86 doi.3969/j.issn.674-45.6.3.7 分子影像学杂志 6 年第 39 卷第 3 期 基础研究 mir-7-5p mir-9a let-7b 宋先璐, 廖志伟, 余宏伟, 杨光平, 殷俊 广州医科大学附属肿瘤医院放疗科, 肺癌研究室, 广东广州 595 摘要 : 目的探讨 mir-7-5p mir-9a let-7b 表达水平与非小细胞肺癌顺铂耐药关系 方法以人非小细胞肺癌细胞系 及其耐药株 /DDP 为研究对象, 采用 RT-PCR 法检测 mir-7-5p mir-9a 及 let-7b 在细胞中的表达水平, 采用 cck8 检测其细胞存活情况, 采用细胞克隆平台方法, 检测转染前后细胞的增殖情况, 采用流式细胞仪检测转染前后细胞的凋亡情况 结果 () /DDP 细胞 mir-7-5p 的表达水平是 细胞的.±.5 倍 (P<.5);/DDP 细胞 mir-9a 的表达水平是 细胞的 7.4 ±.5 倍 (P<.5); 而 /DDP 细胞 let-7b 的表达水平是 细胞的 (6.54 ±.9)%(P<.5);() 转染 mir-7-5pmimic,mir-9a mimic 以及 let-7b inhibitor 后对顺铂的敏感性下降 (P<.5);/ddp 转染 mir-7-5p inhibitor, mir-9a inhibitor 以及 let-7b mimic 后对顺铂的敏感性增加 (P<.5);(3) 转染 mir-7-5p mimic,mir-9a mimic 以及 let-7b inhibitor 后, 细胞形成克隆集落数量数量多于对照组 (P<.5); 而 /ddp 转染 mir-7-5p inhibitor,mir-9a inhibitor 以及 let-7b mimic 后, 细胞形成克隆集落数量数量少于对照组 (P<.5);(4) 转染 mir-7-5p mimic,mir-9a mimic 以及 let-7b inhibitor 后, 细胞凋亡率明显低于对照组 (P<.5); 而 /ddp 转染 mir-7-5p inhibitor,mir-9a inhibitor 以及 let-7b mimic 后, 细胞凋亡率明显高于对照组 (P<.5) 结论 Mir-7-5p mir-9a 表达水平升高,let-7b 表达水平下降, 可以促进肺癌细胞增殖, 抑制其凋亡以及使肺癌细胞对顺铂敏感性下降 关键词 : 肺癌 ;mir-7-5p;mir-9a;let-7b; 顺铂 ; 敏感性 The relationship between the expression level of mir-7-5p mir-9a let-7b and the cisplatin-resistant SONG Xianlu, LIO Zhiwei, YU Hongwei, YNG Guangping, YIN Jun Department of Radiotherapy; Lung Cancer Institute, Cancer Center of Guangzhou Medical University, Guangzhou 595, China bstract: Objective To discuss mir-7, mir-9 and let-7 expression in non small cell lung cancer and cisplatin resistance and clinical application. To provide experimental data for prediction of lung cancer patients as a sign of cisplatin chemotherapy sensitivity. Method Non small cell lung cancer cell line and its resistant strain /DDP were used as the cell research object. The expression level of mir-7, mir-9 and let-7 in the cell was detected by RT-PCR method. CCK8 was used to detect the survival of the transfected cells after Cisplatin maintenance culture compare to untransfected cells. fter transfection, cell proliferation was detected by Cell plate cloning experiments and apoptosis rate was measured by Flow cytometry. Result () The expression level of mir-7 in /DDP cells