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1 第 8 卷第 11 期食品安全质量检测学报 Vol. 8 No 年 11 月 Journal of Food Safety and Quality Nov., 2017 气相色谱 - 质谱联用法分析茶枝柑籽油脂肪酸和不皂化物组成 杨春英 *, 刘学铭, 池建伟, 陈智毅 ( 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所, 农业部功能食品重点实验室, 广东省农产品加工重点实验室, 广州 ) 摘要 : 目的研究茶枝柑籽油的脂肪酸和不皂化物成分 方法采用气相色谱 - 质谱联用 (gas chromatographymass spectrometry, GC-MS) 法对茶枝柑籽油脂肪酸和不皂化物成分进行分析和鉴定 结果共分离鉴定出 13 种脂肪酸, 不饱和脂肪酸占 67.62%, 其中最主要的脂肪酸为亚油酸和油酸, 相对含量分别为 36.93% 和 26.91% 茶枝柑籽油的不皂化物以植物甾醇 生育酚和萜类化合物为主, 其中 β- 谷甾醇含量最高, 达 mg/kg 结论 本研究为茶枝柑籽油作为功能性油脂的开发利用提供了基础数据 关键词 : 茶枝柑 ; 脂肪酸 ; 不皂化物 ; 植物甾醇 Analysis of fatty acid and unsaponifiable matter in Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil by gas chromatography-mass spectrometry YANG Chun-Ying *, LIU Xue-Ming, CHI Jian-Wei, CHEN Zhi-Yi (Sericultural & Agri-Food Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture, Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou , China) ABSTRACT: Objective To investigate the fatty acid and unsaponifiable matters components in Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil. Methods The fatty acids composition and unsaponifiable matters of Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil were separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results Totally 13 kinds of fatty acids were found, containing 67.62% unsaturated fatty acids. The main fatty acids were linoleic acid and oleic acid, and the relative contents were 36.93% and 26.91%, respectively. Phytosterols, tocopherols and terpenoids were main unsaponifiable components, in which β-sitosterol was the dominant compound up to mg/kg. Conclusion This study provides basic data for the development and utilization of Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil as functional food. KEY WORDS: Citrus reticulata cv. Chachiensis; fatty acid; unsaponifiable matter; phytosterol 基金项目 : 广东省省部产学研合作专项项目 (2013B , 2013B ) 广东省协同创新与平台环境建设项目(2015A ) Fund: Supported by Guangdong Provincial Department of Production and Research Cooperation Project (2013B , 2013B ) and Guangdong Province Collaborative Innovation and Platform Environment Construction Project (2015A ) * 通讯作者 : 杨春英, 硕士, 助理研究员, 主要研究方向为食品化学 ychying@163.com *Corresponding author: YANG Chun-Ying, Master, Assistant Professor, Sericultural & Agri-Food Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou , China. ychying@163.com

