移能力 [13], 亦可作为一项判断肿瘤细胞侵袭转移能力的重要指标本研究采用人结肠癌细胞 HCT116 为研究对象, 以低剂量的 TNF-α 刺激后的细胞形态学变化趋化因子受体 CCR7 和 CXCR4 表达量变化以及 CCL21 和 SDF-1 的诱导作用为指标, 判断细胞侵袭能力的变化, 从而探讨利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型的可能性 1 材料与方法 1.1 材料与主要仪器 HCT116 细胞株 ( 购自上海细胞库 ), RPMI-1640 培养基 FBS( 购自 Gibco 公司 ), 青霉素链霉素双抗液 ( 购自 Beyotime 公司 ), TNF-α( 购自 Protech 公司 ), Transwell 小室 ( 直径 6.5 mm, 孔径 8 μm, 购自 Costar 公司 ), 苏木素 ( 购自南京建成科技有限公司 ), CCR7 抗收稿日期 : 接受日期 : 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )(No.2011CB ) 国家大学生创新性实验计划 (No ) 和国家自然科学基金 (No ) 资助项目 * 通讯作者 Tel: , Fax: , dujun@ mail.sysu.edu.cn

2 由振源等 : 利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型 1005 体 CXCR4 抗体 ( 购自 BD 公司 ), 其余试剂均为国产分析纯 Beckman EPICS XL 流式细胞仪 1.2 细胞培养购得 HCT116 细胞, 由本实验室传代保存细胞在 37 ºC 5% CO 2 条件下, 置于含有 10% 胎牛血清含青霉素链霉素双抗液 (1:100) 的 RPMI-1640 培养基中培养, 取处于对数生长期, 状态良好的细胞用于实验 1.3 TNF-α 刺激 7 d 后, 形态变化观察取处于对数生长期的 HCT116 细胞, 铺至 6 孔板 (5% FBS), 接种密度为 /ml, 第 2 d 换液并加入 20 ng/ml 的 TNF-α 刺激, 连续作用 7 d 1.4 流式细胞术检测 CCR7 和 CXCR4 受体变化用 TNF-α 20 ng/ml 连续刺激 HCT116 细胞 7 d 后, 将细胞用 0.25% 胰酶消化成单细胞悬液于 EP 管中, 用 PBS 洗一遍, r/min 离心 4 min, 弃上清, 加入 100 μl PBS, 打匀, 留一管作对照, 其余加 10 μl CCR7 抗体, 迅速打匀后, 避光静置 30 min, 加入 500 μl PBS, r/min 离心 4 min, 弃上清, 加入 500 μl PBS, 打匀, 以不加 TNF-α 的细胞作为对照, 用流式细胞仪检测细胞 CCR7 受体的表达量的变化 CXCR4 受体的表达量依同样方法测定 1.5 Transwell 小室检测 HCT116 侵袭能力的变化 CCL21 对 HCT116 侵袭能力的影响在 Transwell 的下室中加入适量培养基, 浸泡过膜, 放入细胞培养箱中过夜活化, 空白组细胞和用 TNF-α 刺激 7 d 组细胞无血清培养 24 h 后, 制备成密度为 /ml 的细胞悬液, 并加至 Transwell 上室 (100 μl), 下室加入 CCL21 重组蛋白 70 ng/ml, 含有 3% FBS 培养基 600 μl; 37 ºC, 5% CO 2 条件下孵育 3 h, 取出 Transwell 上室, 用 4% 多聚甲醛固定细胞, 苏木素染色, 于显微镜下随机选取 5 个视野 (200 ), 计 Transwell 膜背面细胞数, 用平均值进行统计, 分析细胞的趋化活性的变化 SDF-1 对 HCT116 侵袭能力的影响如步骤, 空白组细胞和用 TNF-α 刺激 7 d 组细胞无血清培养 24 h, 制备成密度为 /ml 的细胞悬液, 并加至 Transwell 上室 (100 μl), 下室加入 SDF-1 重组蛋白 80 ng/ml, 含有 3% FBS 培养基 600 μl; 37 ºC 5% CO 2 条件下孵育 3 h, 取出 Transwell 上室, 用 4% 多聚甲醛固定细胞, 苏木素染色, 于显微镜下随机选取 5 个视野 (200 ), 计 Transwell 膜背面细胞数, 用平均值进行统计, 分析细胞的趋化活性的变化 1.6 统计学处理使用 SPSS 13.0 软件进行数据统计分析, 数据均用 mean±s.d. 表示样本均数间进行 t 检验 P<0.05 时认为差异具有统计学意义其余数据用 Excel 2007 软件进行分析 2 结果 2.1 TNF-α 刺激后细胞侵袭能力增强低剂量 TNF-α(20 ng/ml) 连续刺激 HCT116 细胞 7 d 后, 细胞形态间质化明显, 即由不规则多边形转变为长梭形 ( 图 1) A: HCT116 细胞 ; B: 20 ng/ml TNF-α 刺激 7 d 后的 HCT116 细胞 A: HCT116 cells; B: HCT116 cells stimulated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days. 图 1 20 ng/ml TNF-α 刺激 7 d 后 HCT116 形态的变化 Fig.1 The change of HCT116 morphology after stimulated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days 2.2 TNF-α 上调 HCT116 中 CCR7 和 CXCR4 受体的表达 CCR7 受体流式检测如图 2 所示, 在低浓度 TNF-α(20 ng/ml) 刺激 7 d 后, HCT116 细胞的 CCR7 受体表达密度较空白组提高了 15.2% CXCR4 受体流式检测如图 3 所示, 在低浓度 TNF-α(20 ng/ml) 刺激 7 d 后, HCT116 细胞的 CXCR4 受体表达密度较空白组提高了 20.3% 2.3 TNF-α 促进 CCL21 SDF-1 介导的 HCT116 迁移与侵袭的作用 TNF-α 促进 CCL21 介导的迁移与侵袭的作用为了进一步证实 TNF-α 可增强结肠癌细胞 HCT116 的迁移能力, 采用 Transwell 小室实验其结果如图 4 所示, 20 ng/ml 的 TNF-α 刺激 7 d 后, CCL21 诱导 HCT116 细胞迁移及侵袭能力明显增强 TNF-α 促进 SDF-1 介导的迁移与侵袭的作用影响如图 5 所示, Transwell 小室的结果显示,

