Microsoft Word tb 吴慧昊.doc

Transcription

1 微 生 物 学 通 报 Microbiology China Apr. 20, 2013, 40(4): by Institute of Microbiology, CAS 简 报 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 吴 慧 昊 1 牛 锋 (1. 西 北 民 族 大 学 实 验 中 心 甘 肃 兰 州 ) (2. 西 北 民 族 大 学 生 命 科 学 与 工 程 学 院 甘 肃 兰 州 ) 2* 摘 要 : 目 的 采 用 复 合 诱 导 的 方 法, 选 育 出 能 在 低 温 条 件 下 性 状 稳 定 生 长 良 好 且 具 有 工 业 生 产 价 值 的 低 温 乳 酸 菌 菌 株 方 法 使 用 紫 外 照 射 和 亚 硝 基 胍 处 理 的 方 法 对 分 离 的 Q1 菌 株 进 行 诱 变 处 理, 将 选 育 得 到 的 低 温 菌 株 Q1-4-6 与 出 发 菌 株 Q1 在 15 C 20 C 37 C 下, 比 较 其 生 长 速 率 产 酸 量 和 糖 降 解 量 结 果 从 玛 曲 牧 民 自 制 酸 奶 中 分 离 得 到 一 株 乳 酸 菌 Q1, 根 据 其 形 态 学 特 征 生 理 生 化 特 性, 同 时 结 合 16S rdna 序 列 分 析 结 果, 将 其 鉴 定 为 肠 球 菌 属 棉 籽 糖 肠 球 菌 (Enterococcus raffinosus) 经 过 多 轮 诱 变 选 育 出 一 株 能 在 低 温 下 良 好 生 长 遗 传 性 状 稳 定 的 菌 株 Q1-4-6, 将 出 发 菌 株 与 诱 变 菌 株 在 15 C 20 C 比 较 其 生 长 产 酸 和 糖 降 解 量 发 现, 诱 变 菌 株 均 好 于 出 发 菌 株 在 37 C 的 自 然 条 件 下, 诱 变 菌 株 和 出 发 菌 株 的 生 长 速 率 差 异 不 大, 但 均 略 高 于 出 发 菌 株 在 15 C 培 养 发 现, 诱 变 菌 株 生 长 速 率 产 酸 量 均 高 于 购 买 菌 株 干 酪 乳 杆 菌 (CL04) 和 嗜 热 链 球 菌 (CL05) 结 论 通 过 UVNTG 复 合 诱 变, 最 终 选 育 出 一 株 在 低 温 下 生 长 良 好 遗 传 性 状 稳 定 的 菌 株 Q1-4-6 关 键 词 : 乳 酸 菌, 诱 变, 低 温, 16S rdna, 鉴 定 基 金 项 目 : 甘 肃 省 科 技 厅 支 撑 项 目 (No. 2GS064-A ); 甘 肃 省 农 牧 厅 攻 关 项 目 (No. GNSW ); 兰 州 市 科 技 局 产 业 化 项 目 (No ); 2011 年 中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金 项 目 (No. zyj ) * 通 讯 作 者 : : [email protected] 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 :

2 632 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 Selection for low temperature-resistant strain by composite mutagenesis of lactic acid bacteria WU Hui-Hao 1 NIU Feng 2* (1. Centres of Experimentation, Northwest University for Nationalities, Lanzhou, Gansu , China) (2. College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou, Gansu , China) Abstract: [Objective] Adopted a method of mixed induction, which can selected traits stable and growing well strains at low temperature, in order to get the low temperature-resistant strain with industrial value. [Methods] Mutagenized isolated Q1 by using ultraviolet irradiation and nitrosoguanidine treatment methods, put the strains Q1-4-6 and Q1 which already selected under the 15 C, 20 C, 37 C, compare their growth rate, acid production and the amount of sugar degradation. [Results] Q1 was extracted in homemade yogurt by Maqu pastoralists, the strain was classified into Enterococcus raffinosus according to its morphology, the physiological and biochemical features and 16S rdna sequence. After several rounds of mutation breeding, select a strain Q1-4-6 that can grow well at low temperatures and genetic traits stable. Compared growth, the amount of acid and sugar degradation between the original strains and mutant strains, we found mutants were better than the original strains. At 37 C natural conditions, there are rarely differences in growth rate between the original strains and mutants strains, but both of them are a little bit higher than the original strains. The acid amount and growth rate of Q1-4-6 are better than CL04 and CL05 under 15 C. [Conclusion] Through complex mutagenesis of UVNTG, eventually bred a strain Q1-4-6 that growing well at low temperatures with stable genetic traits. Keywords: Lactic acid bacteria, Mutation, Low temperature, 16S rdna, Identification 乳 酸 菌 (Lactic acid bacteria) 是 一 群 形 态 代 谢 性 能 和 生 理 学 特 征 不 完 全 相 同 的 革 兰 氏 阳 性 菌 的 统 称, 其 DNA 中 GC 含 量 少 于 55% mol [1] 乳 酸 菌 细 胞 形 态 有 球 状 类 球 状 短 杆 或 杆 状, 生 理 需 求 有 好 氧 厌 氧 或 兼 性 厌 氧, 在 发 酵 碳 水 化 合 物 时 主 要 的 代 谢 产 物 为 乳 酸 绝 大 多 数 乳 酸 菌 是 食 品 工 业 农 业 医 药 保 健 医 学 和 科 研 上 的 重 要 原 料 乳 酸 菌 为 人 类 服 务 已 有 几 千 年 的 历 史 了, 早 在 公 元 前 200 年, 古 印 度 古 埃 及 和 古 希 腊 就 用 有 益 于 人 体 健 康 的 乳 酸 菌 制 作 发 酵 食 品 乳 酸 菌 可 促 进 人 体 健 康, 具 有 一 定 的 保 健 作 用, 近 年 来 与 乳 酸 菌 有 关 的 食 品 和 微 生 态 制 品 发 展 迅 速, 在 食 品 和 医 药 工 业 中 占 有 越 来 越 重 要 的 地 位, 成 为 目 前 全 球 发 展 最 快 的 行 业 之 一 [23] 乳 酸 菌 不 仅 可 以 提 高 食 品 的 营 养 价 值, 改 善 食 品 的 风 味, 从 而 提 高 食 品 保 藏 性 和 附 加 值 [47], 而 且 近 年 来 对 乳 酸 菌 的 研 究 表 明, 乳 酸 菌 还 有 许 多 特 殊 医 疗 保 健 作 用, 如 促 进 营 养 物 质 的 吸 收 减 缓 乳 糖 不 耐 症 改 善 肠 道 功 能 降 低 血 清 胆 固 醇 水 平 和 血 脂 浓