2 第 11 期杨春英, 等 : 气相色谱 - 质谱联用法分析茶枝柑籽油脂肪酸和不皂化物组成 引言 茶枝柑 (Citrus reticulata cv. Chachiensis), 别名大红柑 新会柑, 芸香科柑橘属植物, 主产于广东新会, 已有 700 多年栽培历史, 其果皮具有重要药用和食疗价值, 被历代众多名医家所推崇, 奉为道地药材 [1,2] 目前茶枝柑产业中, 种植茶枝柑目的是取其果皮制作中药材广陈皮, 占比重超过 80% 的果肉 ( 含果籽 ) 大多是作抛弃处理, 仅少部分果籽作为中药材使用 [3] 茶枝柑果肉味酸籽多, 富含糖类 有机酸等营养物质, 直接丢弃不仅浪费资源, 且造成了严重的环境污染, 迫切需要开展茶枝柑深加工技术研究和开发新产品 橘核 (Semen Citri Reticulatae) 为芸香科植物橘 (Citrus reticulata Blanco) 及其栽培变种的干燥成熟种子, 具有理气, 散结, 止痛等功效 [4] 研究表明, 橘核富含油脂 蛋白质及 K Ca P Na Fe Mg 等矿质元素, 但当前关于橘核的研究报道主要集中在其药用功效和柠檬苦素及其类似物上 [5-7], 关于其油脂中脂肪酸组成报道不多, 不皂化物中活性成分 ( 角鲨烯 植物甾醇 脂溶性维生素等 ) 鲜有报道 而关于茶枝柑的报道几乎都以茶枝柑皮为研究对象, 故本研究采用气相色谱 - 质谱联用 (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 法对茶枝柑籽油 ( 茶枝柑橘核油 ) 的脂肪酸组成和不皂化物 ( 主要是角鲨烯和植物甾醇 ) 进行了分析和鉴定, 为茶枝柑的综合利用提供参考依据 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 角鲨烯 ( 98%) 豆甾醇 (( 95%) β- 谷甾醇 ( 98%) 菜籽甾醇 ( 90%) 和菜油甾醇 ( 93%) 标准品 ( 美国 Chromadex 公司 ); 正己烷 甲醇和无水乙醇 ( 色谱纯, 美国 Fisher 公司 ); 氢氧化钾和无水硫酸钠 ( 优级纯, 科密欧公司 ); 抗坏血酸和乙醚 ( 分析纯, 科密欧 ); 所用水为超纯水 6890N/5975B 气相色谱 - 质谱联用仪 ( 美国 Agilent 公司 ); SOX 416 Macro 全自动脂肪测定仪 ( 德国 Gerhardt 公司 ) 2.2 试验方法 样品预处理取新鲜的茶枝柑去皮后分离果肉和果籽, 收集果籽洗干净于 45 烘箱中干燥至恒重, 粉碎成粉末备用 茶枝柑籽油的提取与粗脂肪含量测定参考 GB/T 食品中粗脂肪的测定, 准确称取一定量的茶枝柑籽粉, 采用全自动脂肪测定仪提取脂肪, 恒重后所得即为茶枝柑籽油, 计算其含油率 茶枝柑籽油脂肪酸组成分析 [8,9] (1) 样品甲酯化准确称取 0.5 g 茶枝柑籽油于 10 ml 具塞玻璃试管中, 加入 5.0 ml 0.5 mol/l 氢氧化钠 - 甲醇溶液, 涡旋混合 20 s, 每 5 min 摇匀一次, 室温下反应 40 min, 加入 5.00 ml 正己烷, 摇匀, 静置分层, 取上层清液加入 0.5 g 无水硫酸钠干燥, 0.22 μm 过滤器过滤后进行 GC-MS 分析 (2) 气相色谱条件色谱柱 : J&W DB-WAX 毛细管色谱柱 (30 m 0.25 mm, 0.25 μm); 进样口温度 : 250 ; 进样量 : 1.0 µl, 分流比为 20:1; 载气 : 高纯氦气, 流速为 1.0 ml/min; 程序升温 : 初始温度 180, 保持 5 min, 以 3 /min 升温速率升至 230, 保持 15min (3) 质谱条件 EI 离子源, 电子能量 70 ev; 离子源温度 230 ; 四极杆温度 150 ; 传输线温度 280 ; 质量范围 30~450 amu, 全扫描方式 ; 溶剂延迟 3 min [10] 茶枝柑籽油不皂化物 ( 角鲨烯和植物甾醇 ) 分析 (1) 不皂化物制备准确称取 g 茶枝柑籽油于 100 ml 具塞三角瓶中, 分别加入 30 ml 无水乙醇, 2.5 ml 20% 抗坏血酸溶液, 3.00 ml 50% 氢氧化钾溶液, 置 80 水浴边加热边震荡 