was (. ±.5) times (P<.5) of cells, and the expression level of mir-9 in /DDP cells was (7.4±.5) times of cells (P<.5). However, the expression of let-7 in /DDP cells was (6.54 ±.9)% (P<.5) of cells; () cells transfected with mir-7b, 9a mimic and let-7 microrn inhibitor, compared to control group, showed a lower sensitivity to cisplatin (P<.5); while the sensitivity to cisplatin of /DDP cells transfected with mir-7b, 9a inhibitor and let-7 mirn increased(p<.5); (3) transfected with mir-7b, 9a mimic and let-7 microrn inhibitor, the cells formed colony number is greater than that of the control group, the difference is statistically significant (P<.5); and /DDP transfectd with mir-7b, 9a inhibitor and let-7 mirn, the cells formed clones colony quantity less than that of the control group, the difference is statistically significant (P<.5); (4) The apoptosis rate of cells transfected with mir-7b, 9a mimic and let-7 microrn inhibitor, apoptosis rate was significantly lower than the control group, the difference has statistical significance (P<.5); For /DDP cells transfected with mir-7b, 9a inhibitor and let-7 mirn, the apoptosis rate was significantly higher than that of the control group, the difference was statistically significant (P<.5). Conclusion Mir-7, mir-9 expression level increased, let-7 expression level decreased, can promote the proliferation of lung cancer cells, inhibit apoptosis, as well as the decrease of lung cancer cell sensitivity to cisplatin. Key words: lung cancer; mir-7; mir-9; let-7; cisplatin; sensitivity 收稿日期 :6-5-6 基金项目 : 广东省科技计划项目 (6575); 广东省医学科研基金 (6555) 作者简介 : 宋先璐, 副主任医师,E-mail: songxianlu@tom.com 通信作者 : 殷俊, 博士, 助理研究员,E-mail: 534468@qq.com 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率 [] 都高居前列 在肺癌中, 非小细胞肺癌 (NSCLC) 是最主要的发病类型, 并且 7%~8% 的患者被诊断为晚期 NSCLC 而失去了手术机会, 因此, 化疗是最主要的治疗