3 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 633 度 抗 高 血 压 作 用 预 防 糖 尿 病 对 免 疫 系 统 的 调 节 作 用 抗 肿 瘤 作 用 和 其 他 生 理 功 能 [812] 常 用 的 诱 变 剂 有 物 理 诱 变 剂 如 紫 外 线 X 射 线 γ 射 线 快 中 子 ; 化 学 诱 变 剂 如 碱 基 类 似 物 移 码 突 变 剂 烷 化 剂 等 周 韬 等 通 过 紫 外 诱 变 的 方 法 筛 选 出 了 耐 低 温 的 杜 氏 藻 突 变 株 ; 韩 岚 等 通 过 紫 外 辐 照 的 方 法 筛 选 出 了 耐 低 温 的 大 螺 旋 蓝 细 菌 ; 刘 文 玉 等 通 过 亚 硝 基 胍 诱 变 及 低 温 驯 化, 选 育 出 低 温 β- 半 乳 糖 苷 酶 高 产 菌 株, 对 于 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 选 育 国 内 外 未 见 报 道 单 独 使 用 一 种 诱 变 剂, 不 仅 诱 变 效 率 低, 且 容 易 发 生 回 复 突 变, 而 采 用 UVNTG 混 合 诱 导 的 方 法, 在 一 定 程 度 上 可 降 低 发 生 回 复 突 变 的 几 率, 提 高 诱 变 效 率 世 界 性 能 源 短 缺 以 及 温 室 效 应 是 人 类 无 法 逃 避 的 事 实, 工 业 生 产 乳 酸 菌 制 品 及 发 酵 乳 酸 都 需 要 提 供 能 源 来 达 到 乳 酸 菌 发 酵 所 需 的 温 度, 因 此, 必 然 消 耗 大 量 的 能 源 以 及 排 出 大 量 的 温 室 气 体 本 论 文 拟 采 用 混 合 诱 导 的 方 法, 选 育 出 能 在 低 温 条 件 下 性 状 稳 定, 生 长 良 好 的 菌 株, 以 期 得 到 具 有 工 业 生 产 价 值 的 低 温 乳 酸 菌 菌 株, 从 而 降 低 工 业 生 产 成 本, 减 少 能 源 消 耗 量 及 温 室 气 体 的 排 放 量 1 材 料 与 方 法 1.1 菌 种 2010 年 4 月 采 自 于 甘 肃 玛 曲 牧 民 自 制 酸 奶 干 酪 乳 杆 菌 嗜 热 链 球 菌 购 自 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 1.2 主 要 培 养 基 MRS 液 体 培 养 基 (g/l): 蛋 白 胨 10 牛 肉 膏 10 酵 母 粉 5 葡 萄 糖 20 无 水 乙 酸 钠 5 吐 温 ml 柠 檬 酸 二 胺 2 磷 酸 氢 二 钾 2 硫 酸 镁 0.58 硫 酸 锰 0.25 蒸 馏 水 1 L, ph Pa 灭 菌 20 min 溴 甲 酚 紫 - 碳 酸 钙 平 板 培 养 基 (g/l): 在 MRS 液 体 培 养 基 基 础 上 添 加 碳 酸 钙 % 溴 甲 酚 紫 1.4 ml 琼 脂 Pa 灭 菌 20 min 1.3 主 要 仪 器 和 设 备 MLS-3750 全 自 动 高 压 灭 菌 器, JAPAN SANYO; TU-1900 双 光 束 紫 外 可 见 分 光 光 度 计, 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司 ; GL-21M 高 速 冷 冻 离 心 机, 赛 特 湘 仪 离 心 机 仪 器 有 限 公 司 ; JY92-Ⅱ 超 声 波 细 胞 粉 碎 机, 宁 波 新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ; Arium 611VF 超 纯 水 蒸 馏 机, 德 国 赛 多 利 斯 公 司 ; CX21FS1 光 学 显 微 镜, OLYMPUS CORPORATION TOKYO JAPAN; PCR 扩 增 仪, TaKaRa BIO INC; 核 酸 电 泳 仪, ADVANCE-BIO Co., Ltd; 蛋 白 质 电 泳 仪, 上 海 天 能 ; 电 泳 成 像 装 置, Pharmacia Biotech; DNA 测 序 仪, Applied Biosystem 1.4 菌 种 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 菌 种 的 分 离 纯 化 : 参 照 文 献 [13] 生 理 生 化 特 性 鉴 定 : 对 分 离 的 菌 种 分 别 进 行 过 氧 化 氢 酶 氧 化 还 原 酶 硝 酸 盐 还 原 明 胶 液 化 6.5% NaCl 40% 胆 盐 15 C 45 C 生 长 实 验 和 糖 发 酵 产 酸 试 验 运 动 性 检 查 : 采 用 半 固 体 培 养 基 穿 刺 法 S rdna 扩 增 及 序 列 测 定 方 法 : 提 取 菌 株 Q1 基 因 组 DNA 作 为 模 板, 使 用 TaKaRa 16S rdna Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310) 进 行 PCR 扩 增 目 的 片 段 反 应 体 系 为 菌 体 DNA 1 μl, PCR Premix 25 μl, 27f (20 μmol/l) 0.5 μl, 1492r (20 μmol/l) 0.5 μl, 16S-free H 2 O 23 μl PCR 反 应 条 件 : 94 C 5 min; 94 C 1 min, 55 C 1 min, 72 C 1.5 min, 共 30 个 循 环 ; 72 C 5 min 取 5 μl 进 行 3% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 以 16S forward 16S internal 和 16S reverse 为 引 物 进 行 DNA 测 序 PCR 产 物 测 序 由 宝 生 物 工 程 ( 大 连 ) 有 限 公 司 完 成 提 交 菌 株 Q1 的 16S rdna 序 列 在 NCBI 数 据 库 中 进 行 比 对, 选 取 与 之 相 似 性 最 高 的 15 株 菌

