源自希腊语的 taxis ( arrangement 排列 ) and nomos ( law 法规 ) Classification ( 分类 ): 由具体到抽象 --- 收集大量描述有关个体的文献资料, 整理成科学的分类系统 Identification( 鉴定 ) : 从抽象到具体 --- 将

源自希腊语的 taxis ( arrangement 排列 ) and nomos ( law 法规 ) Classification ( 分类 ): 由具体到抽象 --- 收集大量描述有关个体的文献资料, 整理成科学的分类系统 Identification( 鉴定 ) : 从抽象到具体 --- 将未识别的生物归类为某一确定分类单元的行为和结果 Nomenclature( 命名 ): 对每个新的类型微生物进行命名的过程 Taxonomy ( 分类学 ) is an agreement among people

1)NCBI 数据库 :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy 优点 : 对自己的序列进行比较分析缺点 : 有很多错误的分类信息 2)RDP 数据库 : http://rdp.cme.msu.edu( 适用于群落结构分析 ) 优点 1: 从 NCBI 取出 16S rrna 基因序列后, 通过分析确认其分类信息优点 2: 对很多 ( 几百条 ) 序列确定分类信息 3)LPSN 数据库 : http://www.bacterio.cict.fr/ 优点 : 严格按照分类规则建立, 能了解不同层次分类 ( 包括典型菌株信息 ) 缺点 : 不能比较测序结果, 不能进行分类鉴定 4) EzTaxon: http://eztaxon-e.ezbiocloud.net 优点 : 包括典型菌株信息, 也能比较测序结果, 可以进行分类鉴定 5)Bergey 氏原核生物分类系统 : 不仅是序列信息, 形态学 生化信息全

Category (taxon, 分类单位 ) Domain ( 域 ) - Phylum,Division( 门 ) - Class ( 纲 ) - Order ( 目 ) - Family ( 科 ) - Genus ( 属 ) - species ( 种 ) (

各级分类单元 All organisms 域 Domain Eukarya Archaea Bacteria 界 Kingdom Fungi None assigned for archaea None assigned for bacteria 门 Phylum Ascomycota Euryarcheota Proteobacteria 纲 Class Hemiascomycetes Methanococci Gammaproteobacteria 目 Order Saccharomycetales Methanococcales Enterobacteriales 科 Family Saccharomycetaceae Methanococcaceae Enterobacteriaceae 属 Genus Saccharomyces Methanothermococcus Escherichia 种 Species S. cerevisiae M. okinawensis E. coli Baker s yeast Methanococcus E. coli

种 (species) 的概念 微生物的种 (species, 简写 sp., 又译物种 ) 是一个基本分类单元, 它是一大群表型特征高度相似 亲缘关系极其接近 与同属内其他物种有明显差异的菌株的总称

菌株 (strain) 菌株又称品系 ( 在非细胞型的病毒中则称毒株或株 ), 表示任何由一个独立分离的单细胞 ( 或单个病毒粒子 ) 繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后代 菌株 (strain) = 纯培养物 (pure culture) = 克隆 (clone) 典型菌株 (type strain) 一个种内的一个典型菌株作为这个种的具体代表 注意 : 典型菌株一般由两个以上国家的菌种保藏机构保藏, 以便备查考 索取和购买

sp. vs spp. Bacillus sp. ( 一种芽孢杆菌 ) Bacillus spp. ( 若干种芽孢杆菌 ) Strain ( 菌株 ) Escherichia coli K12 Type strain ( 典型菌株 ) Rhizobium daejeanense L61 T

属名 (generic name) 双名法 种名加词 (specific epithet)

属名可用缩写, 但种名不能缩写 微生物命名 ( 拉丁文 ) 属名可以单独用, 但种名必须与属名一起用 属名和种名必须要用斜体, 当手写时需用下划线 Escherichia coli K12 属名 种名菌株名 例 : Escherichia coli, E. coli, Escherichia sp. K12, Escherichia sp.,escherichia spp., and the genus Escherichia 文章中第一次用学名时需要用全称, 第二次开始属名可以用缩写 ( 但必须与种名一起用 ) 如果用缩写后可能与其它属引起混淆, 就不能用缩写

俗名 (common name) 指普通的 通俗的 地区性的名字, 具有大众化和简明的优点, 但往往涵义不够确切, 易于重复, 使用范围局限 例如, 结核杆菌 是 Mycobacterium tuberculosis ( 结核分枝杆菌 ) 的俗名 ; 红色面包霉 是 Neurospora crassa( 粗糙脉孢菌 ) 的俗名