http://www.j-fzyx.com 分子影像学杂志 6 年第 39 卷第 3 期 87 [] 手段 但是, 对化疗药物耐药成为患者治疗过程中的 [3-5] 难题 越来越多的研究表明,miRN 在多种癌症的发生发展中起到重要的作用 对肿瘤细胞的增殖 凋亡以及 [6-8] 化疗药物耐药现象均有影响 我们在前期课题的基因芯片的结果中, 发现 表达谱和 /DDP 表达谱之间存在大量的 mirn 表达异常, 其中包括 mir-7-9 家族以及 let-7b 目前许多文献证实, mir-7-9 家族为原癌基因, 能够促进癌症的发生发展, [9-] let-7b 则为抑癌基因, 能够抑制癌症的发生 本文通过细胞和分子生物学实验, 研究了 mir-7-5p mir-9a let-7b 表达水平与非小细胞肺癌顺铂耐药关系, 旨在探讨导致 NSCLC 化疗耐药的机制, 为个体化治疗方案的制定提供重要的理论基础和方法 材料与方法. 实验材料本研究使用的肺癌细胞株 及其被诱导成顺铂耐药细胞株 /DDP 由广州医科大学附属肿瘤研究所实验室提供. 细胞培养 /DDP 细胞采用含 % 胎牛血清 含双抗的 RPMI 64 培养基, 于 37 5%CO 饱和湿度 85% 条件下培养, 细胞采用.5% 胰蛋白酶消化传代或离心去掉培养液加冻存液 (DMSO 与血清 9 的比例配置 ) 冻存细胞 其中 /DDP 培养基含有 μg/ml 的顺铂以维持细胞的耐药性 取对数生长期细胞为实验对象.3 细胞总 RN 的提取及完整性检测 和 /DDP 细胞分别接种于培养瓶中, 加入 5 ml RPMI 64 完全培养基培养, 待细胞生长达到 85% 左右融合生长时, 采用 Trizol 试剂提取总 RN.4 实时荧光定量 PCR(Real-time PCR, qrt-pcr) 对转染处理前后 和 /DDP 细胞 mir-7, mir-9,let-7 表达水平的验证.5 转染效率测试 Mir-7,mir-9,let-7 模拟物,mir-7,mir-9,let-7 抑制物和阴性对照 NC(negative control) 分别用 lipofectamine RNimax 进行转染.6 Cck8 检测 /ddp 细胞株的 ic5 按照细胞计数试剂盒 (cck-8) 操作说明进行, 将细胞接种至 96 孔板内, 密度约为 ~3/ 孔, 细胞贴壁 4 h 后每孔加入 μl 含 ddp 的完全培养基, 细胞系 DDP 浓度梯度为.5.5.75..5.5. μg/ml;/ddp 的 DDP 浓度梯度为. 4. 6. 8... 6 μg/ml 同时设置只加培养基的调零孔和只加单细胞悬液的对照孔, 每组设置 3 个辅孔, 培 养 48 h 后将培养基换成含有 %cck-8 的完全培养基继续培养 3~6 h, 酶标仪检测 45 nm 波长的吸光值, 细胞活力 %=( 加药 - 空白 / 加药 - 空白 )%, 使用 SPSS 软件 probit 回归模型计算出细胞的 ic5.7 细胞克隆平台实验取对数生长期的单层培养细胞, 用.5% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞, 加入含血清的 64 培养基制备成单细胞悬液 将细胞悬液进行稀释, 以每孔 个细胞接种在 6 孔板中, 并轻轻转动 6 孔板, 使细胞分散均匀 置 37 5% CO 及饱和湿度的环境下, 静置培养 ~ 周 经常观察, 出现肉眼可见的克隆时, 终止培养 弃去上清液, 用 PS 小心浸洗 次 6 孔板中每孔加纯甲醇 ml, 固定 5 min 然后去固定液, 每孔加适量 Giemsa 应用染色液 ml, 静置 3 min, 然后用流水缓慢洗去染色液, 空气干燥 将 6 孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片, 用肉眼直接计数克隆, 或在显微镜 ( 低倍镜 ) 计数大于 个细胞的克隆数.8 细胞凋亡分析样本数据用流式分析软件 Flowjo7.6. 进行分析 凋亡率 = 早期凋亡率 + 晚期凋亡率 实验均重复 3 次.9 统计学方法采用 SPSS 3. 以及 GraphPad Prism 6 Demo 软件进行统计分析, 实验数据以均数 ± 标准差表示, 定量资料组间比较采用 t 检验分析, 检验水准仅 =.5 P<.5 为差异有统计学意义 结果. 实时荧光定量 PCR 检测转染前后细胞株 mir-7, mir-9,let-7 表达.. mirn 完整性检测 Trizol 试剂提取的 细胞和 /DDP 细胞总 RN, 并经紫外分光光度计检测其纯度和浓度, 6/ 8 的比值分别为.99 和.98, 6/ 3 的比值分别为.57 和.54 说明总 RN 纯度较高, 无蛋白及 DN 的污染 琼脂糖凝胶电泳试验显示 ( 图 ), 条带清晰,8S/8S 亮度比值均在 以上, 说明提取细胞总 RN 完整性好, 无明显降解 /DDP 图 及 /DDP 细胞 RN 电泳结果