技术与方法 1006 A: 空白对照组; B: 20 ng/ml TNF-α 刺激7 d的hct116细胞与空白对照组的比较 A: control; B: comparison of HCT116 stimulated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days with control. 图2 流式细胞术检测CCR7在TNF-α刺激7 d后的hct116细胞的表达 Fig.

3 技术与方法 1006 A: 空白对照组; B: 20 ng/ml TNF-α 刺激7 d的hct116细胞与空白对照组的比较 A: control; B: comparison of HCT116 stimulated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days with control. 图2 流式细胞术检测CCR7在TNF-α刺激7 d后的hct116细胞的表达 Fig.2 The expression of CCR7 receptors detected by flow cytometry for 7 days A: 空白对照组; B: 20 ng/ml TNF-α 刺激7 d的hct116细胞与空白对照组的比较 A: control; B: comparison of HCT116 stimulated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days wtih control. 图3 流式细胞术检测CXCR4在TNF-α刺激7 d后的hct116细胞的表达 Fig.3 The expression of CXCR4 receptors detected by flow cytometry for 7 days A: 空白细胞, 下室未加趋化因子刺激; B: 空白细胞, 下室加CCL21刺激; C: TNF-α刺激7 d, 下室加CCL21刺激 A: HCT116 cells without any stimulation; B: HCT116 cells stimulated by CCL21 in lower chamber; C: HCT116 cells stimulated by TNF-α for 7 days then stimulated by CCL21 in lower chamber. Fig.4 图4 CCL21增强HCT116细胞迁移能力 CCL21 facilitates the invasiveness and migration of HCT116