4 634 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 的 16S rdna 序 列, 进 行 ClustalX 比 对, MEGA 软 件 分 析, 采 用 Neighbor-Joining 构 建 系 统 发 育 树, Bootstrap 次 进 行 稳 定 性 验 证 1.5 诱 变 育 种 菌 株 对 数 生 长 期 的 测 定 : 将 菌 种 活 化 24 h 后, 按 2% 的 接 种 量 接 种 于 MRS 液 体 培 养 基 中 混 合 均 匀, 37 C 连 续 培 养 24 h, 每 隔 2 h 取 样, 用 分 光 光 度 计 测 定 不 同 时 间 段 培 养 液 的 OD 值, 未 接 种 的 MRS 液 体 培 养 基 作 为 空 白 对 照 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, OD 值 为 纵 坐 标, 绘 制 生 长 曲 线 [14] 菌 株 的 紫 外 诱 变 方 法 及 致 死 率 的 测 定 : 紫 外 诱 变 的 步 骤 : 出 发 菌 株 前 培 养 制 备 菌 悬 液 紫 外 线 照 射 后 培 养 稀 释 涂 平 板 避 光 低 温 培 养 挑 选 较 大, 黄 色 的 菌 落 50 株 划 斜 面 15 C 培 养 选 取 生 长 较 快 的 菌 株 5 株 ( 提 供 第 二 代 诱 变 出 发 菌 株 ) 致 死 率 的 测 定 : 将 完 成 后 培 养 的 菌 液 取 出, 用 移 液 枪 分 别 吸 取 0.2 ml 菌 液 涂 布 于 溴 甲 酚 紫 碳 酸 钙 平 板, 将 平 板 置 于 37 C 培 养 箱 遮 光 培 养, 培 养 后 统 计 生 长 菌 落 数 用 菌 落 计 数 法, 计 算 存 活 率 致 死 率 以 致 死 率 高 于 99% 的 处 理 时 间 作 为 以 后 的 诱 变 剂 量 存 活 率 (%)= 诱 变 后 的 菌 数 / 诱 变 前 的 菌 数 100 致 死 率 (%)=1 存 活 率 亚 硝 基 胍 诱 变 及 致 死 率 的 测 定 : 亚 硝 基 胍 诱 变 的 步 骤 : 出 发 菌 株 前 培 养 制 备 菌 悬 液 亚 硝 基 胍 诱 变 后 培 养 稀 释 涂 平 板 低 温 培 养 致 死 率 的 测 定 : 在 通 风 橱 中 称 取 10 mg NTG 于 棕 色 瓶 中, 加 入 1 ml 丙 酮 使 其 溶 解, 然 后 用 0.1 mol/l ph 6.0 的 磷 酸 缓 冲 液 配 制 成 1 g/l 的 NTG 溶 液 在 无 菌 离 心 管 中 分 别 吸 取 菌 悬 液 1 ml, 加 入 适 量 NTG 母 液 和 缓 冲 液 配 制 成 总 量 为 2 ml, NTG 浓 度 为 g/l 的 悬 浮 液, 将 离 心 管 置 于 温 度 为 40 C 转 速 为 120 r/min 的 摇 床 上 振 荡 处 理 30 min r/min 离 心 10 min, 弃 去 上 清 液, 用 缓 冲 液 洗 涤 菌 体 23 次, 最 后 加 入 等 体 积 的 缓 冲 液 悬 浮 沉 淀, 摇 匀, 适 当 稀 释, 取 0.2 ml 菌 液 涂 布 于 溴 甲 酚 紫 - 碳 酸 钙 平 板, 37 C 恒 温 培 养, 进 行 菌 落 计 数, 计 算 致 死 率 以 致 死 率 高 于 99% 的 处 理 时 间 作 为 以 后 的 诱 变 剂 量 耐 低 温 突 变 株 的 选 育 : 挑 选 菌 落 较 大 较 黄 且 比 对 照 较 早 长 出 的 菌 落 划 斜 面 15 C 培 养, 进 一 步 选 取 生 长 较 快 且 产 酸 较 好 的 菌 株 ( 提 供 第 二 代 诱 变 出 发 菌 株 ) 诱 变 菌 株 性 能 稳 定 性 的 测 定 : 将 诱 变 菌 株 连 续 传 代, 进 行 乳 酸 脱 氢 酶 (LDH) 活 力 的 测 定, 观 察 稳 定 性 (1) 酶 的 分 离 提 纯 : 将 待 测 菌 株 在 发 酵 培 养 基 中 培 养 至 待 测 期 取 出, r/min 离 心 10 min, 弃 去 上 清 液, 0.1 mol/l 磷 酸 盐 缓 冲 液 洗 涤 菌 体 23 次, 收 集 菌 体, 将 其 配 成 100 g/l 的 悬 液, 4 C 下 用 超 声 波 破 碎 10 min, 然 后 r/min 离 心 30 min, 取 上 清 液 作 为 无 细 胞 粗 酶 液, 滴 加 等 体 积 等 温 丙 酮, 4 C 静 置 2 h, 离 心 所 得 湿 态 酶 沉 淀 物, 用 缓 冲 液 稀 释, 待 测 酶 活 (2) 酶 活 力 测 定 : 预 先 将 丙 酮 酸 溶 液 及 NADH 溶 液 放 在 25 C 水 浴 中 预 热 取 2 只 石 英 比 色 杯, 在 1 只 比 色 杯 中 加 入 0.1 mol/l ph 7.5 磷 酸 氢 二 钠 - 磷 酸 二 氢 钠 缓 冲 液 3 ml, 置 于 紫 外 分 光 光 度 计 中, 在 340 nm 处 将 光 吸 收 调 节 至 0; 另 一 只 比 色 杯 用 于 测 定 LDH 活 力, 依 次 加 入 丙 酮 酸 钠 溶 液 2.9 ml, NADH 溶 液 0.1 ml, 加 盖 摇 匀 后, 测 定 340 nm 光 吸 收 值 (A) 取 出 比 色 杯 加 入 经 稀 释 的 酶 液 10 μl, 立 即 计 时, 摇 匀 后, 每 隔 0.5 min 测 A 340, 连 续 测 定 3 min, 以 A 对 时 间 作 图, 取 反 应 最 初 线 性 部 分, 计 算 每 分 钟 A 340 减 少 值 加 入 酶 液 的 稀 释 度 ( 或 加 入 量 ) 应 控 制 每 分 钟 A 340