学名和俗名比较

Approved List of Bacterial Name (International Journal of Systematic Bacteriology 1980, 30:255-429) 在 Approved List 之前, 没有固定的规律来描述新的种 统一的系统 e.g., 链霉菌 (Streptomyces ) 属曾同时包含超过 3,000 种 理事会 :International committee on systematic bacteriology (ICSB) ( 系统细菌学国际委员会 ) 规则 : 细菌命名法的国际法规 官方杂志 International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB) International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM) (From 2000)

分类学的提议 ( 新的分类单位, 新的组合 ) IJSEM 中发表 其它杂志发表 作者委托 IJSEM Notification List in IJSEM Validation List in IJSEM

没有纯培养 通过有限的信息描述 16S rdna Morphology( 形态学 ) ( 荧光原位杂交后 TEM, SEM) Ecology( 生态学 - 生存环境 生长条件 ) 其它信息 ( 全基因组分析等 )

一 生物的界级分类学说 三域

二 三域学说及其发展 三域学说是 70 年代末由 C.R. Woese 对大量微生物和其他生物进行 16S 和 18S rrna 的寡核苷酸检测, 并比较其同源性水平后提出的 域 : 一个比界更高的界级分类单元 细菌域 古生菌域 真核生物域

Prokaryotes Eukaryotes Bacteria Archaea Eukarya 三域学说 Macroorganisms

Nature, 2013,Dec. 12

类杆菌 - 黄杆菌 螺旋体 异常球菌 绿色非硫化细菌 绿色硫细菌 衣原体 浮霉状菌 蓝细菌 栖热孢菌 格兰氏阳性菌 硝化螺旋菌 产液菌 / 产氢菌 变形菌

盐杆菌盐球菌古生球菌 Euryarchaeota 广古生菌 嗜盐甲烷菌 甲烷八叠球菌 甲烷螺菌 热原体 甲烷杆菌 甲烷栖热菌 甲烷嗜热菌 甲烷球菌 热网菌 Crenarchaeota 热球菌 热变型菌 泉古生菌 硫化叶菌硫还原球菌 古古生菌 Korarchaeota

嗜盐 广古生菌门 厌氧产甲烷 泉古生菌门 嗜酸 古古生菌门

奇古菌门

第三节各大类微生物的分类系统刚要 Bergey 氏原核生物分类系统纲要 细菌分类鉴定的两本权威手册 1. 伯杰氏鉴定细菌学手册 1923 年 2. 伯杰氏系统细菌学手册 1984 年

伯杰氏鉴定细菌学手册 1923 年第 1 版 1925 年第 2 版 1930 年第 3 版 1934 年第 4 版 1939 年第 5 版 1948 年第 6 版 1957 年第 7 版 1974 年第 8 版 1994 年第 9 版 第 9 版的伯杰氏细菌鉴定手册设立 35 个群, 将古生菌部改编为 5 个群, 全书描写约 500 个属 划分为四大类 : 第一类具细胞壁的革兰氏阴性细菌第二类具细胞壁的革兰氏阳性细菌第三类无细胞壁的细菌第四类古生菌

伯杰氏鉴定细菌学手册 1994 年第 9 版, 撰稿人多达 300 多位, 涉及 20 个国家 鉴定手册包括 35 个群细菌

伯杰氏系统细菌学手册 伯杰氏系统细菌学手册 第 1 版 (1984 年 ) 是在 伯杰氏鉴定 细菌学手册 第 8 版 (1974 年 ) 的基础上, 根据 10 多年来细菌分 类所取得的进展编写的 1984-1989 年第 1 版 2000-2012 年第 2 版 系统手册 的新内容: G+C mol% 核酸杂交 16 S rrna 寡核苷酸序列等系统发育方面的资料, 特别是许多新的分类单元的划分, 都是经过核苷酸序列比较后提出的

伯杰氏系统细菌学手册 ( 第 1 版 ) 第一卷 : 一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细菌 第二卷 : 放线菌以外的革兰氏阳性细菌 第三卷 : 古细菌 蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌 第四卷 : 放线菌

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Edition ) Springer, New York Volume 1 (2001) The Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria Volume 2 (2005)The Proteobacteria ( 变形菌门 ) Volume 3 (2009)The Firmicutes ( 厚壁菌门 ) Volime 4 (2011) The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes (Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres,Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadete s, Lentisphaerae, Verrucomicrobia,Chlamydiae, and Planctomycetes Volume 5 (2012)The Actinobacteria ( 放线细菌门 )

