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1 微 生 物 学 通 报 Microbiology China MAR 20, 2012, 39(3): by Institute of Microbiology, CAS 研 究 报 告 大 黄 鱼 (Larimichthys crocea) 内 脏 白 点 病 的 病 原 分 离 和 组 织 病 理 学 观 察 邱 杨 玉 1 郑 磊 2 毛 芝 娟 2* 陈 孝 煊 (1. 华 中 农 业 大 学 水 产 学 院 湖 北 武 汉 ) (2. 浙 江 万 里 学 院 生 物 与 环 境 学 院 浙 江 宁 波 ) 1 摘 要 : 目 的 确 定 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 的 病 原, 初 步 分 析 该 病 的 致 病 机 理, 为 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 的 防 治 提 供 部 分 启 示 方 法 开 展 病 原 菌 的 分 离 种 类 鉴 定 和 人 工 感 染 试 验 等 工 作, 同 时 通 过 石 蜡 组 织 切 片 的 方 法, 观 察 病 鱼 的 组 织 病 理 学 变 化 结 果 确 定 病 原 菌 为 恶 臭 假 单 胞 菌 在 病 鱼 的 肝 脏 肾 脏 脾 脏 等 组 织 中 均 能 发 现 明 显 症 状 或 病 症, 各 组 织 均 发 生 炎 性 病 变, 细 胞 变 形 或 解 体, 在 脾 肾 等 组 织 中, 纤 维 组 织 增 生, 围 绕 菌 体 形 成 肉 眼 见 到 的 白 点 结 论 恶 臭 假 单 胞 菌 作 为 病 原 菌, 引 起 大 黄 鱼 内 脏 出 现 明 显 白 点, 其 致 病 机 理 仍 需 进 一 步 探 讨 关 键 词 : 大 黄 鱼, 内 脏 白 点 病, 病 原 菌, 分 离 和 鉴 定, 组 织 病 理 Isolation and identification of the causative agent and histopathology observation of white-spots disease in internal organs of Larimichthys crocea QIU Yang-Yu 1 ZHENG Lei 2 MAO Zhi-Juan 2* CHEN Xiao-Xuan 1 (1. College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei , China) (2. Biological and Environmental College, Zhejiang Wanli University, Ningbo, Zhejiang , China) Abstract: [Objective] In order to find the pathogenic bacteria of white-spots disease in internal organs of Larimichthys crocea. [Methods] Using the method of isolation and identification of the 基 金 项 目 : 宁 波 市 海 洋 与 渔 业 科 技 项 目 3 4 * 通 讯 作 者 : : zhijuanmao@tom.com 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 :

2 362 微 生 物 学 通 报 2012, Vol.39, No.3 causative agent in combination with 16S rrna sequencing to find the pathogenic bacteria.besides it was determined by artificial infection. The tissue of diceased fish were pathologically analyzed by paraffin histological section techniques. [Results] The bacterium Pseudomonas putida was responsible for the disease. Affected fish showed obvious inflammation and cell deformation or disintegration of the liver, kidney and spleen. [Conclusion] The conducted study was necessary in order to reveal the reason for the high mortality of cultured yellow croaker in the Xiangshan bay. Furthermore, the results of this study can help to early recognize such disease outbreaks, hence preventing drastic economic losses in the future. Keywords: Larimichthys crocea, White-spots disease, Causative agent, Isolation and identification, Histopathology. 