5 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 635 下 降 值 在 之 间 LDH 活 力 单 位 (U)/mL 菌 液 = Δ A340 稀 释 倍 数 酶 液 加 入 量 ( 10 μ L) 突 变 株 与 出 发 株 的 性 能 比 较 C 20 C 生 长 及 产 酸 的 比 较 : 将 突 变 株 与 出 发 菌 株 分 别 活 化 24 h 后, 按 2% 的 接 种 量 ( 菌 液 浓 度 为 10 8 个 /ml) 接 种 于 MRS 液 体 培 养 基 中 混 合 均 匀, 分 别 于 15 C 20 C 培 养 120 h, 每 隔 8 h 取 样, 用 分 光 光 度 计 测 定 不 同 时 间 段 培 养 液 的 OD 值 及 ph 值 未 接 种 的 MRS 液 体 培 养 基 作 为 空 白 对 照 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, OD 值 及 ph 值 为 纵 坐 标, 分 别 绘 制 生 长 及 ph 曲 线 酸 度 的 测 定 : 吸 取 5 ml 发 酵 液, 置 于 250 ml 的 三 角 瓶 中, 加 入 蒸 馏 水 20 ml, 加 入 1 滴 0.5% 的 酚 酞 乙 醇 溶 液, 小 心 摇 匀, 用 0.1 mol/l 的 NaOH 滴 定 到 微 红 色, 在 1 min 内 不 消 失 为 测 定 终 点 [15] VNaOH CNaOH K 1000 酸 度 (%) = V 其 中 : C NaOH : NaOH 溶 液 浓 度 (mol/l); V NaOH : 发 酵 液 消 耗 NaOH 标 准 溶 液 的 体 积 (ml); V 1 : 液 体 样 品 的 体 积 (ml); K: 换 算 为 适 当 酸 的 系 数 ( 乳 酸 0.090) C 20 C 糖 降 解 率 的 比 较 : 将 菌 种 活 化 24 h 后, 按 2% 的 接 种 量 ( 菌 液 浓 度 为 10 8 个 /ml) 接 种 于 MRS 液 体 培 养 基 中 混 合 均 匀, 分 别 于 15 C 20 C 培 养 120 h, 每 隔 8 h 取 样, 采 用 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 法 测 定 还 原 糖 的 含 量 [16], 以 还 原 糖 含 量 为 纵 坐 标, 时 间 为 横 坐 标 绘 制 降 糖 曲 线 结 果 处 理 : 分 别 在 标 准 曲 线 上 查 出 相 应 还 原 糖 mg 数, 按 下 式 计 算 还 原 糖 百 分 含 量 还 原 糖 (%)=[C (V 1 /V 2 )] 100 其 中 : C: 标 准 曲 线 求 得 还 原 糖 的 毫 克 数 ; V 1 : 菌 液 的 总 体 积 (ml); 1 V 2 : 显 色 时 吸 取 样 品 的 体 积 (ml) C 生 长 及 产 酸 的 比 较 : 将 突 变 株 和 出 发 菌 株 分 别 活 化 24 h 后, 按 2% 的 接 种 量 ( 菌 液 浓 度 为 10 8 个 /ml) 接 种 于 MRS 液 体 培 养 基 中 混 合 均 匀, 37 C 培 养 24 h, 每 隔 2 h 取 样, 用 分 光 光 度 计 测 定 不 同 时 间 段 培 养 液 的 OD 值 及 ph 值 未 接 种 的 MRS 液 体 培 养 基 作 为 空 白 对 照 以 培 养 时 间 为 横 坐 标, OD 值 及 ph 值 为 纵 坐 标, 分 别 绘 制 生 长 及 ph 曲 线 1.7 突 变 株 与 购 买 菌 株 在 15 C 生 长 及 产 酸 的 比 较 将 突 变 株 干 酪 乳 杆 菌 (CL04) 和 嗜 热 链 球 菌 (CL05) ( 购 自 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 ) 分 别 活 化 24 h 后, 按 2% 的 接 种 量 ( 菌 液 浓 度 为 10 8 个 /ml) 接 种 于 MRS 液 体 培 养 基 中 混 合 均 匀, 于 15 C 培 养 120 h, 每 隔 8 h 取 样, 用 分 光 光 度 计 测 定 不 同 时 间 段 培 养 液 的 OD 值 及 ph 值 酸 度 测 定 同 结 果 与 分 析 2.1 菌 种 的 分 离 纯 化 及 鉴 定 纯 培 养 物 于 MRS 培 养 基 培 养 24 h 后, 形 成 表 面 光 滑 边 缘 整 齐 中 央 隆 起 直 径 约 为 0.5 mm1.0 mm 的 乳 白 色 菌 落 ( 图 1) 显 微 镜 下 观 察 染 色 结 果, 菌 体 的 形 状 为 球 形 或 椭 圆 形, 单 个 成 对 排 列, 菌 体 长 1.0 µm1.5 µm 宽 为 1.0 µm1.2 µm, 革 兰 氏 染 色 阳 性 ( 图 2) 将 菌 株 Q1 活 化 后 接 种 于 MRS 液 体 培 养 基 中, 经 24 h 恒 温 培 养 后 发 现, 菌 株 贴 试 管 壁 并 沿 试 管 壁 向 底 部 生 长, MRS 液 体 培 养 基 表 层 无 菌 生 长, 由 此 说 明 该 菌 为 兼 性 厌 氧 菌 菌 株 于 半 固 体 培 养 基 穿 刺 后, 仅 在 穿 刺 线 上 生 长, 且 边 缘 十 分 清 晰, 表 明 菌 株 无 运 动 性 接 触 酶 和 氧 化 酶 反 应 均 为 阴 性 不 能 利 用 尿 素, 不 能 产 生 H 2 S, 生 理 生 化 鉴 定 结 果 见 表 1

6 636 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 图 1 Fig. 1 划 线 分 离 的 纯 菌 株 Separation of the pure strain crossed 图 2 革 兰 氏 染 色 Fig. 2 Gram s staining 检 测 项 目 Items 利 用 尿 素 Usage of urea 接 触 酶 实 验 Catalase test 利 用 山 梨 糖 Usage of sorbose 麦 芽 糖 水 解 Maltose test 利 用 山 梨 醇 Usage of sorbierite 利 用 木 糖 Usage of xylose 水 解 淀 粉 Hydrolysis of starch β- 半 乳 糖 苷 Usage of ONPG 产 生 硫 化 氢 Production of H 2 S 明 胶 液 化 Gelatin liquefaction 利 用 松 三 糖 Usage of melizitose 6.5% NaCl 生 长 Growth at 6.5% NaCl 4% NaCl 生 长 Growth at 4% NaCl 注 : : 阳 性 反 应 ; : 阴 性 反 应. Note: : Positive reaction; : Negative reaction. 表 1 生 理 生 化 鉴 定 试 验 结 果 Table 1 Physiological identification results 结 果 Results 检 测 项 目 Items 利 用 果 糖 Usage of fructose 利 用 乳 糖 Usage of lactose 利 用 松 二 糖 Usage of turanose 利 用 半 乳 糖 Usage of galactose 利 用 葡 萄 糖 Usage of glucose 利 用 甘 露 糖 Usage of mannose 利 用 蔗 糖 Usage of sucrose 氧 化 酶 实 验 Oxidase test 利 用 阿 拉 伯 糖 Usage of arabinose 硝 酸 盐 ( 产 气 ) Nitrate aerosis 硝 酸 盐 ( 还 原 ) Nitrate reduction 15 C 生 长 Growth at 15 C 45 C 生 长 Growth at 45 C 结 果 Results

7 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 637 在 培 养 基 中 挑 取 菌 体 变 性 后 离 心 取 上 清 作 为 模 板, 使 用 TaKaRa 16S rdna Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310), 进 行 PCR 扩 增 目 的 片 段, 结 果 见 图 3 将 上 述 扩 增 产 物 用 16S forward 16S internal 和 16S reverse 为 引 物 进 行 测 序, 获 得 Q1 菌 株 16S rdna 部 分 基 因 序 列 ( 长 bp), 在 GenBank 数 据 库 中 通 过 在 线 序 列 BLAST 比 对 检 索, 结 果 显 示 Q1 菌 株 的 16S rdna 序 列 与 Enterococcus durans strain 98D NR 的 16S rdna 序 列 具 有 100% 同 源 性 使 用 Neighbor-Joining 构 建 系 统 发 育 树 ( 图 4) 结 果 显 示, 系 统 发 育 树 上 与 菌 株 Q1 16S rdna 同 源 性 较 高 的 均 为 肠 球 菌 属 (Enterococcus durans), 与 Enterococcus durans strain 98D NR 菌 株 在 发 育 树 上 聚 为 一 簇, 具 有 较 近 的 进 化 距 离 图 3 菌 落 PCR 的 16S rdna 扩 增 结 果 Fig. 3 Colony PCR results of bacterial 16S rdna 注 : 1: 16S rdna PCR 产 物 ; M: DL2000 DNA marker. Note: 1: PCR product of 16S rdna; M: DL2000 DNA marker. 图 4 依 据 16S rdna 序 列 构 建 的 菌 株 Q1 与 相 关 菌 株 的 系 统 发 育 树 Fig. 4 Phylogenetic tree of strain Q1 and related strains based on 16S rdna 注 : 发 育 树 节 点 的 数 字 表 示 Bootstrap 值 ; 括 号 中 的 数 字 为 序 列 登 录 号 ; 标 尺 代 表 的 进 化 距 离 单 位. Note: The numbers at each branch points indicate the percentage supported by bootstrap. Numbers in parentheses are accession numbers of sequence in GenBank. The scale bar indicates the evolutionary distance unit.