1007 由振源等: 利用TNF-α诱导建立结肠癌细胞HCT116体外侵袭模型 A: 空白细胞, 下室未加趋化因子刺激; B: 空白细胞, 下室加SDF-1刺激; C: TNF-α刺激7 d, 下室加SDF-1刺激 A: HCT116 cells without any stimulation; B: HCT116 cells stimulated by SDF-1 in lower

4 1007 由振源等: 利用TNF-α诱导建立结肠癌细胞HCT116体外侵袭模型 A: 空白细胞, 下室未加趋化因子刺激; B: 空白细胞, 下室加SDF-1刺激; C: TNF-α刺激7 d, 下室加SDF-1刺激 A: HCT116 cells without any stimulation; B: HCT116 cells stimulated by SDF-1 in lower chamber; C: HCT116 cells stimulated by TNF-α for 7 days then stimulated by SDF-1 in lower chamber. 图5 SDF-1增强HCT116细胞迁移能力 Fig.5 SDF-1 facilitates the invasiveness and migration of HCT ng/ml的tnf-α刺激7 d后, SDF-1诱导HCT116细研究表明, 恶性肿瘤倾向于特异性地转移到某些组织器官, 而趋化因子及其受体的特异性表达是胞迁移及侵袭能力明显增强其中一个重要的因素[20] 已有研究表明, CCR7与 3 讨论 CXCR4的表达与肿瘤细胞的转移有着密切的关 TNF-α是由单核巨噬细胞内皮细胞产生的系 [8] 在本研究中, 我们利用流式细胞术可以检测一种多功能细胞因子, 在正常情况下, 具有抗肿瘤到在TNF-α的刺激下, 受体CCR7及CXCR4的表达密抗感染等作用但如果持续释放或外源过多的加度明显增加, 但其产生的机制尚不清楚入, 就会产生广泛的病理效应研究表明, 高浓度 CCL21和 SDF-1分别是 CCR7和 CXCR4的配 TNF-α能诱导肿瘤细胞凋亡, 具有免疫调节等多种体, Transwell小室实验结果显示了分别在CCL21 生物学功能, 并对肿瘤细胞有细胞毒作用, 而低浓度 SDF-1的介导下, HCT116细胞的穿膜能力明显增强, TNF-α可以诱导肿瘤细胞发生侵袭行为, 并且近且TNF-α刺激后的细胞在CCL21及SDF-1的作用下年研究发现TNF-α在多种恶性肿瘤患者血清中显著穿膜能力进一步增强此外, 本研究结果也提示了 [14] [15-19] 升高, 与肿瘤的发生进展及预后有一定关系结肠癌患者的TNF-α mrna表达量比正常者高, 自身分泌的TNF-α增多, 刺激细胞内相关分子的活化, 在TNF-α诱导的肿瘤细胞迁移与侵袭过程中, CCR7/ CCL21及CXCR4/SDF-1生物轴可能发挥了重要作用本研究结果显示在TNF-α刺激下, 结肠癌细胞进而促进结肠癌细胞发生侵袭转移在本研究中, HCT116的CXCR4和CCR7受体的表达量增加, 细胞我们利用20 ng/ml TNF-α连续刺激HCT116细胞7 d, 的侵袭能力增强, 可以由此建立结肠癌细胞HCT116 成功建立了结肠癌细胞体外侵袭模型, 为进一步研体外侵袭模型虽然所建的模型存在一定的局限性, 究肿瘤细胞转移的机制筛选抗肿瘤药物奠定了比如TNF-α作为体外细胞刺激因子诱导的EMT未能基础完全模拟肿瘤在体内EMT发生的过程, 而且利用其 [3]