大 黄 鱼 (Larimichthys crocea) 是 我 国 东 南 沿 海 网 箱 养 殖 的 主 要 经 济 品 种, 养 殖 过 程 中 主 要 受 到 弧 菌 病 和 多 种 寄 生 虫 病 的 危 害, 发 病 季 节 一 般 集 中 在 每 年 的 6 10 月 [1 4] 2011 年 1 4 月, 浙 江 省 象 山 港 网 箱 养 殖 大 黄 鱼 发 生 一 种 严 重 病 害, 与 以 往 的 病 情 不 同, 病 鱼 体 表 无 明 显 病 症, 解 剖 后 可 见 脾 肾 出 现 直 径 0.5 mm 1.0 mm 的 白 色 结 节, 后 期 肝 脏 也 出 现 相 同 白 点, 故 暂 称 该 病 为 内 脏 白 点 病 ; 由 于 发 病 期 在 低 温 季 节, 鱼 不 吃 饲 料, 无 法 投 喂 药 物 进 行 有 效 治 疗, 发 病 网 箱 死 亡 严 重, 累 计 死 亡 率 可 达 50% 以 上, 造 成 惨 重 的 经 济 损 失 为 了 深 入 了 解 该 病 的 发 生 原 因, 寻 找 有 效 的 防 治 方 法, 本 研 究 开 展 了 病 原 的 分 离 鉴 定 和 药 敏 性 测 定 的 研 究 同 时 进 行 了 相 关 组 织 病 理 学 的 研 究, 旨 在 找 到 该 病 的 致 病 机 理, 了 解 病 原 侵 入 鱼 体 后 引 起 的 机 体 免 疫 反 应, 为 疾 病 的 防 治 提 供 部 分 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 用 鱼 患 病 大 黄 鱼 于 2011 年 1 月 采 自 浙 江 省 宁 波 市 象 山 港 大 黄 鱼 养 殖 场, 体 长 20 cm 30 cm, 体 重 g, 收 集 具 有 典 型 内 脏 白 点 症 状 的 大 黄 鱼 作 为 病 理 学 研 究 材 料 健 康 大 黄 鱼 采 自 象 山 港 远 离 发 病 区 的 养 殖 网 箱, 经 检 查 确 认 健 康 后 使 用 1.2 组 织 病 症 观 察 观 察 临 床 患 病 鱼 体 的 表 型 病 症, 解 剖 并 取 出 病 鱼 的 肝 脏 脾 脏 肾 脏 等 进 行 组 织 表 型 病 症 观 察 1.3 病 原 菌 的 分 离 与 培 养 选 取 发 病 大 黄 鱼, 用 75% 酒 精 棉 球 对 鱼 体 表 擦 拭 消 毒 后, 无 菌 操 作 解 剖 鱼 体, 从 肝 肾 脾 等 组 织 中 取 样, 在 TCBS 和 ZoBell 平 板 培 养 基 中 划 线 分 离, 28 C 恒 温 培 养 18 h, 挑 取 形 态 特 征 一 致 的 优 势 菌 落 进 行 纯 化 培 养, 纯 化 后 获 得 一 株 分 离 菌 株 PT01, 工 作 菌 株 于 4 C 保 存 备 用 1.4 菌 株 致 病 力 测 试 将 已 经 纯 化 培 养 的 分 离 菌 株 PT01 在 ZoBell 斜 面 过 夜 培 养 后, 用 0.75% 的 生 理 盐 水 洗 下 原 液, 将 原 液 稀 释 成 CFU/mL 浓 度 的 菌 悬 液 备 用 挑 选 无 外 伤 游 动 活 泼 平 均 体 重 为 40 g 的 健 康 大 黄 鱼 作 为 供 试 鱼 采 用 腹 腔 注 射 和 口 服 感 染 的 方 式 进 行 人 工 感 染 实 验 分 为 6 组, 每 组 12 尾 鱼, 其 中 4 个 实 验 组, 2 个 对 照 组 实 验 组 每 尾 注 射 或 口 灌 0.2 ml 的 菌 悬 液, 对 照 组 每 尾 注 射 或 口 灌 相 同 剂 量 的 0.75% 生 理 盐 水 人 工 感 染 后 连 续 观 察 10 d, 记 录 发 病 症 状 及 其 死 亡 情 况, 并 对 死 亡 鱼 进 行 解 剖 和 按 照 上 述 的 分 离 病 原 菌 方 法 进 行 病 原 菌 的 再 分 离 鉴 定 1.5 细 菌 的 鉴 定 形 态 学 观 察 : 观 察 28 C 恒 温 培 养 24 h 的