8 638 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 因 此, 根 据 以 上 形 态 特 点 和 生 理 生 化 特 征, 结 合 伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册 [17] 和 乳 酸 细 菌 - 基 础 技 术 和 应 用 [18], 将 分 离 的 菌 种 Q1 (GenBank 登 录 号 JX093584) 可 鉴 定 为 肠 球 菌 属 的 棉 籽 糖 肠 球 菌, 将 其 命 名 为 Enterococcus raffi- nosus Q1 2.2 诱 变 种 育 菌 株 对 数 生 长 期 的 测 定 : 供 诱 变 处 理 的 细 菌 一 般 要 求 处 于 对 数 生 长 期, 此 时 菌 体 生 长 状 态 比 较 同 步, 容 易 变 异, 重 复 性 较 好 ; 同 时 为 了 保 证 处 理 时 具 有 一 定 的 细 胞 浓 度, 增 加 可 能 变 异 的 细 胞 总 数, 常 选 用 对 数 生 长 中 后 期 的 细 胞 供 处 理 因 此 选 用 培 养 8 h ( 对 数 生 长 中 后 期 ) 的 菌 液 制 菌 悬 液, 进 行 诱 变 处 理 ( 图 5) 图 5 出 发 菌 株 Q1 生 长 曲 线 Fig. 5 The growth curve of the Q1 strain 紫 外 诱 变 致 死 率 的 测 定 : 紫 外 线 处 理 微 生 物 时, 其 吸 收 射 线 的 剂 量 决 定 于 紫 外 灯 的 功 率 灯 管 与 被 照 微 生 物 的 距 离 及 照 射 的 时 间 本 实 验 采 用 15 W 紫 外 灯, 固 定 照 射 距 离 为 30 cm, 在 此 条 件 下, 一 般 微 生 物 营 养 体 35 min 即 可 致 死, 而 革 兰 氏 阳 性 菌 只 需 min 就 可 死 亡 照 射 不 同 时 间 诱 变 的 致 死 率 如 图 6 所 示 [19] [20] Leslie A. 等 和 O donovan 等 研 究 表 明, 致 死 率 为 99.0% 时, 可 保 证 菌 体 发 生 最 大 程 度 的 突 变, 故 在 本 实 验 中 选 择 在 15 W 紫 外 灯, 菌 悬 液 距 紫 外 灯 管 30 cm 下, 照 射 60 s 为 紫 外 诱 变 的 剂 量 图 6 紫 外 照 射 时 间 与 菌 株 致 死 率 的 关 系 Fig. 6 The relation between the time of yltraviolet radiation and the lethal rate 紫 外 诱 变 结 果 : 以 紫 外 照 射 60 s 对 菌 株 Q1 连 续 进 行 4 轮 诱 变, 从 初 筛 平 板 上 筛 选 生 长 较 大 较 黄 的 菌 落 划 斜 面 15 C 恒 温 培 养, 复 筛 生 长 较 快 的 菌 株 培 养, 测 定 溶 液 的 ph, 结 果 如 表 2 所 示 综 合 生 长 时 间 及 ph 二 者 因 素, 选 择 Q1-4 进 行 化 学 诱 变 NTG 诱 变 致 死 率 的 测 定 : 亚 硝 基 胍 处 理 微 生 物 时, 其 致 死 率 主 要 与 亚 硝 基 胍 浓 度 处 理 时 间 和 处 理 温 度 有 关, 对 于 细 菌 亚 硝 基 胍 的 处 理 浓 度 一 般 为 g/l, 处 理 时 间 一 般 为 2060 min [21] 本 实 验 对 菌 株 Q1-4 分 别 在 不 同 浓 度 的 亚 硝 基 胍 作 用 下, 于 40 C 处 理 30 min, 处 理 后 致 死 率 如 图 7 所 示 本 实 验 中 选 择 亚 硝 基 胍 的 诱 变 浓 度 为 0.4 g/l 表 2 紫 外 诱 变 复 筛 结 果 Table 2 The screening results of UV-induced 菌 株 长 出 时 间 Strains Growth times (h) ph Q Q Q Q Q Q Q