45 min 使其皂化, 皂化完全后立即将皂化试液放入冰水浴中冷却 将皂化试液转移至 250 ml 分液漏斗中, 用 40 ml 超纯水分 3 次洗涤皂化用的三角瓶, 洗液并入分液漏斗中 加入 40 ml 乙醚萃取, 重复 3 次, 合并乙醚萃取液, 用超纯水洗涤至中性, 过无水硫酸钠除去残留水分 萃取液于 50 水浴中减压浓缩并回收乙醚, 残渣用少量乙醚洗至 5 ml 带刻度试管中, 氮气吹干, 残留物用 2.00 ml 无水乙醇复溶, 经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后进 GC-MS 分析 (2) 气相色谱条件色谱柱 : J&W DB-5MS UI 毛细管色谱柱 (30 m 0.25 mm, 0.25 μm); 进样口温度 : 280 ; 进样量 : 1.0 µl, 分流比为 10:1; 载气 : 高纯氦气, 流速为 1.0 ml/min; 程序升温 : 初始温度 180, 以 15 /min 升温速率升至 280, 保持 25 min (3) 质谱条件 EI 离子源, 电子能量 70 ev; 离子源温度 230 ; 四极杆温度计 150 ; 传输线温度 280 ; 质量范围 30~550 amu, 全扫描方式 ; 溶剂延迟 2 min 3 结果与分析 采用 方法测得茶枝柑的干籽含油率为 [11] (32.27±1.06)%, 与文献报道 (36.6%) 相符 可见, 茶枝柑籽有可能成为一种油料资源开发利用 3.1 茶枝柑籽油脂肪酸组成分析 茶枝柑籽油经甲酯化处理后进行 GC-MS 分析, 图 1 茶枝柑籽油脂肪酸甲酯总离子流图 经 NIST11 质谱库检

3 4420 食品安全质量检测学报第 8 卷 索并结合人工谱图解析, 样品质谱图与标准谱图对比, 相似度 95% 时确认为该种化合物, 总共分离鉴定出 13 种脂肪酸 参考 GB/T , 用峰面积归一化法计算每种脂肪酸相对质量分数, 结果见表 1 由表 1 结果可见, 茶枝柑籽油以棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸及亚麻酸为主体脂肪酸, 亚油酸含量最高 (36.93%), 其次是油酸 (26.91%), 棕榈酸 硬脂酸和亚麻酸的含量分别为 24.04% 6.59% 和 3.21%, 其余 8 种脂肪酸含量相对较低, 均小于 0.67% 其中不饱和脂肪酸占 67.62%, 人体必需脂肪酸占 40.14% 研究结果在脂肪酸种 [11] 类上比吴永成等报道多, 同一种脂肪酸的含量接近 研究所选用的茶枝柑籽油中的脂肪酸成分与其它柑橘类橘核 ( 籽 ) 油脂肪酸成分有较大的差异 [12,13], 可能与品种 产地及生长的气候条件不同有关 油酸 亚油酸及亚麻酸等不饱和脂肪酸 (unsaturated fatty acids, UFAs) 具有调节血脂 降低血清低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterin, LDL-C) 水平和预防心血管疾病等作用, 茶枝柑籽油不饱和脂肪酸含量较高, 具有较高的营养价值和保健功能 可见, 茶枝柑籽油作为保健用油具有一定的开发潜力 1: 肉豆蔻酸甲酯 ; 2: 棕榈酸甲酯 ; 3: 棕榈油酸甲酯 ; 4: 十七烷酸甲酯 ; 5: 硬脂酸甲酯 ; 6: 油酸甲酯 ; 7: 亚油酸甲酯 ; 8: 亚麻酸甲酯 ; 9: 花生酸甲酯 ; 10: 花生烯酸甲酯 ; 11: 山嵛酸甲酯 ; 12: 二十三烷酸甲酯 ; 13: 二十四烷酸甲酯 图 1 茶枝柑籽油脂肪酸甲酯总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatogram (TIC) of esterified fatty acid in Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil 表 1 茶枝柑籽油脂肪酸组成及含量 Table 1 Contents of fatty acids in Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil 峰 保留时间 (min) 组分名称 分子式 相对含量 (%) 肉豆蔻酸 (C 14:0 ) C 14 H 28 O 棕榈酸 (C 16:0 ) C 16 H 32 O 棕榈油酸 (C 16:1 ) C 16 H 30 O 十七烷酸 (C 17:0 ) C 17 H 34 O 硬脂酸 (C 18:0 ) C 18 H 36 O 油酸 (C 18:1 ) C 18 H 34 O 亚油酸 (C 18:2 ) C 18 H 32 O 亚麻酸 (C 18:3 ) C 18 H 30 O 花生酸 (C 20:0 ) C 20 H 40 O 花生烯酸 (C 20:1 ) C 20 H 38 O 山嵛酸 (C 22:0 ) C 22 H 44 O 二十三烷酸 (C 23:0 ) C 23 H 46 O 二十四烷酸 (C 24:0 ) C 24 H 48 O