3 邱 杨 玉 等 : 大 黄 鱼 (Larimichthys crocea) 内 脏 白 点 病 的 病 原 分 离 和 组 织 病 理 学 观 察 363 TCBS 和 ZoBell 平 板 菌 落 的 颜 色 形 态 透 明 度 等 菌 落 特 征 ; 以 24 h 纯 培 养 的 菌 落 进 行 革 兰 氏 染 色, Olympus BX51 显 微 镜 下 观 察 菌 体 形 态 特 征 理 化 特 性 试 验 : 按 照 常 用 细 菌 系 统 鉴 定 手 册 [5] 的 方 法 进 行, 运 动 性 试 验 采 用 半 固 体 琼 脂 穿 刺 法, 鉴 定 生 化 管 为 杭 州 天 和 微 生 物 试 剂 有 限 公 司 产 品 实 验 过 程 中 选 取 来 源 于 中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 普 通 微 生 物 中 心 的 恶 臭 假 单 胞 菌 菌 种 作 为 对 照 分 离 菌 株 16S rrna 基 因 序 列 的 PCR 和 序 列 分 析 : 采 用 细 菌 通 用 16S rrna 基 因 序 列 引 物 [6], 分 别 为 上 游 引 物 P1: 5 -AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3 ; 下 游 引 物 P2: 5 -GGTTACCTTGT TACGACTT-3 目 标 片 段 长 约 bp 以 煮 沸 法 提 取 的 分 离 菌 PT01 基 因 组 DNA 为 模 板 PCR 反 应 条 件 为 : 94 C 5 min; 94 C 45 s, 53 C 45 s, 72 C 90 s, 共 32 个 循 环 ; 72 C 10 min 反 应 完 毕 取 3 5 µl PCR 产 物 进 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR 产 物 经 纯 化 回 收 后 送 去 直 接 测 序 ( 上 海 英 俊 生 物 技 术 有 限 公 司 ), 所 得 序 列 经 NCBI 的 BLASTn 程 序 在 线 比 对 后, 以 MEGA 5.0 软 件 构 建 基 于 16S rrna 基 因 序 列 的 系 统 发 育 树 1.6 药 敏 试 验 以 纸 片 法 进 行, 挑 取 PT01 单 菌 落 于 LB 液 体 培 养 基 中 培 养, 使 其 菌 液 浓 度 为 0.5 麦 氏 单 位 以 无 菌 棉 拭 子 将 菌 液 均 匀 涂 布 于 LB 平 板, 将 抗 生 素 药 敏 纸 片 ( 杭 州 天 和 微 试 剂 有 限 生 物 公 司 ) 贴 于 培 养 基 表 面, 28 C 恒 温 培 养 24 h, 测 量 抑 菌 圈 直 径 依 照 美 国 临 床 实 验 室 标 准 研 究 所 CLSI [7] 规 定 的 标 准 判 断 敏 感 特 性 1.7 病 理 组 织 学 观 察 石 蜡 组 织 切 片 观 察 取 鲜 活 大 黄 鱼, 分 别 取 患 病 鱼 体 和 健 康 鱼 体 的 肝 脏 肾 脏 和 脾 脏 组 织, 以 预 冷 的 2.5% 戊 二 醛 溶 液 固 定, 常 规 石 蜡 包 埋 切 片, 苏 木 精 - 伊 红 (H.E) 染 色, 中 性 树 脂 封 片, 在 Olympus BX51 显 微 镜 下 观 察, 记 录 和 描 述 病 变 情 况 2 结 果 与 分 析 2.1 病 鱼 病 症 观 察 如 图 1 所 示, 病 鱼 表 面 多 数 无 明 显 外 部 症 状, 少 部 分 可 见 粘 液 分 泌 增 加, 鱼 体 腹 鳍 臀 鳍 基 部 发 红 解 剖 后 可 见 内 脏 出 现 明 显 白 色 点 状 病 灶, 有 的 病 鱼 肝 脏 呈 现 红 肝, 脾 脏 肾 脏 出 现 直 径 0.5 mm 1.0 mm 的 白 点, 严 重 的 病 鱼 肝 脏 也 会 出 现 白 点, 病 鱼 肌 肉 失 去 弹 性 图 1 病 鱼 病 症 观 察 Fig. 1 Symptoms of diseased fishes 2.2 菌 株 的 致 病 性 测 定 用 腹 腔 注 射 和 口 腔 灌 入 菌 悬 液 的 人 工 感 染 方 法 均 能 使 健 康 的 大 黄 鱼 发 病, 除 前 期 ( 攻 毒 后 1 3 d) 死 亡 的 个 体 未 出 现 明 显 内 部 症 状 外, 之 后 (4 10 d) 发 病 和 死 亡 个 体 的 脾 和 肾 脏 均 出 现 了 明 显 的 白 色 结 节, 与 自 然 发 病 情 况 基 本 相 同 人 工 感 染 的 具 体 结 果 见 表 1, 观 察 期 为 10 d 从 感 染 试 验 的 结 果 看, 分 离 菌 对 大 黄 鱼 的 毒 力 很 强, 根 据 修 正 的 Karber [8] 法 计 算, 分 离 菌 经 腹 部 注 射 感 染 后 其 96 h 半 数 致 死 浓 度 LD 50 值 为 CFU/mL 同 时 可 以 看 出, 分 离 菌 经 口 感 染 也 显 示 了 较 强 的 致 病 力 此 外, 自 感 染 发 病 鱼 体 内 重 新 分 离 到 的 菌 株, 其 形 态 特 性 和 主 要 理 化 特 性 ( 表 2) 与 原 感 染 菌 株 完 全 相 同