9 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 639 图 7 NTG 对 菌 株 致 死 率 的 影 响 Fig. 7 Fatal effect of NTG on strain NTG 诱 变 : 将 经 过 NTG 诱 变 的 悬 液 涂 布 在 溴 甲 酚 紫 - 碳 酸 钙 平 板 培 养 基 上, 待 菌 落 长 出 后, 挑 选 较 大 较 黄 且 比 对 照 较 早 长 出 的 菌 落 划 斜 面 15 C 培 养, 进 一 步 筛 选 生 长 较 快, 产 酸 较 好 的 菌 株 诱 变 结 果 见 表 3 所 示 由 表 3 可 以 看 出, Q1-4-6 生 长 最 快 产 酸 最 高, 与 原 始 菌 株 相 比, 长 出 时 间 加 快 8 h, ph 降 低 了 0.42 (8.97%) 将 诱 变 菌 株 在 低 温 条 件 下 连 续 传 代, 测 定 诱 变 菌 株 的 稳 定 性 诱 变 菌 株 性 能 稳 定 性 的 测 定 : 菌 株 在 低 温 条 件 下 连 续 传 代 10 代, 选 取 第 1 代 第 5 代 第 10 代 菌 株, 发 酵 48 h 后 提 取 粗 酶 液, 测 定 LDH 酶 活, 结 果 如 表 4 所 示 从 表 4 可 以 看 出, Q1-4-6 菌 株 的 第 1 代 第 5 代 和 第 10 代 相 比, 乳 酸 脱 氢 酶 活 性 基 本 一 致 由 此 可 以 说 明, Q1-4-6 菌 株 具 有 遗 传 稳 定 性 菌 株 Strains 表 3 Table 3 NTG 诱 导 结 果 NTG induced results 长 出 时 间 Growth time (h) ph Q Q Q Q Q Q Q 表 4 诱 变 菌 株 遗 传 稳 定 性 Table 4 Stable property of mutation strain 传 代 次 数 Passage times 第 1 代 The first generation 第 5 代 The fifth generation 第 10 代 The tenth generation 2.3 突 变 株 与 出 发 株 的 性 能 比 较 酶 活 Enzyme activity (U/mL) 2.7± ± ± C 20 C 生 长 及 产 酸 的 比 较 : 将 突 变 株 与 出 发 菌 株 分 别 活 化 24 h 后, 分 别 于 15 C 20 C 培 养 120 h, 菌 株 的 生 长 及 产 酸 情 况 如 图 813 所 示 由 图 8 图 9 可 以 看 出, 在 15 C 20 C 的 低 温 条 件 下, 出 发 菌 株 的 生 长 速 率 较 缓 慢, 诱 变 菌 株 生 长 速 率 明 显 高 于 出 发 菌 株 且 菌 液 浓 度 显 著 高 于 出 发 菌 株, 说 明 在 低 温 条 件 下, 诱 变 菌 株 比 出 发 菌 株 生 长 更 好 15 C 培 养 时, 诱 变 菌 株 很 迅 速 地 进 入 对 数 生 长 期, 并 且 对 数 生 长 期 较 长, 而 出 发 菌 株 则 经 过 8 h 的 潜 伏 期 后 进 入 对 数 生 长 期 ; 当 出 发 菌 株 进 入 稳 定 期 时, 诱 变 菌 株 还 处 于 对 数 生 长 期 ; 诱 变 菌 株 的 光 密 度 值 最 高 出 现 在 64 h, 为 2.404, 而 出 发 菌 株 的 的 光 密 度 值 最 高 出 现 在 48 h, 为 由 此 表 明, 诱 变 菌 株 相 对 于 出 发 菌 株 具 有 更 长 的 生 长 周 期 在 20 C 条 件 下 培 养 80 h 后, 出 发 菌 株 的 光 密 度 值 呈 现 下 降 趋 势, 出 发 菌 株 出 现 了 死 亡 而 变 异 菌 株 仍 处 于 稳 定 期, OD 值 保 持 在 2.54 左 右 由 图 10 图 11 可 见, 在 15 C 的 低 温 条 件 下, 出 发 菌 株 ph 下 降 的 总 体 趋 势 和 变 异 菌 株 接 近, 但 ph 下 降 值 明 显 小 于 变 异 菌 株, 产 酸 量 也 较 突 变 株 低, 120 h 培 养 结 束 时, Q1-4-6 酸 度 为 4.55, 而 Q1 仅 为 3.75 在 20 C 培 养 时, 变 异 菌 株 Q1-4-6 在 前 8 h ph 下 降 速 度 特 别 快, 培 养 基 中 ph 由 7.0 迅 速 下 降 为 5.06, 而 出 发 菌 株 Q1 下 降

10 640 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 较 慢, 培 养 基 中 ph 由 7.0 下 降 为 h 后, 培 养 基 中 ph 下 降 趋 于 平 缓 当 培 养 88 h 后, 出 发 菌 株 Q1 的 ph 保 持 在 4.3 左 右 几 乎 不 变, 而 变 异 菌 株 Q1-4-6 的 ph 仍 处 于 下 降 趋 势 酸 度 曲 线 变 化 二 者 基 本 一 致, 但 产 酸 量 变 异 菌 株 显 著 高 于 出 发 菌 株 ( 图 12 图 13) C 20 C 糖 降 解 率 的 比 较 : 由 图 14 可 以 看 出, 采 用 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 法 (DNS) 测 定 葡 萄 糖 标 准 曲 线, 曲 线 拟 合 后 相 关 性 很 好 (R 2 = ), 可 用 于 待 测 菌 株 的 降 糖 能 力 评 价 出 发 菌 株 与 变 异 菌 株 在 15 C 培 养 120 h, 降 糖 结 果 如 图 15 所 示 由 图 15 可 见, 随 着 培 养 时 图 8 Q1-4-6 和 Q1 菌 15 C 生 长 曲 线 Fig. 8 The growth curve of Q1-4-6 and Q1 strains at 15 C 图 9 Q1-4-6 和 Q1 菌 20 C 生 长 曲 线 Fig. 9 The growth curve of Q1-4-6 and Q1 strains at 20 C

11 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 641 图 C 下 Q1-4-6 在 MRS 培 养 基 中 的 ph 及 酸 度 的 变 化 Fig. 10 The ph and acidity variation of Q1-4-6 in MRS at 15 C 图 C 下 Q1-4-6 在 MRS 培 养 基 中 的 ph 及 酸 度 的 变 化 Fig. 12 The ph and acidity variation of Q1-4-6 in MRS at 20 C 图 C 下 Q1 在 MRS 培 养 基 中 的 ph 及 酸 度 的 变 化 Fig. 11 The ph and acidity variation of Q1 in MRS at 15 C 间 的 增 加, 出 发 菌 株 Q1 变 异 菌 株 Q1-4-6 的 葡 萄 糖 含 量 均 逐 渐 减 少, 而 变 异 菌 株 Q1-4-6 比 出 发 菌 株 Q1 有 更 高 的 耗 糖 速 率 和 糖 转 化 率 培 养 120 h 时, 变 异 菌 株 Q1-4-6 的 葡 萄 糖 含 量 为 mg, 而 出 发 菌 株 Q1 的 葡 萄 糖 含 量 为 mg 如 图 16 所 示, 出 发 菌 株 与 变 异 菌 株 在 20 C 图 C 下 Q1 在 MRS 培 养 基 中 的 ph 及 酸 度 的 变 化 Fig. 13 The ph and acidity variation of Q1 in MRS at 20 C 培 养 时, 12 h 内 变 异 菌 株 Q1-4-6 与 出 发 菌 株 Q1 的 葡 萄 糖 含 量 几 乎 一 致, 1224 h, 变 异 菌 株 Q1-4-6 葡 萄 糖 含 量 下 降 很 快, 由 mg 降 为 mg, 葡 萄 糖 含 量 下 降 了 mg, 而 出 发 菌 株 Q1 仅 下 降 了 mg 培 养 结 束 时, 变 异 菌 株 Q1-4-6 的 葡 萄 糖 含 量 为 mg, 出 发

12 642 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 图 14 葡 萄 糖 标 准 曲 线 Fig. 14 The standard curve of glucose 图 15 Q1-4-6 和 Q1 的 15 C 降 糖 曲 线 Fig. 15 The Glucose curve of Q1-4-6 and Q1 at 15 C 菌 株 Q1 的 葡 萄 糖 含 量 为 mg, 变 异 菌 株 的 残 糖 量 比 出 发 菌 株 少 mg C 生 长 及 产 酸 的 比 较 : 由 图 17 可 以 看 出, 在 37 C 的 自 然 条 件 下, 出 发 菌 株 和 诱 变 菌 株 的 生 长 速 率 的 差 异 不 大, 但 均 略 低 于 诱 变 菌 株 说 明 诱 变 后 的 菌 株 有 了 更 宽 的 生 长 温 度 适 应 能 力 由 图 18 可 见, 出 发 菌 株 Q1 与 变 异 菌 株 Q1-4-6 ph 值 的 总 体 下 降 趋 势 基 本 一 致, 06 h 迅 速 下 降, 之 后 趋 于 平 缓 在 04 h, 变 异 菌 株 ph 图 16 Q1-4-6 和 Q1 的 20 C 降 糖 曲 线 Fig. 16 The Glucose curve of Q1-4-6 and Q1 at 20 C 图 C 下 Q1-4-6 和 Q1 在 MRS 培 养 基 中 的 生 长 曲 线 Fig. 17 The growth curve of Q1-4-6 and Q1 in MRS at 37 C