Ainsworth 等人的菌物分类系统纲要 目前得到学术界较广泛采用的是 Ainsworth 的分类系统 子囊菌门 子囊菌纲酵母菌纲裂殖酵母纲外囊菌纲新乳霉纲肺囊霉纲 真菌界 担子菌门 接合菌门 担子菌纲锈菌纲黑粉菌纲 接合菌纲毛菌纲 壶菌门 无性型真菌类 第九版 (2001)

第四节微生物分类鉴定方法 1 基于生理学特征的经典鉴定方法 : 基于少数的形态学和生理学的性质 基于主观的选择性 ( 指标 ) 的试验 缺少均一性 ( 标准化 )

2 数值分类鉴定 基于借助于计算机分析大量的表型的性质 (e.g. 300 strains x 200 tests) 更多的分析项目 同样缺乏均一性 费力的 API 细菌数值鉴定系统 (API system) Biolog 细菌数值鉴定系统

ad hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics of International Committee on Systematic Bacteriology (ICSB, 细菌系统学国际委员会 ) - Wayne et al. (1987) IJSB 37:463-464 细菌的物种应该反应基因组的关系 基于直接或间接的测量基因组核苷酸序列的比较 基因组测序 ( 直接的 ) 理想的, 但以前是不切实际 DNA-DNA 杂交 ( 间接的 ) 种的定义 在最优化的杂交温度下, 全基因组杂交,70% 结合 ( 同源性 ) The phylogenetic definition of species generally would include strains with approximately 70% or greater DNA-DNA relatedness and with 5 C or less Tm. Both values must be considered.

间接的评价两个菌株的基因组的亲缘关系 缺点 : - 无法鉴别属以上的水平 ( 定种可以 ) - 费力 ( 分别提取 DNA), 昂贵 - 无法产生数据库

基因测序 : 用目标基因代表整个基因组 (rdna, rpo, gyr) SSU rrna 优点 : 存在于大多数物种 ( 真核生物, 古细菌, 真细菌 ) 便于测序 基于保守区域的 PCR (ca. 1,500 nt) 基于保守区域的测序 大型数据库 > 2,000,000 small subunit rdna sequences

16S rdna 序列相似度 <97% 时其 DNA-DNA 杂交值 <70% 但 16S rdna 序列相似度 >97% 时不好估计 DNA-DNA 杂交值 100

16S rdna 测序 不同的分支 现有的物种单元 物种 : 小于 97% 16S rdn A 相似度 新的属 Yes No Genomic species 化学的, 表型的数据的支持 Yes 70%> DNA-DNA hybridization wit h species showing 16S rd NA 相似度 >97% 70%< 新的种

DNA 总的 DNA: GC 含量 RFLP DNA-DNA 杂交 DNA 片段 : 基于 PCR 的 DNA 指纹印迹 DNA 探针 DNA 测序 mrna PROTEIN 总的细胞内蛋白和包膜蛋白的电泳图谱 Chemotaxonomic markers 基因型信息 DNA 16S 23S 5S rrna 测序 GenBank, EMBL Expressed features 胞内脂肪酸 极性脂质 醌类 聚胺类 细胞壁组分 表型信息 形态学 生理学 酶学 血清学

微生物分类鉴定的 4 个水平 1 细胞的形态和习性水平 2 细胞组分水平 3 蛋白质水平 4 核酸水平

( 一 ) 经典的鉴定指标 1. 形态学指标 2. 生理 生化指标 3. 生态特性指标 4. 生活史 5. 血清学反应 6. 对噬菌体的敏感性 7. 其他

(1) 群体形态学特征 (2) 个体形态学特征 细胞大小 形态 排列及其染色特性特殊的细胞结构培养特征运动性等

1 斜面菌苔特征

2 平板菌落特征 细菌在琼脂平板上的菌落表面形态

2 平板菌落特征 细菌在琼脂平板上的菌落隆起形状 细菌在琼脂平板上的菌落边缘形状

3 培养液中的生长特征

1 革兰氏染色 2 芽孢染色 3 荚膜染色 4 鞭毛染色 5 运动性观察 ( 半固体琼脂穿刺法 ) SEM,TEM 观察

(1) 接触酶反应 (2) 糖醇类发酵试验 (3) 甲基红 (M.R) 试验 (4) 甲基乙酰甲醇 (V.P) 试验 (5) 吲哚试验 (6) 硝酸盐还原 (7) 亚硝酸盐还原 (8) 大分子物质水解反应 (9) 碳源利用试验 (10) 氮源利用试验