4 364 微 生 物 学 通 报 2012, Vol.39, No.3 组 号 Groups Table 1 表 1 分 离 菌 株 的 人 工 感 染 试 验 Artificial challenge of large yellow croaker (Larimichthys crocea) against the isolated strain PT01 菌 液 浓 度 Concentration of bacteria (CFU/mL) 感 染 方 式 Methors of injection 剂 量 Dose (ml) 试 验 鱼 数 ( 尾 ) Numbers of samples 攻 毒 后 天 数 和 累 计 死 亡 数 量 ( 尾 ) Days post i.p. injection and cumulative death of the fish 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d 死 亡 率 Mortality (%) 腹 注 腹 注 腹 注 口 服 % NaCl 腹 注 % NaCl 口 服 Table 2 表 2 分 离 菌 的 生 理 生 化 特 性 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strain 检 测 项 目 Items 分 离 菌 PT01 PT01 恶 臭 假 单 胞 菌 Pseudomonas putida O-F 测 验 O-F test O O 氧 化 酶 Oxidase + + 西 盟 氏 枸 橼 酸 盐 Simmons citrate + + 葡 萄 糖 产 气 Gas production 麦 芽 糖 Maltose + + 蔗 糖 Sucrose + + 鼠 李 糖 Rhamnos 木 糖 Xylose + + 果 糖 Fructose + + 甘 露 醇 Mannitol 肌 醇 lnositol 乳 酸 Lactic acid + 精 氨 酸 双 水 解 酶 Arginine dihydrolase + + 赖 氨 酸 脱 羧 酶 肉 汤 Lysine decarboxylase 氰 化 钾 Potassiumcyanide + 尿 素 Urea + 硫 化 氢 Production of H 2 S DNA 乙 酰 胺 Acetamide 硝 酸 盐 还 原 Nitrate deduction + 明 胶 Gelatinase production 4 C 生 长 Growth C 生 长 Growth 运 动 性 Mobility + + 磷 脂 酶 Phospholipase TCBS 平 板 上 菌 落 颜 色 Color of colony on TCBS agar 绿 色 绿 色 注 : +: 阳 性 ; : 阴 性 ; O: 非 发 酵 性 细 菌. 恶 臭 假 单 胞 菌 菌 种 来 源 于 中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 普 通 微 生 物 中 心. Note: +: Positive; : Negative; O: Non-fermentative bacteria. Pseudomonas putida comes from China general microbiological culture collection center.

5 邱 杨 玉 等 : 大 黄 鱼 (Larimichthys crocea) 内 脏 白 点 病 的 病 原 分 离 和 组 织 病 理 学 观 察 病 原 菌 的 分 离 与 鉴 定 形 态 观 察 : 自 病 鱼 组 织 中 分 离 到 平 板 上 的 菌 落, 生 长 特 性 和 形 态 非 常 一 致, 在 Zobell 平 板 上 生 长 良 好, 呈 乳 白 色 菌 落 ; 能 在 TCBS 平 板 上 生 长, 但 长 速 缓 慢, 生 长 48 h 左 右 可 见 绿 色 菌 落 分 离 菌 株 为 革 兰 氏 阴 性, 杆 状 菌 生 理 生 化 鉴 定 : 分 离 菌 为 非 发 酵 性 细 菌, 有 运 动 性, 氧 化 酶 阳 性, 利 用 枸 橼 酸 盐 木 糖 和 蔗 糖 ; 精 氨 酸 双 水 解 酶 阳 性, 甘 露 醇 利 用 阴 性, DNA 酶 乙 酰 胺 结 果 阴 性, 不 产 生 明 胶 酶, 主 要 生 理 生 化 特 性 与 恶 臭 假 单 胞 菌 [5,9] 的 生 理 生 化 特 性 相 近 S rrna 基 因 序 列 比 对 和 系 统 发 育 分 析 : 分 离 菌 PT01 基 因 组 DNA 经 PCR 扩 增 获 得 了 预 期 约 bp 的 特 异 性 条 带 ( 图 2), 纯 化 回 收 的 PCR 产 物 经 直 接 测 序 后 获 得 bp 片 段 的 序 列, 将 测 定 的 序 列 递 交 NCBI 进 行 BLASTn 在 线 比 对, 结 果 表 明, 该 序 列 同 假 单 胞 菌 属 多 种 细 菌 的 同 源 性 高 达 99% 以 上, 其 中 与 恶 臭 假 单 胞 菌 Pseudomonas putida strain NBAII CK-24E 菌 株 的 16S rrna 基 因 ( 登 录 号 HQ ) 完 全 同 源 实 验 所 得 序 列 递 交 到 GenBank, 登 录 号 为 JF 药 敏 试 验 用 药 敏 纸 片 法 测 定 了 病 原 