13 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 643 图 C 下 Q1-4-6 和 Q1 在 MRS 培 养 基 中 的 ph 值 变 化 Fig. 18 The ph variation of Q1-4-6 and Q1 in MRS at 37 C 图 19 Q1-4-6 CL04 和 CL05 的 15 C 生 长 曲 线 Fig. 19 The growth curve of Q1-4-6, CL04 and CL05 strains at 15 C 值 下 降 略 快 于 出 发 菌 株, 之 后 的 20 h, 两 者 的 ph 值 差 异 不 明 显, 但 出 发 菌 株 总 体 均 略 低 于 变 异 菌 株 2.4 突 变 株 与 购 买 菌 株 在 15 C 生 长 及 产 酸 比 较 如 图 1921 所 示, 在 15 C 培 养 120 h, 突 变 株 生 长 产 酸 均 好 于 干 酪 乳 杆 菌 (CL04) 和 嗜 热 链 球 菌 (CL05) 突 变 株 生 长 潜 伏 期 短, 生 长 快, 产 酸 量 高 3 结 论 与 讨 论 (1) 从 玛 曲 牧 民 自 制 酸 奶 中 分 离 得 到 一 株 乳 酸 菌, 根 据 其 形 态 学 特 征 生 理 生 化 特 性, 同 时 结 合 16S rdna 序 列 分 析 结 果, 将 分 离 的 菌 种 鉴 定 为 肠 球 菌 属 (Enterococcus) 棉 籽 糖 肠 球 菌 (E. raffinosus) (2) 将 分 离 的 纯 菌 株 经 过 连 续 的 紫 外 诱 变 和 亚 硝 基 胍 诱 变, 最 终 筛 选 出 一 株 在 低 温 下 生 长 迅 速, 产 酸 良 好 的 菌 株, 通 过 乳 酸 脱 氢 酶 活 力 测 定, 证 明 变 异 菌 株 具 有 遗 传 稳 定 性, 将 最 终 诱 变 成 功 的 菌 株 编 号 为 Q1-4-6 (3) 将 出 发 菌 株 与 诱 变 菌 株 在 15 C 20 C 比 较 其 生 长 产 酸 和 糖 降 解 量 发 现, 诱 变 菌 株 均 好 于 出 发 菌 株, 说 明 诱 变 菌 株 比 出 发 菌 株 更 适 宜 在 低 温 条 件 下 生 长 在 37 C 的 自 然 条 件 下, 诱 变 菌 株 和 出 发 菌 株 的 生 长 速 率 差 异 不 大, 但 均 略 图 C 下 3 个 菌 株 在 培 养 基 中 ph 的 变 化 Fig. 20 The ph variation of Q1-4-6, CL04 and CL05 in MRS at 15 C 图 C 下 3 个 菌 株 在 培 养 基 中 酸 度 的 变 化 Fig. 21 The acidity variation of Q1-4-6, CL04 and CL05 in MRS at 15 C

14 644 微 生 物 学 通 报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.4 高 于 出 发 菌 株 说 明 诱 变 后 的 菌 株 有 了 更 宽 的 生 长 温 度 适 应 能 力 (4) 在 15 C 培 养 发 现, 诱 变 菌 株 生 长 速 率 产 酸 量 均 高 于 购 买 菌 株 干 酪 乳 杆 菌 (CL04) 和 嗜 热 链 球 菌 (CL05) 近 年 来, 国 内 外 对 于 乳 酸 菌 的 研 究 有 了 长 足 的 发 展, 对 于 选 育 高 温 乳 酸 菌 高 产 酸 能 力 乳 酸 菌 高 产 SOD 乳 酸 菌 已 有 报 道, 但 对 于 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 诱 变 选 育 未 见 报 道 本 研 究 选 用 复 合 诱 变 的 方 法, 有 效 提 高 了 诱 变 效 率, 避 免 了 单 一 诱 变 所 产 生 的 不 利 因 素 ( 紫 外 诱 变 易 光 复 活 ), 进 而 形 成 了 稳 定 的 突 变 体 在 诱 变 处 理 后 的 培 养 过 程 中 添 加 适 量 的 酵 母 膏 可 以 提 高 突 变 率 和 增 加 变 异 幅 度 变 异 菌 株 在 低 温 15 C 20 C 的 产 酸 均 高 于 出 发 菌 株, 在 37 C 培 养 时, 诱 变 菌 株 和 出 发 菌 株 的 生 长 速 率 差 异 不 大, 但 略 高 于 出 发 菌 株 由 此 可 以 说 明 变 异 菌 株 的 遗 传 物 质 发 生 了 改 变, 但 具 体 是 由 于 形 成 嘧 啶 二 聚 体 还 是 由 于 G:C-A:T 转 换 或 G:C-T:A 颠 换 而 导 致 突 变 尚 不 清 楚, 此 结 果 有 待 于 进 一 步 进 行 分 子 水 平 上 的 研 究 参 考 文 献 [1] González CJ, Encinas JP, García-Lópea ML, et al. Characterization and identification of lactic acid bacteria from freshwater fishes[j]. Food Microbiology, 2000, 17(4): [2] 刘 晓 蓉, 邓 毛 程, 连 晓 蔚. 腌 肉 中 乳 酸 菌 的 分 离 选 育 [J]. 中 国 酿 造, 2009(1): [3] 王 哲, 孟 宪 志, 赵 伟. 优 良 乳 酸 球 菌 的 筛 选 及 增 殖 研 究 [J]. 现 代 食 品 科 技, 2007, 23(11): [4] Katikou P, Ambrosiadis I, Georgantelis D, et al. Effect of Lactobacillus-protective cultures with bacteriocin-like inhibitory substances producing ability on microbiological, chemical and sensory changes during storage of refrigerated vacuum-packaged sliced beef[j]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(6): [5] Castellano P, Vignolo G. Inhibition of Listeria innocua and Brochothrix thermosphacta in vacuum-packaged meat by addition of bacteriocinogenic Lactobacillus curvatus CRL705 and its bacteriocins[j]. Letters in Applied Microbiology, 2006, 43(2): [6] Tomé E, Teixeira P, Gibbs PA. Anti-listerial inhibitory lactic acid bacteria isolated from commercial cold smoked salmon[j]. Food Microbiology, 2006, 23(4): [7] Weiss A, Hammes WP. Lactic acid bacteria as protective cultures against Listeria spp. on cold-smoked salmon[j]. European Food Research and Technology, 2006, 222(3): [8] 刘 墨, 王 长 文, 周 海 柱, 等. 乳 酸 杆 菌 的 研 究 进 展 [J]. 吉 林 医 药 学 院 院 报, 2010, 31(4): [9] Koizumi S, Wakita D, Sato T, et al. Essential role of toll-like receptors for dendritic cell and NK1.1 cell-dependent activation of type 1 immunity by Lactobacillus pentosus strain S-PT 84[J]. Immunology Letters, 2008, 120(1/2): [10] Garneau S, Martin NI, Vederas JC. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria[j]. Biochimie, 2002, 84(5/6): [11] O Sullivan L, Ross RP, Hill C. Potential of bacteriocin-producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality[j]. Biochimie, 2002, 84(5/6): [12] Wisselink HW, Weusthuis RA, Eggink G, et al. Mannitol production by lactic acid bacteria: a review[j]. International Dairy Journal, 2002, 12(2/3): [13] 葛 红 莲, 郭 翠 红, 张 军 令. 两 株 乳 酸 菌 的 分 离 鉴 定 及 产 酸 性 能 的 研 究 [J]. 周 口 师 范 学 院 学 报, 2009, 26(2): [14] 徐 晶 雪, 邹 积 宏, 袁 杰 利. 降 胆 固 醇 乳 酸 菌 的 筛 选 及 应 用 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 微 生 态 学 杂 志, 2009, 21(6):