5 1008 技术与方法他细胞因子如 TGF-β 等也可以诱导肿瘤细胞 EMT 的发生, 然而本研究建立的 TNF-α 诱导肿瘤细胞 EMT 模型具备如下优点 : (1) 刺激条件较简单, 即在细胞正常生长的条件下, 用低剂量的 TNF-α 刺激 ; (2) 建模时间较短, 在 TNF-α 诱导 7 d 就可以明显地观察出变化, 效果明显, 有较高的可重复性因此, 利用其探讨肿瘤转移的分子机制简单方便, 且可以将该肿瘤细胞体外侵袭模型广泛地应用于药物的筛选参考文献 (References) 1 Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011; 61(2): Bates RC, Mercurio AM. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) and colorectal cancer progression. Cancer Biol Ther 2005; 4(4): Bates RC, Mercurio AM. Tumor necrosis factor-alpha stimulates the epithelial-to-mesenchymal transition of human colonic organoids. Mol Biol Cell 2003; 14(5): Wu ST, Sun GH, Hsu CY, Huang CS, Wu YH, Wang HH, et al. Tumor necrosis factor-alpha induces epithelial-mesenchymal transition of renal cell carcinoma cells via a nuclear factor kappa B-independent mechanism. Exp Biol Med 2011; 236(9): Maier HJ, Schmidt-Strassburger U, Huber MA, Wiedemann EM, Beug H, Wirth T. NF-kappaB promotes epithelial-mesenchymal transition, migration and invasion of pancreatic carcinoma cells. Cancer Lett 2010; 295(2): Yu S, Duan J, Zhou Z, Pang Q, Wuyang J, Liu T, et al. A critical role of CCR7 in invasiveness and metastasis of SW620 colon cancer cell in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther 2008; 7(7): Gunther K, Leier J, Henning G, Dimmler A, Weissbach R, Hohenberger W, et al. Prediction of lymph node metastasis in colorectal carcinoma by expression of chemokine receptor CCR7. Int J Cancer 2005; 116(5): Wang SC, Lin JK, Wang HS, Yang SH, Li AF, Chang SC. Nuclear expression of CXCR4 is associated with advanced colorectal cancer. Int J Colorectal Dis 2010; 25(10): Schimanski CC, Schwald S, Simiantonaki N, Jayasinghe C, Gonner U, Wilsberg V, et al. Effect of chemokine receptors CXCR4 and CCR7 on the metastatic behavior of human colorectal cancer. Clin Cancer Res 2005; 11(5): 姜文营, 张建良, 纪志鹏, 傅勤烨, 周勇, 丁印鲁. 趋化因子受体 CCR7 及 CXCR4 在结肠癌组织中的表达及意义. 中国现代普通外科进展 (Jiang Wenying, Zhang Jianliang, Ji Zhipeng, Fu Qinye, Zhou Yong, Ding Yinlu. Expression of chemokine receptor CCR7 and CXCR4 in human colorectal carcinoma and its significance. Chin J Curr Adv Gen Surg) 2009; 12(7): Sun RH, Wang GB, Li J, Cui J. Role of CCL21/CCR7 in invasion of colorectal carcinoma cell line SW480. Ai Zheng 2009; 28(7): Wang L, Li CL, Wang L, Yu WB, Yin HP, Zhang GY, et al. Influence of CXCR4/SDF-1 axis on E-cadherin/beta-catenin complex expression in HT29 colon cancer cells. World J Gastroenterol 2011; 17(5): 杨润祥, 马飞, 张灿珍. 趋化因子及其受体在肿瘤转移中的作用. 中国医学文摘肿瘤学 ( Yang Runxiang, Ma Fei, Zhang Chanzhen. Journal of Chinese Medical Abstracts Oncology) 2006; 20(1): Szlosarek P, Charles KA, Balkwill FR. Tumour necrosis factoralpha as a tumour promoter. Eur J Cancer 2006; 42(6): Ariapart P, Bergstedt-Lindqvist S, van Harmelen V, Permert J, Wang F, Lundkvist I. Resection of pancreatic cancer normalizes the preoperative increase of tumor necrosis factor alpha gene expression. Pancreatology 2002; 2(5): Friess H, Guo XZ, Nan BC, Kleeff J, Büchler MW. Growth factors and cytokines in pancreatic carcinogenesis. Ann N Y Acad Sci 1999; 880: 马洪, 宋宇峰, 杨建斌, 冯红超. 肿瘤坏死因子 -α 在口腔鳞癌中的表达及临床意义. 实用口腔医学杂志 (Ma Hong, Song Yufeng, Yang Jianbin, Feng Hongchao. Journal of Practical Stomatology) 2007; 23(1): 贾友鹏, 巩鹏, 王忠裕, 单显民. TNF-α 及其受体 Ⅰ 在胆管癌和先天性胆总管胰囊性扩张症中的表达及意义. 中国普通外科杂志 (Jia Youpeng, Gong Peng, Wang Zhongyu, Shan Xianmin. Chinese Journal of General Surgery) 2007; 16(2): 曹杰, 陈孝平. 核因子 -KappaB 与肿瘤坏死因子 α mrna 在肝细胞癌中的表达及意义. 中国普通外科杂志 (Cao Jie, Chen Xiaoping. Activation of nuclear factor-κb and expression of tumor necrosis factor-α mrna in hepatocelluar carcinoma. Chinese Journal of General Surgery) 2007; 16(3): Wang J, Wang J, Sun Y, Song W, Nor JE, Wang CY, et al. Diverse signaling pathways through the SDF-1/CXCR4 chemokine axis in prostate cancer cell lines leads to altered patterns of cytokine secretion and angiogenesis. Cell Signal 2005; 17(12):