菌 对 25 种 抗 菌 药 物 的 敏 感 性, 结 果 见 表 3 由 表 3 可 知, 依 照 美 国 临 床 实 验 室 标 准 研 究 所 CLSI [7] 规 定 的 标 准, 病 原 菌 对 氧 氟 沙 星 链 霉 素 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 等 9 种 药 物 敏 感 ; 对 头 孢 噻 肟 头 孢 哌 酮 头 孢 他 啶 等 6 种 药 物 中 度 敏 感 ; 对 哌 拉 西 林 氨 曲 南 红 霉 素 等 12 种 药 物 不 敏 感 选 取 上 述 比 对 中 同 源 性 最 高 的 序 列, 经 MEGA 5.0 构 建 系 统 发 育 树 ( 图 3) 从 图 3 可 以 看 出, PT01 菌 株 与 恶 臭 假 单 胞 菌 自 然 聚 为 一 支, 结 合 形 态 和 理 化 特 性 结 果, PT01 可 鉴 定 为 恶 臭 假 单 胞 菌 图 2 16S rrna PCR 扩 增 电 泳 结 果 Fig. 2 16S rrna PCR electrophoresis of amplification 注 : M: DL2000 marker; 1 2 均 为 PT01 进 行 16S rrna PCR 扩 增 后 的 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 结 果. Note: M: DL2000 marker; 1, 2: 16S rrna PCR amplification of PTO1, which is showed by 1% agarose gel electrophoresis. 2.5 石 蜡 组 织 切 片 观 察 肝 组 织 : 正 常 大 黄 鱼 的 肝 组 织 结 构 清 晰, 细 胞 呈 多 角 状, 排 列 均 匀 规 则, 成 放 射 状 围 绕 中 央 静 脉 排 列 ; 细 胞 质 内 含 有 丰 富 的 细 胞 器 及 内 含 物, 核 位 于 细 胞 中 央, 圆 形 ( 图 4A) 患 病 鱼 肝 细 胞 坏 死 严 重, 肝 细 胞 界 限 模 糊 不 清, 肝 细 胞 崩 解, 肝 细 胞 索 消 失 ; 肝 胰 腺 分 离, 白 细 胞 吞 噬 了 大 量 菌 体 后 破 裂, 窦 状 隙 中 大 量 炎 症 细 胞 浸 润, 肝 管 脱 离 周 边 组 织, 呈 游 离 状 态, 上 皮 细 胞 异 常, 细 胞 萎 缩, 排 列 疏 松, 空 隙 较 明 显 ( 图 4B C) 脾 组 织 : 正 常 大 黄 鱼 的 脾 脏 内 有 脾 髓, 除 淋 巴 细 胞 外 含 有 大 量 红 细 胞 及 结 缔 组 织 的 原 纤 维, 其 中 淋 巴 细 胞 可 聚 集 形 成 淋 巴 岛 ( 图 5A) 病 鱼 脾 脏 组 织 坏 死 严 重, 纤 维 组 织 包 围 菌 体, 此 即 为 肉 眼 见 到 的 白 点, 脾 脏 内 组 织 恶 化 充 血, 脾 组 织 中 吞 噬 了 大 量 菌 体 后, 白 细 胞 破 裂, 有 大 量 的 炎 性 细 胞 浸 润, 并 有 明 显 的 色 素 沉 着 现 象 髓 窦 内 含 铁 血 黄 素 大 量 沉 积, 周 围 出 现 空 泡 ( 图 5B D)

6 366 微 生 物 学 通 报 2012, Vol.39, No.3 药 品 Antibiotics 表 3 致 病 菌 的 药 物 敏 感 试 验 结 果 Table 3 The sensitivity of the pathogen to antibiotics 纸 片 含 量 (μg/ 片 ) Concentration (μg/slice) 抑 菌 圈 直 径 Diameter of inhibitory zone (mm) 敏 感 性 Sensitivity 氧 氟 沙 星 Ofloxacin 5 21 敏 感 S 链 霉 素 Streptomycin 敏 感 S 庆 大 霉 素 Gentamicin 敏 感 S 卡 那 霉 素 Knanmycin 敏 感 S 妥 布 霉 素 Tobramycin 敏 感 S 四 环 素 Tetracycline 敏 感 S 头 孢 吡 肟 Cefepime 敏 感 S 头 孢 曲 松 ( 菌 必 治 ) Ceftriaxone 敏 感 S 头 孢 噻 肟 Cefotaxime 中 敏 I 头 孢 哌 酮 Cefoperazone 中 敏 I 头 孢 他 啶 Ceftazidime 中 敏 I 诺 氟 沙 星 Norfloxacin 中 敏 I 洛 美 沙 星 Lomefloxacin 中 敏 I 强 力 霉 素 Doxycycline 中 敏 I 哌 拉 西 啉 Piperacillin 耐 药 R 氨 曲 南 Aztreonam 耐 药 R 红 霉 素 Erythromycin 15 9 耐 药 R 氨 苄 西 林 Ampicillin 10 0 耐 药 R 头 孢 呋 辛 Cefuroxime 30 0 耐 药 R 头 孢 唑 啉 Cefazolin 30 0 耐 药 R 头 孢 西 叮 Cefoxitin 30 0 耐 药 R 头 孢 噻 吩 Cefalotin 30 0 耐 药 R 麦 迪 霉 素 Medemycin 30 0 耐 药 R 呋 喃 唑 酮 Furazolidone 30 0 耐 药 R 复 方 新 诺 明 SMZ+TMP 30 0 耐 药 R Fig. 3 图 3 基 于 16S rrna 序 列 的 系 统 发 育 树 Phylogenetic tree based on 16S rrna sequence of homology