化学分类 : 细胞化学成分用作鉴定指标 对于不同属的鉴定是有用的 弱点 1. 细胞壁的化学成份 2. 全细胞水解液的糖型 3. 磷酸类脂成分的分析 4. 枝菌酸的分析 5. 醌类的分析 6. 脂肪酸分析 - 微生物的化学组成取决于环境 - 必须同一条件下培养

一些常用分类技术在分类学上的精确度 聚氨, 醌 脂肪酸 细胞壁结构

FAMEs ( 脂肪酸甲酯 ) 通过 GC 分析 ( 气相色谱法 )

16S rdna 测序 GC 含量 DNA-DNA 杂交

16S rrna 在结构和功能上的作用

16S rrna gene 在分子分类学应用 16S rrna 所有的细菌都具备的古老的分子 功能恒定 普遍分布 系统发生距离上中度保守 More than 2,000,000 of 16S rrna g ene sequences are currently availabl e on RDP.

核糖体 (Ribozome) structure Procaryote Eukaryote Overal size 70S 80S Small subunit 30S 40S Number of proteins ~21 ~30 RNA size (number of base) 16S (~1500bp) 18S (~2300bp) Large subunit 50S 60S Number of proteins ~34 ~50 RNA size (number of base) 23S (~2900bp) 5S (~120bp) 28S (~4200bp) 5.8S (~160bp) 5S (~120bp) 线粒体和叶绿体的核糖体跟原核生物的核糖体更相似

16S rdna 测序的概述 PCR 电泳 基因组 DNA 或细胞裂解 16S rdna 分析 测序 克隆 系统进化树 放射自显影图 载体 + 16S rdna

16S rrna gene amplification 9F 341F 536R 518F 907F 1512R 1100R Primer 1512R 5 -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 16S rrna gene Electrophoresis 1.6 Kb Primer 9F 5 -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3

测序 : PCR 产物或克隆的基因 16S rrna 基因序列完全一致 纯化 纯化的 PCR 产物 9F 341F 520F 536R 907F 1100R 不同 16S rrna 基因之间存在序列差异 1512R 基于 PCR 的循环测序 partial sequence full sequence 克隆 测序 载体 + 16S rdnas

序列分析 用 ez-taxon 数据库搜索相近序列 选择参考株 Alignment 构建系统发生树 16S rdna 相似度 97%: 不同的种 (Stackebrandt & Goebel, 1994)

DNA 碱基组成 DNA 双螺旋 [A] = [T], [G] = [C] A-double bond-t/ G-triple bond-c 基因组的进化适应性一部分取决于 GC 含量

GC 含量作为分类学的标记 原核生物之间 GC 含量变化范围 20% - 80% 相同的 GC 含量不意味着相同的碱基组成 Minimal value in the overall taxonomic characterization of genus and species G + C A + T + G + C ⅹ100% Difference in mol% G+C = 0% same species Difference in mol% G+C 5% different species Difference in mol% G+C 10% different genus

细胞裂解 ( 化学的 & 物理的 ) P P P P protein DNA 蛋白酶处理 P P P RNA RNA 酶处理 Cell DNA 变性 核酸酶处理 碱性磷酸酶处理 HPLC 分析 : 270 nm

GC 含量的计算 C T G A

DNA 序列间的部分相似进行杂交 对于区分相近的生物的非常敏感的方法 ( >99% 16S rdna 或 相同的 GC 含量 都有可能对应 <70% 杂交值 ) Hybridization value 70% : same species

基因组 DNA 纯化 靶 DNAs 的固定 预杂交 生物素标记的探针 DNA 杂交和酶反应 检测

感兴趣的菌株 相关微生物 完全无关的 e.g. E. coli (+) control 靶 (-) control 单链 DNAs 变性 固定到膜上 95 97 99 91 83 0.01 Brevibacterium casei DSM 20657 T AJ251418 Target Probe: strain of interest Brevibacterium aureum Enb15 AY299092 Brevibacterium aureum Enb17 AY299093 Brevibacterium linens DSM 20425T X77451 Brevibacterium iodinum NCDO 613 T X76567 洗出未结合的 DNAs washing

与鲑鱼精 DNA 预杂交 固定的靶 DNA 预杂交 杂交膜 鲑鱼精 DNA 鲑鱼精 DNA 是与细菌 DNA 完全无关的 DNA. 充当非特异性的配体使靶 DNA 中未结合的受体饱和 去除非特异性的 DNA-DNA 结合 ( 不完全互补的结合 ) 杂交膜 Washing 靶 DNA 鲑鱼精 DNA 特异位点 非特异位点使非特异位点饱和 标记的探针 DNA 可能的非特异性结合