4 第 11 期杨春英, 等 : 气相色谱 - 质谱联用法分析茶枝柑籽油脂肪酸和不皂化物组成 茶枝柑籽油不皂化物分析 标准曲线 检测限和定量限在选定的色谱和质谱条件下, 对角鲨烯和 4 种常见植物甾醇 ( 菜籽甾醇 菜油甾醇 豆甾醇和 β- 谷甾醇 ) 进行线性关系和检出限测定 检出限按照 S/N=3 进行测算, 定量按 S/N=10 计算, 结果见表 2 和图 2 可见, 在本研究的试验条件下, 待测组分选定的浓度范围内具有的线性关系 (r ), 方法检测限均在 5.63 mg/l 以下 图 2 角鲨烯和植物甾醇标准曲线 Fig. 2 Standard curves of squalene and 4 phytosterols 精密度和回收率取茶枝柑籽油样, 采用标准加入法, 按照上述方法平行制备 7 份样品进行 GC-MS 分析, 平均回收率和精密度 ; 样品于 4 冰箱放置 24 h 后再测定, 计算其日间变异系数 ( 表 3) 结果表明, 标准加入的回收率较高 (88.5%~104.6%), RSD 小于 5.01%, 24 h 内测定结果无显著变化 可见, 所选方法可用于茶枝柑籽油不皂化组分测定 3.3 样品测定采用上述方法, 对茶枝柑籽油的角鲨烯和植物甾醇进行了分析测定, 保留时间 标准品比对和质谱库检索 (NIST11a.L) 法定性, 外标法定量, 结果见表 4 可见, 茶枝柑籽油中 4 种常见植物甾醇含量较高, 达 mg/kg, 高于文献报道的花生油 (1100~2200 mg/kg) 橄榄油(490 mg/kg) 茶油(170~535 mg/kg) 中的植物甾醇含量 [10], 其中 β- 谷甾醇含量最高 ( mg/kg), 菜籽甾醇含量最少 ( mg/kg) 研究证明, 植物甾醇具有降低血液胆固醇 预防前列腺疾病 抑制肿瘤 抗炎和免疫调节等作用 同时, 茶枝柑籽油中检测到一定量的角鲨烯 ( 三萜类化合物 ), 约 73 mg/kg 角鲨烯具有保肝 提高人体免疫力和修复细胞 促进伤口愈合等功效 除上述 4 种植物甾醇和角鲨烯外, 同时检测到少量其他植物甾醇 ( 图 3, 括号内数值表示相似度 ) 脂溶性维生素 表 2 角鲨烯和植物甾醇曲线方程 检出限和定量限 Table 2 Standard curve equations, limits of detection and limits of quantitation of squalene and 4 phytosterols 待测物 曲线方程 线性范围 (mg/l) 相关系数 r 检出限 (mg/l) 定量限 (mg/l) 菜籽甾醇 Y=590996X ~ 菜油甾醇 Y=189818X ~ 豆甾醇 Y=426065X ~ β- 谷甾醇 Y=356141X ~ 角鲨烯 Y=574500X ~ 表 3 加标回收试验结果 (n=7) Table 3 The results of recovery(n=7) 待测物 加入量 (mg/l) 测量值 (mg/l) 回收率 (%) RSD(%) CV(%) 菜籽甾醇 菜油甾醇 豆甾醇 β- 谷甾醇 角鲨烯 表 4 茶枝柑籽油角鲨烯和植物甾醇测定结果 (n=3) Table 4 Contents of phytosterols and squalene in Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil (n=3) 待测组分 菜籽甾醇 菜油甾醇 豆甾醇 β- 谷甾醇 总量 角鲨烯 含量 (mg/kg) 34.83± ± ± ± ± ±3.09 注 : 总量是指 4 种植物甾醇的总量

5 4422 食品安全质量检测学报第 8 卷 1: 叶绿醇 (98); 2: 角鲨烯 ; 3: γ- 生育酚 (89); 4: 胆甾醇 (95); 5: α- 生育酚 (99); 6: 菜籽甾醇 ; 7: 菜油甾醇 ; 8: 豆甾醇 ; 9: 羊毛甾醇 (86); 10: β- 谷甾醇 ; 11: 豆甾二烯醇 (93); 12: α- 香树脂醇 (93); 13: 环阿屯醇 (99) 图 3 茶枝柑籽油不皂化组分 TIC 图 Fig. 3 Total ion chromatogram (TIC) of unsaponifiable matter in Citrus reticulata cv. Chachiensis seed oil 以及双萜类物质, 主要包括胆甾醇 羊毛甾醇 豆甾二烯醇 α- 香树脂醇 环阿屯醇 γ- 生育酚 α- 生育酚和叶绿醇 鉴定依据 NIST11a.L 质谱库检索, 以相似度 >85( 最大值为 100) 确认为该物质 由于试验条件限制, 缺乏标准品, 暂未能对上述 8 种物质进行准确定量分析 