7 邱 杨 玉 等 : 大 黄 鱼 (Larimichthys crocea) 内 脏 白 点 病 的 病 原 分 离 和 组 织 病 理 学 观 察 367 图 4 患 病 大 黄 鱼 肝 脏 组 织 病 变 Fig. 4 Pathological changes of liver tissues of diseased fishes 注 : A: 正 常 的 肝 脏 (HE 400); B: 病 变 的 肝 脏 (HE 400) 示 肝 组 织 病 变, 肝 细 胞 崩 解, 肝 细 胞 索 消 失 ; 细 胞 萎 缩, 排 列 疏 松, 空 隙 较 明 显 ; C: 病 变 的 肝 脏 (HE 1 000) 示 白 细 胞 吞 噬 了 大 量 菌 体 后 破 裂. Note: A: Normal liver (HE 400); B: Liver with pathological changes (HE 400) indicates that the liver cells apart, liver cell cable disappeared; cell atrophy, the gap is obvious; C: Liver with pathological changes (HE 1 000) indicates that white blood cells break after consuming a lot of bacteria. 图 5 患 病 大 黄 鱼 脾 脏 组 织 病 变 Fig. 5 Pathological changes of spleen tissues of diseased fishes 注 : A: 正 常 的 脾 脏 (HE 400); B: 病 变 的 脾 脏 (HE 400) 示 脾 组 织 吞 噬 了 大 量 菌 体 后 破 裂 的 白 细 胞, 且 脾 细 胞 萎 缩, 空 隙 较 明 显, 出 现 空 泡 化 ; C: 病 变 的 脾 脏 (HE 400) 示 髓 窦 内 含 铁 血 黄 素 大 量 沉 积 ; D: 病 变 的 脾 脏 (HE 1 000) 示 脾 组 织 中 纤 维 组 织 包 围 菌 体, 即 为 肉 眼 见 到 的 白 点. Note: A: Normal spleen (HE 400); B: Spleen with pathological changes (HE 400) indicates that white blood cells of spleen tissues break after consuming a lot of bacteria, and spleen cells atrophy, the gap is more apparent, appear empty bubble phenomenon; C: Spleen with pathological changes (HE 400) indicates that splenic sinusoids contains hemosiderin deposit; D: Spleen with pathological changes (HE 1 000) indicates that the bacteria were surrounded by fibrous tissue of spleen tissues, which is the white spot we can see.

8 368 微 生 物 学 通 报 2012, Vol.39, No 肾 组 织 : 正 常 大 黄 鱼 的 肾 脏 质 地 均 匀, 结 构 完 整, 肾 小 管 由 单 层 上 皮 细 胞 构 成, 横 切 面 上 皮 细 胞 间 排 列 紧 凑, 界 限 清 晰 ( 图 6A) 而 病 鱼 肾 小 管 周 边 组 织 有 大 量 的 炎 性 白 细 胞 浸 润, 肾 小 管 规 则 形 状 消 失, 内 容 物 释 放 ; 肾 小 管 上 皮 细 胞 肿 胀, 排 列 紊 乱, 管 腔 变 窄 与 闭 塞 ; 严 重 区 域 肾 小 管 失 去 原 有 的 组 织 结 构, 崩 溃 解 体, 形 成 大 面 积 坏 死 灶, 坏 死 灶 中 心 区 充 满 解 体 后 的 细 胞 碎 片 ; 部 分 区 域 出 现 纤 维 组 织 包 围 菌 体, 此 即 为 肉 眼 见 到 的 白 点 ; 肾 小 球 结 构 模 糊 不 清 破 裂 ( 图 6B D) 3 讨 论 3.1 假 单 胞 菌 引 起 的 海 水 鱼 病 在 我 国, 已 报 道 的 引 起 养 殖 鱼 类 内 脏 产 生 白 点 或 