由振源等 : 利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型 1009 Establish An in vitro HCT116 Human Colon Cancer Cell Invasion Model by TNF-α You Zhenyuan, Chen Danyang, Liu Chuqi, Yuan Huimin, Wang Hongsheng, Du Jun*

6 由振源等 : 利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型 1009 Establish An in vitro HCT116 Human Colon Cancer Cell Invasion Model by TNF-α You Zhenyuan, Chen Danyang, Liu Chuqi, Yuan Huimin, Wang Hongsheng, Du Jun* (Department of Microbial and Biochemical Pharmacy, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou , China) Abstract This research focused on establishing an in vitro HCT116 cells invasion model for drug screening. In this study, HCT116 human colon cancer cells were treated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days, then the expression of CCR7 and CXCR4 receptors were detected by flow cytometry. The cell invasion ability of CCL21 and SDF- 1 was further evaluated by transwell chamber. After stimulated by 20 ng/ml TNF-α for 7 days, the expression of CCR7 and CXCR4 increased significantly which facilitated the migration of HCT116. Furthermore, the CCL21 and SDF-1 could enhance the cell invasiveness. The results of this study demonstrate that the invasiveness of HCT116 can be enhanced by TNF-α, so that it can be used to establish an invasion model in vitro for drug screening. Key words TNF-α; CCR7; CXCR4; invasion model Received: July 6, 2012 Accepted: August 3, 2012 This work is supported by National Basic Research Program of China (973 Program, No.2011CB ), the National University Student Innovation Program (No ) and the National Natural Science Foundation of China (No ) *Corresponding author. Tel: , Fax: , dujun@mail.sysu.edu.cn ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 勘误声明 2012 年 34 卷第 7 期 704 页第 4 行原文 lncdna, 应为 lncrna, 特此更正 2012 年 34 卷第 8 期 800 页图 8 应为 :

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<D2BDC1C6BDA1BFB5CDB6C8DAD7CAB8DFB7E5C2DBCCB3B2CEBBE1C3FBB5A52E786C7378> 参会人员名单 Last Name 姓名公司 Tel Fax Bai 柏煜康复之家 8610 8761 4189 8610 8761 4189 Bai 白威久禧道和股权投资管理 ( 天津 ) 有限公司 8610 6506 7108 8610 6506 7108 Bao 包景明通用技术集团投资管理有限公司 8610

由振源等 : 利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型 1005 体 CXCR4 抗体 ( 购自 BD 公司 ), 其余试剂均为国产分析纯 Beckman EPICS XL 流式细胞仪 1.2 细胞培养购得 HCT116 细胞, 由本实验室传代保存 细胞在 37 ºC 5%

由振源等 : 利用 TNF-α 诱导建立结肠癌细胞 HCT116 体外侵袭模型 1005 体 CXCR4 抗体 ( 购自 BD 公司 ), 其余试剂均为国产分析纯 Beckman EPICS XL 流式细胞仪 1.2 细胞培养购得 HCT116 细胞, 由本实验室传代保存细胞在 37 ºC 5%