88 分子影像学杂志 6 年第 39 卷第 3 期 http://www.j-fzyx.com.. 细胞株 mir-7 mir-9 let-7 转染前后表达水平检测由图 图 3 显示,RT-PCR 检测转染前后 mir-7 mir-9 以及 let-7 在 NSCLC 细胞株 与 /DDP 中的表达水平, 结果显示, 转染前 mir-7 mir-9 在 /DDP 细胞中的表达水平显著高于其在 细胞中的表达水平,/DDP 细胞 mir-7 的表达水平是 细胞的 (.±.5) 倍 (P<.5) /DDP 细胞 mir-9 的表达水平是 细胞的 (7.4±.5) 倍 (P<.5) 而 let-7 在 /DDP 细胞中的表达水平显著低于其在 细胞中的表达水平,/DDP 细胞 let-7 的表达水平是 细胞的 (6.54±.9)%(P<.5) 提示相比于 细胞株,mi-7 mir-9 在 /ddp 细胞株存在高表达现象,let-7 在 /ddp 细胞株中存在低 表达现象 因而我们选择 以及 /ddp 作为我们进一步研究的细胞株 在转染 48 h 后, 细胞 mir-7 mimic 组的 mir-7 表达水平是 mir-nc 细胞的.64±.7 倍 (P<.5) 细胞 mir-9 mimic 组的 mir-9 表达水平是 mir-nc 细胞的.7±.55 倍 (P<.5) 细胞 let-7 inhibitor 组的 let-7 表达水平是 mir-nc 细胞的 (9.9±.67)%(P<.5) /DDP 细胞 mir-7 inhibitor 组的 mir-7 表达水平是 mir-nc 细胞的 (3.3±.5)%(P<.5) /DDP 细胞 mir-9 inhibitor 组的 mir-9 表达水平是 mir-nc 细胞的 (7.±.6)%(P<.5) /DDP 细胞 let-7 mimic 组的 let-7 表达水平是 mir-nc 细胞的.78 ±.65 倍 (P<.5) 提示细胞转染成功, 细胞转染效率高.5 mir-7 expression by qrt-pcr 8 mir-9 expression by qrt-pcr 3 let-7 expression by qrt-pcr..5..5. 6 4 549/ddp 549/ddp 549/ddp 图 mir-7-5p mir-9a 以及 let-7b 在 细胞株和 /DDP 细胞株中的起始表达量 8 mir-7 mir-9 let-7 expression by qrt-pcr Untreat mir-nc Treated 8 /ddp mir-7 mir-9 let-7 expression by qrt-pcr Untreat mir-nc Treated 6 6 4 4 mir-7mimic mir-9mimic let-7inhibitor mir-7inhibitor mir-9inhibitor 图 3 细胞株转染 mir-7-5p 模拟物,mir-9a 模拟物以及 let-7b 抑制物后 mir-7-5p mir-9a 以及 let-7b 表达量, P<.5.. Mir-7 mir-9 let-7 对细胞顺铂药物敏感性的影响 Cck-8 试剂盒检测显示 : 转染 mir-7b mimic 后, 细胞 IC 5 值为.66 μg/ml,95% 可信区间为.43~.784 μg/ml; 转染 mir-9a mimic 后, 细胞 IC 5 值为.634 μg/ml,95% 可信区间为.44~.87 μg/ml; 转染 let-7 inhibitor 后, 细胞 IC 5 值为.67 μg/ml,95% 可信区间为.48~.78 μg/ml 而对照组 细胞 IC 5 值为.4 μg/ml,95% 可信区间为.358~.444 μg/ml 分别转染 mir-7mimic mir-9a mimic 以及 let- 7inhibitor 后细胞 IC 5 值与对照组 细胞 IC 5 值相比明显升高, 提示 细胞株对顺铂的敏感性下降 (P<.5); 而 /ddp 转染 mir-7b inhibitor 后, 细胞 IC 5 值为 4.4 μg/ml,95% 可信区间为 3.99~4.793 μg/ml; /ddp 转染 mir-9a inhibitor 后, 细胞 IC 5 值为 4.3 μg/ml,95% 可信区间为 3.84~4.6 μg/ml;/ddp 转染 let-7 mimic 后, 细胞 IC 5 值为 4.43 μg/ml,95% 可信区间为 4.49~4.797 μg/ml 对照组 /ddp 细胞株 IC 5 值为 5.77,95% 可信区间为 5.39~6.36 μg/ml /ddp 细胞株分别转染 mir-7b inhibitor mir-9a inhibitor 以及 let-7 mimic 后, 细胞 IC 5 值与对照组 / ddp 细胞 IC 5 值相比明显降低, 提示 /ddp 细胞株对顺铂的敏感性增加 (P<.5, 图 4)