白 色 结 节 的 病 原 有 多 种, 主 要 有 粘 孢 子 虫 [10 11] 诺 卡 氏 菌 [12 15] [16 18] 类 立 克 次 体 等 粘 孢 子 虫 对 网 箱 养 殖 大 黄 鱼 的 寄 生 偶 见 报 道, 一 年 四 季 皆 可 发 生, 虫 体 寄 生 在 鱼 体 皮 肤 鳃 鳍 和 各 内 脏 器 官, 可 出 现 针 头 至 米 粒 大 小 的 白 色 包 囊 [11] ; 诺 卡 氏 菌 对 东 海 海 区 养 殖 大 黄 鱼 的 感 染 一 般 发 生 在 9 11 月, 表 现 为 体 表 充 血 发 红 和 内 脏 出 现 1 mm 3 mm 白 色 结 节 的 症 状, 镜 检 观 察 到 分 枝 状 革 兰 氏 阳 性 菌 [14 15] ; 类 立 克 次 体 感 染 乌 鳢 则 可 引 起 眼 球 突 出 腹 部 膨 胀, 脑 眼 鳃 内 脏 各 器 官 等 出 现 白 色 结 节 [17 18] ; 本 研 究 中 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 主 要 发 病 季 节 在 冬 春 季 的 1 4 月, 病 鱼 体 表 鳃 基 本 完 好, 内 脏 中 脾 肾 出 现 0.5 mm 1.0 mm 的 白 点 或 小 结 节, 对 症 灶 部 位 涂 片 镜 检 和 分 离 观 察 到 了 短 杆 状 的 革 兰 氏 阴 性 菌, 感 染 该 病 的 大 黄 鱼 累 计 死 亡 率 高 达 50% 以 上 可 以 看 出, 本 次 感 染 的 流 行 季 节 疾 病 症 状 等 与 粘 孢 子 虫 病 图 6 患 病 大 黄 鱼 肾 脏 组 织 病 变 Fig. 6 Pathological changes of kidney tissues of diseased fishes 注 : A: 正 常 的 肾 脏 (HE 1 000); B: 病 变 的 肾 脏 (HE 1 000) 示 肾 小 管 上 皮 肿 胀, 官 腔 闭 塞 ; 周 边 组 织 大 量 白 细 胞 浸 润 ; C: 病 变 的 肾 脏 (HE 1 000) 示 肾 小 管 溶 解, 坏 死, 胞 浆 流 失 于 管 腔 ; 结 缔 组 织 增 生, 巨 噬 细 胞 破 裂 ; 部 分 区 域 出 现 纤 维 组 织 包 围 菌 体, 此 即 为 肉 眼 见 到 的 白 点 ; D: 病 变 的 肾 脏 (HE 1 000) 示 肾 小 管 上 皮 细 胞 溶 融, 肾 小 球 破 裂. Note: A: Normal kidney (HE 1 000); B: Kidney with pathological changes (HE 1 000) indicates that the tubular epithelial swelling, cavity block; leukocyte begin to infiltrate peripheral organizations; C: Kidney with pathological changes (HE 1 000) indicates that the tubular dissolve, necrosis; connective tissue hyperplasia, macrophages burst; the bacteria were surrounded by fibrous tissue, which is the white spot we can see; D: Kidney with pathological changes (HE 1 000) indicates that the tubular epithelial cells dissolve, glomerular burst.

9 邱 杨 玉 等 : 大 黄 鱼 (Larimichthys crocea) 内 脏 白 点 病 的 病 原 分 离 和 组 织 病 理 学 观 察 369 很 不 相 同, 可 以 排 除 ; 而 与 诺 卡 氏 菌 引 起 的 内 脏 结 节 确 有 相 似 的 地 方, 但 其 体 表 基 本 无 症 状, 这 与 诺 卡 氏 菌 引 起 明 显 充 血 和 烂 鳍 可 以 明 显 区 分, 症 灶 部 位 涂 片 及 革 兰 氏 染 色 镜 检 结 果 也 完 全 相 反 ; 与 类 立 克 次 氏 体 引 起 的 症 状 也 不 同 ; 进 一 步 的 人 工 感 染 和 理 化 特 性 及 分 子 生 物 学 鉴 定 确 证 了 此 次 感 染 的 致 病 菌 为 恶 臭 假 单 胞 菌, 与 之 前 报 道 的 几 种 病 原 确 实 不 同 已 有 报 道 表 明, 假 单 胞 菌 属 的 部 分 种 类 如 荧 光 假 单 胞 菌 (P. fluorescens) 恶 臭 假 单 胞 菌 等 是 重 要 的 鱼 类 病 原 [19 21], 其 危 害 对 象 包 括 欧 洲 鳗 虹 鳟 大 黄 鱼 和 黑 鲷 等 [22 24] 本 研 究 自 2011 年 初 发 病 大 黄 鱼 体 内 分 离 和 鉴 定 了 