标记的探针 DNA 探针 DNA 变性 生物素标记的探针 DNA 加入光生物素 washing 交联 光照

杂交 (+) control 标准化的靶 DNA 杂交膜 生物素标记的探针 DNA target 杂交 杂交膜 (-) control Washing

底物与酶的反应 酶 β-d-galactosidase 添加酶 杂交膜 链霉亲和素 4-methylumbelliferyl-β- D-galactopyranoside Washing 底物 F 添加底物 37 酶反应 杂交膜 F

检测 (+) control F F F F F F F F 8 RFU 检测 target F F F F F F 6 RFU (-) control F F 2 RFU

DNA 电子杂交 随着高通量测序技术的发展, 微生物全基因组分析将成为微生物研究中的常用方法

基因型信息 16S rrna 基因测序 GC 含量 DNA-DNA 杂交 化学分类信息脂肪酸醌 细胞表型信息形态学 ( 显微镜, 菌落 ) 生长条件 ( 温度, ph, 盐度 ) 碳源的利用 (API kit) 酶活性 (API kit)

总结 : 三域学说 ( 什么, 谁, 基于什么, 意义 ) 微生物分类体系及其发展 微生物分类鉴定方法 ( 核酸 形态 生化指标 ) 微生物学名及其在生物学中的意义 ( 什么应用? 什么疾病?)

Example: Rhizobium daejeonense sp. nov. Figure Transmission electron micrograph. of strain L61 T

Fig. Phylogenetic tree constructed fro m a comparative analysis of 16S rd NA gene sequences showing the rel ationships of strain L61 with other r elated species.

Physiological characteristics of strain L61 and related species

G+C contents 61.3%, in the range of Rhizobium (57%-63%) DNA-DNA hybridization Lower than 10% with R. gianidii, R. huautlense, A. tumefaciens. R. galegae,

Rhizobium daejeonense sp. nov. (dae.jeon.en'se N.L. neut. adj. daejeon, pertaining to Daejeon a city in Korea, where the type strain of this species was isolated). Cells are a gram-negative, aerobic, motile, non-spore forming rod (0.6-0.7 1.1-1.3 m) with peritrichous flagella. The colonies appearing on YMA within 3 days of incubation at 28 C are circular, cream colored, semi-translucent, and sized 1.5-3.0 mm in diameter. Catalase, oxidase, urease, -galactosidase, and -glucosidase are positive. Gelatin liquefaction, indole production, and arginine dihydrogenase are negative. No nitrate reduction to nitrite. (Enzyme activity) Cells grew at 41 C, in 0-2% NaCl, or in a ph range of 5-10; however it could not grow at 4 C or 45 C, in 2.5% NaCl, or in a ph range higher than 10 or lower than 4.5. Nodules were formed in Medicago sativa by this strain. A nifh encoding a nitrogenase complex was detected. DNA G+C content is 60.1-60.9%, as determined by means of HPLC. The cellular fatty acids are C16:0 (2.2-3.3%), C18:0 (2.1-3.2%), C19:0 cyclo ω8c (9.9-16.8%), C20:3 ω6,9,12c (2.7-3.3%), summed feature 3 (7.2-7.7%) and summed feature 7 (67.8-73.7%).

The available carbon source is propionate, caprate, valerate, histidine, acetate, L- alanine, 3-hydroxy-benzoate, maltose, D-glucose, fucose, D-sorbitol, L-proline, rhamnose, D-ribose, inositol, D,L-lactate, arabinose, mannose, mannitol, maltose, and malate; the no available carbon source is citrate, itaconate, suberate, glycogen, phenyl-acetate, adipate, D-melibiose, 2-ketogluconate, N-acetyl-Glucosamine, malonate, 5-ketogluconate, and gluconate. L-Glutamic acid, L-methionate, L-phenylalanine, L-cysteine, and free- and nickelcomplexed cyanides were used as nitrogen source, but D,L-tryptophan and glycine were not. Cells are resistant against ampicillin (20 and 100 g ml-1) and erythromycin (20 μg ml-1); however they are not resistant against tetracycline (50 μg ml-1), erythromycin (100 g ml-1), chloramphenicol (100 μg ml-1) or kanamycine (100 μg ml-1). The strains were isolated from a cyanide-degrading bioreactor originally inoculated by an activated sludge from a municipal sewage treatment plant (Daejeon, Korea). The type strain is L61 T (= KCTC 12121 T = IAM 15042 T = CCBAU 10050 T ) and the reference strain is L22 (= KCTC 12120 = IAM 15041).

www.fungalbarcoding.org 群落结构分析 : https://unite.ut.ee/( 包括纯培养和未培养微生物信息 )