Cell viability (%) Cell viability (%) http://www.j-fzyx.com 分子影像学杂志 6 年第 39 卷第 3 期 89..8 ddp mir-7mimic mir-9mimic..8 mir-7inhibitor mir-9inhibitor.6.6.4.4... 4 6 8 4 6 Cisplatin (μg/ml)...5..5. Cisplatin (μg/ml) 图 4 细胞株 cck-8 实验结果 : 细胞株 ; : /DDP 细胞株..3 Mir-7 mir-9 let-7 对细胞增殖的影响细胞平板克隆实验结果显示 : 转染 mir-7b, 9a mimic 以及 let-7 inhibitor 后, 细胞形成克隆集落数量数量多于对照组, 差异有统计学意义 (P<.5) 提示 细胞株细胞增殖性增强 而 /ddp 转染 mir-7b,9a inhibitor 以及 let-7 mimic 后, 细胞形成克隆集落数量数量少于对照组, 差异有统计学意义 (P<.5, 图 5) 提示 /ddp 细胞株细胞增殖性减弱 /DDP Colory numrer 4 3 mir-7mimic mir-9mimic let-7inhibitor 图 5 细胞克隆平板实验细胞克隆数目 : 细胞株 ; : /DDP 细胞株. P<.5. Colory numrer 5 5 mir-7inhibitor mir-9inhibitor.4 Mir-7 mir-9 let-7 对细胞凋亡的影响 : 图 5~7 显示, 转染 mir-7b,9a mimic 以及 let-7 inhibitor 后, 细胞凋亡率明显低于对照组, 差异有统计学意义 (P<.5) 提示顺铂导致的细胞凋亡受到一定的抑制 而 /ddp 转染 mir-7b,9a inhibitor 以及 let-7 mimic 后, 细胞凋亡率明显高于对照组, 差异有统计学意义 (P<.5) 3 讨论晚期 NSCLC 患者标准一线化疗方案为含铂双药化疗方案, 但是其有效率仅仅约为 3%, 主要的原因为患者对化疗药物产生原发性或者继发性耐药 尤其是 [-4] 对铂类药物耐药更为常见 如何准确的识别患者对 铂类药物治疗的敏感性以及如何逆转铂类药物的耐药情况是未来急需要解决的问题 肿瘤组织或者细胞内存在大量的 mirn 表达异常,miRN 参与基因转录后的调节, 因而能够抑制目标基因的表达从而间接影响细胞信号通路内的各种分子, 导致肿瘤细胞存活通路的异常和肿瘤细胞凋亡通路的 [9,, 5] 异常 本课题中, 我们通过前期课题基因芯片数据分析了 和 /DDP 之间 mirn 表达谱的变化, 选出存在表达差异的其中 3 个 mirn(mir-7 mir-9a 以及 let-7b) 通过 RT-PCR 验证, 与 相比, 发现 / DDP 存在 mir-7 和 mir-9a 高表达现象以及 let-7b 低表达现象 这结果跟国外部分研究基本一致,mir-7-9
9 分子影像学杂志 6 年第 39 卷第 3 期 http://www.j-fzyx.com 4 4 mir-7mimic apoptosis rate 5 5 4 4 mir-7mimic mir-9mimic let-7inhibitor 4 mir-9mimic 4 let-7inhibitor 图 6 细胞株转染 mir-7-5p,mir-9a let-7b 抑制物细胞凋亡情况以及细胞凋亡率 (.5 μg/ml) : 细胞凋亡情况 ; : 细胞凋亡率. P<.5. 4 4 4 4 mir-7inibitor apoptosis rate 5 5 4 4 mir-7inhibitor mir-9inhibitor 4 mir-9inhibitor 4 图 7 /DDP 细胞株转染 mir-7-5p, mir-9a let-7b 模拟物细胞凋亡情况以及细胞凋亡率 (4 μg/ml) : 细胞凋亡情况 ; : 细胞凋亡率. P<.5. 4 4 家族在多种恶性肿瘤中充当着原癌基因的作用,let-7b [] 充当抑癌基因的作用 进一步的细胞毒性实验结果显示, 使 内的 mir-7 高表达或者 mir-9a 高表达或者 let-7b 低表达会导致 对顺铂的敏感性下降, 细胞的 IC 5 值升高, 使 对顺铂产生耐药现象 而相 反使 /DDP 内的 mir-7 低表达或者 mir-9a 低表达或者 let-7b 高表达会导致 /DDP 对顺铂的敏感性升高, 细胞 IC 5 值下降 细胞克隆平台实验表明了 内的 mir-7 高表达或者 mir-9a 高表达或者 let-7b 低表达均会导致细胞增殖能力增强, 细胞克隆数目增多 而
http://www.j-fzyx.com 分子影像学杂志 6 年第 39 卷第 3 期 9 相反 /DDP 的 mir-7 低表达或者 mir-9a 低表达或者 let-7b 高表达均会导致细胞增殖能力减弱, 细胞克隆数目减少 顺铂主要的作用机制是与肿瘤细胞核内的 DN 结合引起细胞内的 DN 损伤, 从而诱导细胞发生凋亡现象 本研究显示, 在 /DDP 中高表达的 mir-7 mir-9a 和低表达的 let-7b 可导致细胞增殖能力增强, 抗凋亡能力增强 以上的实验表明了 mir-7 mir-9a 可作为原癌基因, 促进细胞增殖 let-7b 作为抑癌基因, 能够抑制细胞增殖 ; 细胞内 mir-7 mir-9a 以及 let-7b 表达水平的变化影响细胞增殖 细胞凋亡以及细胞对顺铂的敏感性 ; 抗凋亡能力增强有可能直接减弱顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用, 而导致细胞对顺铂产生耐受作用 