15 吴 慧 昊 等 : 乳 酸 菌 低 温 菌 株 的 复 合 诱 变 选 育 645 [15] 吴 谋 成. 食 品 分 析 与 感 官 评 定 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 2011: [16] 齐 香 君, 苟 金 霞, 韩 戌 珺, 等. 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 比 色 法 测 定 溶 液 中 还 原 糖 的 研 究 [J]. 纤 维 素 科 学 与 技 术, 2004, 12(3): 1719, 30. [17] 布 坎 南 RE, 吉 布 斯 NE. 伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册 [M]. 第 8 版. 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所, 译. 北 京 : 科 学 出 版 社, 1984: [18] 张 刚. 乳 酸 细 菌 - 基 础 技 术 和 应 用 [M]. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社, 2007: [19] Leslie A, Glatz BA, Hammond EG. Mutagenesis of strains of Propionibacterium to produce cold-sensitive mutants[j]. Journal of Dairy Science, 1983, 66(12): [20] O donovan GA, Kearney CL, Ingraham JL. Mutants of Escherichia coli with high minimal temperatures of growth[j]. Journal of Bacteriology, 1965, 90(3): [21] 施 巧 琴, 吴 松 刚. 工 业 微 生 物 育 种 学 [M]. 第 3 版. 北 京 : 科 学 出 版 社, 2003: Nature 新 闻 : 发 布 基 因 工 程 标 准 化 元 件 科 技 信 息 摘 录 在 美 国 国 家 科 学 基 金 会 的 资 助 下,BIOFAB 于 2009 年 在 加 州 成 立, 该 机 构 旨 在 建 立 标 准 化 的 DNA 序 列 元 件, 以 便 更 好 地 控 制 基 因 表 达, 推 动 合 成 生 物 学 的 发 展 利 用 这 些 标 准 化 的 DNA 序 列, 生 物 学 家 们 只 需 插 入 各 种 基 因 就 能 够 进 行 工 程 改 造, 获 得 生 产 药 物 或 者 执 行 其 他 任 务 的 特 殊 细 胞 BIOFAB 就 像 是 一 家 特 殊 的 工 厂, 专 门 开 发 基 因 工 程 所 需 的 DNA 工 具 日 前,BIOFAB 推 出 了 他 们 的 第 一 批 产 品, 能 够 在 大 肠 杆 菌 中 精 确 控 制 基 因 表 达 的 DNA 序 列 元 件 人 们 发 现, 即 使 是 在 相 当 成 熟 的 表 达 体 系 中 ( 如 E. coli), 插 入 基 因 的 表 达 也 并 不 一 定 符 合 预 期, 这 是 目 前 合 成 生 物 学 面 临 的 一 个 关 键 性 障 碍 基 因 表 达 包 括 RNA 转 录 和 蛋 白 翻 译, 要 想 在 细 胞 中 表 达 目 的 基 因, 就 需 要 在 其 上 游 添 加 一 些 识 别 序 列 例 如, 合 成 RNA 转 录 本 需 要 启 动 子 序 列, 而 蛋 白 翻 译 需 要 核 糖 体 结 合 位 点 RBS 过 去 三 十 年 来, 科 学 家 们 积 累 了 大 量 上 述 序 列, 并 利 用 它 们 来 表 达 目 的 基 因 不 过, 有 些 序 列 能 力 强, 有 些 序 列 能 力 弱, 导 致 RNA 和 蛋 白 的 合 成 水 平 并 不 稳 定 BIOFAB 的 Drew Endy 和 Adam Arkin 在 本 周 的 Nature Methods 杂 志 上 发 表 了 两 篇 文 章, 指 出 上 述 DNA 元 件 的 作 用 效 果 难 以 预 测 他 们 领 导 研 究 人 员 将 许 多 不 同 的 启 动 子 -RBS 序 列 组 合, 插 入 到 编 码 荧 光 蛋 白 的 基 因 前, 然 后 检 测 其 中 的 蛋 白 合 成 水 平 研 究 显 示, 其 后 搭 配 的 基 因 不 同, 各 组 合 的 作 用 效 果 也 大 相 径 庭 文 章 还 引 用 了 此 前 的 一 项 发 现 指 出, 希 望 以 特 定 水 平 表 达 蛋 白 的 科 学 家 们, 实 际 只 有 50% 的 几 率 获 得 所 需 产 量 这 种 基 因 表 达 的 随 意 性 是 合 成 生 物 学 家 们 面 临 的 主 要 挑 战, 因 为 他 们 往 往 需 要 建 立 多 基 因 表 达 的 系 统 为 此,BIOFAB 研 究 团 队 为 大 肠 杆 菌 E. coli 设 计 了 不 干 扰 下 游 DNA 的 启 动 子 和 RBS 序 列 这 些 元 件 的 作 用 效 果 与 搭 配 的 目 的 基 因 无 关, 能 够 帮 助 科 学 家 们 更 严 格 地 控 制 基 因 表 达 研 究 显 示, 采 用 这 些 元 件, 大 大 提 升 了 基 因 表 达 水 平 达 到 预 期 的 几 率 ( 约 93%) 现 在, 研 究 者 们 可 以 通 过 网 络 免 费 获 取 这 些 序 列 ( 见 的 一 些 同 事 已 经 开 始 从 中 受 益 此 外, 研 究 人 员 还 设 计 了 一 个 统 计 学 方 法, 用 来 衡 量 启 动 子 和 RBS 序 列 的 性 能 可 变 性 这 一 方 法 也 适 用 于 合 成 生 物 学 中 的 其 他 遗 传 学 元 件 科 学 家 们 可 以 在 此 基 础 上 建 立 各 元 件 的 规 格 表, 使 自 己 的 研 究 和 成 果 共 享 更 为 方 便 摘 自 中 国 生 物 技 术 信 息 网 2013/3/26