一 株 恶 臭 假 单 胞 菌 PT01, 这 与 近 年 来 不 同 的 研 究 者 屡 次 在 我 国 东 海 海 域 患 内 脏 白 点 / 结 节 病 的 养 殖 大 黄 鱼 中 分 [23,25 26] 离 到 了 假 单 胞 菌 的 结 果 是 一 致 的, 可 见, 该 病 菌 已 在 局 部 地 域 内 呈 流 行 态 势, 有 必 要 引 起 极 大 的 重 视 3.2 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 的 病 因 本 研 究 经 腹 腔 注 射 法 和 口 灌 法 人 工 感 染 大 黄 鱼 验 证 了 分 离 菌 PT01 的 致 病 性, 在 感 染 鱼 体 内 重 新 分 离 到 了 与 原 株 相 同 的 细 菌, 且 人 工 感 染 症 状 与 自 然 发 病 症 状 相 同, 即 脾 和 肾 内 都 出 现 明 显 的 白 点 或 白 色 结 节 可 以 确 定 死 亡 是 由 PT01 人 工 感 染 引 起 的, 恶 臭 假 单 胞 菌 PT01 是 此 次 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 的 病 原 菌 本 研 究 通 过 对 患 病 大 黄 鱼 的 肝 脾 肾 等 3 种 内 脏 组 织 进 行 病 理 学 分 析, 认 为 引 起 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 的 原 因 可 能 为 : (1) 主 要 病 原 菌 假 单 胞 菌 的 致 病 因 子 作 用 导 致 机 体 组 织 细 胞 结 构 发 生 明 显 的 病 理 变 化, 发 生 物 质 代 谢 障 碍 肾 脏 调 节 内 环 境 稳 定 的 功 能, 脾 脏 的 造 血 功 能, 肝 脏 的 消 化 合 成 和 解 毒 等 功 能 都 受 到 了 不 同 程 度 的 影 响, 这 些 变 化 造 成 鱼 体 自 身 生 理 代 谢 紊 乱, 免 疫 力 和 抗 病 力 下 降, 鱼 体 病 变 逐 步 严 重 很 明 显 重 要 脏 腑 受 损 内 脏 器 官 功 能 衰 竭 是 造 成 感 染 假 单 胞 菌 鱼 体 出 现 死 亡 的 主 要 原 因 之 一 (2) 本 研 究 中 观 察 到 了 恶 臭 假 单 胞 菌 经 口 感 染 也 能 很 快 致 死, 提 示 了 养 殖 过 程 中 可 能 经 由 腐 败 变 质 的 饵 料 带 入 该 菌 引 起 致 病 目 前 象 山 港 区 域 网 箱 养 殖 中 仍 大 量 使 用 未 经 加 工 的 冰 鲜 小 杂 鱼, 假 单 胞 菌 由 于 在 低 温 条 件 下 也 能 快 速 生 长, 有 可 能 大 量 存 在 于 这 类 饵 料 中 (3) 研 究 中 观 察 到, 发 病 网 箱 的 鱼 体 基 本 上 全 部 带 菌, 但 症 状 轻 微 的 鱼 体 可 能 捱 过 发 病 期, 待 水 温 升 高, 开 口 摄 食 后 存 活 下 来, 提 示 了 该 菌 可 能 诱 导 了 鱼 体 的 免 疫 耐 受 而 在 鱼 体 内 长 期 存 在, 只 在 一 定 条 件 下 引 起 发 病, 详 细 的 机 制 有 必 要 进 一 步 研 究 3.3 大 黄 鱼 内 脏 白 点 病 的 防 治 本 研 究 分 离 的 致 病 菌 PT01 对 多 种 喹 诺 酮 类 药 物 敏 感, 生 产 中 可 以 选 用 恩 诺 沙 星 洛 美 沙 星 等 允 许 使 用 的 药 物 拌 饵 投 喂, 会 起 到 一 定 的 治 疗 作 用 但 从 本 研 究 结 果 可 以 看 出, 致 病 性 恶 臭 假 单 胞 菌 对 常 用 的 多 种 抗 生 素 类 药 物 已 产 生 耐 药 性, 单 纯 依 赖 药 物 控 制 的 效 果 必 定 是 不 理 想 的, 极 可 能 在 较 短 时 间 内 导 致 耐 药 性 的 产 生 和 传 播, 同 时 也 可 能 导 致 产 品 中 的 药 物 残 留 进 而 引 起 水 产 品 质 量 安 全 问 题 本 研 究 的 结 果 表 明 该 菌 可 经 口 感 染, 提 示 了 不 新 鲜 腐 败 变 质 的 饵 料 可 能 是 重 要 的 传 染 源, 该 病 的 预 防 需 要 从 养 殖 模 式 上 进 行 根 本 性 的 变 革, 杜 绝 直 接 投 喂 小 杂 鱼 饵 料, 改 用 科 学 配 方 的 全 价 饲 料, 才 是 解 决 问 题 的 根 本 之 道 同 时, 要 深 入 进 行 恶 臭 假 单 胞 菌 致 病 机 理 及 鱼 类 对 该 菌 的 免 疫 机 制 的 研 究, 为 控 制 该 病 提 供 完 整 的 思 路 参 考 文 献 [1] 毛 芝 娟, 刘 国 勇, 陈 昌 福. 大 黄 鱼 溃 疡 病 致 病 菌 的 初 步 分 离 与 鉴 定 [J]. 安 徽 农 业 大 学 学 报, 2002, 29(2):

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