生育酚具有较高的抗氧化活性, 可以有效清除人体自由基 ; 萜类化合物均有一定生理活性, 是中草药的有效成分之一 可见, 茶枝柑籽油的不皂化物应该具有良好的生物活性, 值得进一步深入研究 4 结论 综上所述, 茶枝柑籽粗脂肪含量较高, 达 32.27%; 茶枝柑籽油富含不饱和脂肪酸 (67.62%), 其中亚油酸质量分 [14,15] 数最高, 达 36.93% 经与文献报道对比, 茶枝柑籽油中的油酸含量与大豆油 (17.87%~27.93%) 和玉米油 (29.84%) 接近, 亚油酸含量与花生油 (31.18%~35.83%) 接近 此外, 茶枝柑籽油不皂化物以植物甾醇 生育酚和萜类化合物为主, 其中 β- 谷甾醇含量最高, 达 mg/kg 茶枝柑籽油中不饱和脂肪酸和生物活性物质含量较高, 有可能作为一种油料资源进行深入研究与开发利用 参考文献 [1] Liu EH, Zhao P, Duan L, et al. Simultaneous determination of six bioactive flavonoids in Citri Reticulatae Pericarpium by rapid resolution liquid chromatography coupled with triple quadrupole electrospray tandem mass spectrometry [J]. Food Chem, 2013, 141(4): [2] Li W, Wang Z, Wang YP, et al. Pressurised liquid extraction combining LC-DAD-ESI/MS analysis as an alternative method to extract three major flavones in citrus reticulata Chachi (Guangchenpi) [J]. Food Chem, 2012, 130(4): [3] 甘伟发, 周林, 黄庆华, 等. 茶枝柑皮提取物中多糖的分子质量分布及抗氧化活性研究 [J]. 食品科学, 2013, 34(15): Gan WF, Zhou L, Huang QH, et al. Study on molecular mass distribution and antioxidant activity of polysaccharides in tea leaves [J]. Food Sci, 2013, 34(15): [4] 万福根, 邓仁华, 黄贵平, 等. 中药橘核的研究进展 [J]. 中国药业, 2011, 20(17): Wan FG, Deng RH, Huang GP, et al. Progress in the research of tangerine core [J]. China Pharm, 2011, 20(17): [5] 徐玉娟, 施英, 肖更生, 等. 橘核中柠檬苦素类物质测定方法的研究 [J]. 现代食品科技, 2007, 23(2): Xu YJ, Shi Y, Xiao GS, et al. Study on the method of determination of limonin in orange core [J]. Mod Food Sci Technol, 2007, 23(2): [6] Jinhee K, Guddadarangavvanahally KJ, Mariappan M, et al. Structure-function relationships of citrus limonoids on p38 MAP kinase activity in human aortic smooth muscle cells [J]. Eur J Pharm, 2011, 670(1): [7] Jun Yu, Deepak VD, Romeo TT, et al. Supercritical fluid extraction of limonoids and naringin from grapefruit (Citrus paradisi Macf.) seeds [J]. Food Chem, 2007, 105 (3): [8] 白希, 刘丛, 朱慧忠, 等. 新疆伽师酸梅核仁油中脂肪酸及不皂化物组成分析 [J]. 中国粮油学报, 2013, 28(2): Bai X, Liu C, Zhu HZ, et al. Analysis of the fatty acid and unsaponification in the kernel oil of Jishi smoked plum in xinjiang [J]. J

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