通过以上研究, 我们探索了 NSCLC 化疗过程中出现耐药的分子机制, 这将为提高 NSCLC 的整体疗效 建立合理的个体化治疗方案提供新的理论基础和技术途径 参考文献 : [] Jemal, Thun MJ, Ries L, et al. nnual report to the nation on the status of cancer, 975-5, featuring trends in lung cancer, tobacco use, and tobacco control[j]. J Natl Cancer Inst, 8, (3): 67-94. [] Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Global cancer statistics[j]. C Cancer J Clin, 999, 49(): 33-64,. [3] Xing L, Todd NW, Yu L, et al. Early detection of squamous cell lung cancer in sputum by a panel of microrn markers[j]. Mod Pathol,, 3(8): 57-64. [4] Xie Y, Todd NW, Liu Z, et al. ltered mirn expression in sputum for diagnosis of non-small cell lung cancer[j]. Lung Cancer,, 67(): 7-6. [5] Shen J, Todd NW, Zhang H, et al. Plasma microrns as potential biomarkers for non-small-cell lung cancer [J]. Laboratory Investigation,, 9(4): 579-87. [6] Yanaihara N, Caplen N, owman E, et al. Unique microrn molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis[j]. Cancer Cell, 6, 9(3): 89-98. [7] Patnaik SK, Kannisto E, Knudsen S, et al. Evaluation of MicroRN expression profiles that May predict recurrence of localized stage I Non-Small cell lung cancer after surgical resection[j]. Cancer Res,, 7(): 36-45. [8] Lebanony D, enjamin H, Gilad S, et al. Diagnostic assay based on hsa-mir-5 expression distinguishes squamous from nonsquamous non-small-cell lung carcinoma[j]. J Clin Oncol, 9, 7 (4): 3-7. [9] Zhao J, Fu WF, Liao HY, et al. The regulatory and predictive functions of mir-7 and mir-9 families on cisplatin resistance of non-small cell lung cancer[j]. MC Cancer, 5, 5(7): 73. []Jiang ZY, Yin J, Fu WF, et al. mirn 7 family regulates Cisplatin- Resistant and metastasis by targeting TGFbetaR in NSCLC[J]. PLoS One, 4, 9(4): e94639. []Sarkar FH, Li Y, Wang Z, et al. Implication of microrns in drug resistance for designing novel cancer therapy[j]. Drug Resist Updat,, 3(3): 57-66. []Fennell D, Summers Y, Cadranel J, et al. Cisplatin in the modern era: The backbone of first-line chemotherapy for non-small cell lung cancer[j]. Cancer Treat Rev, 6, 44(5): 4-5. [3] 郗照勇, 刘扬中. 顺铂耐药的分子机制 [J]. 中国科学 : 化学, 4(4): 4-. [4]Dasari S, Tchounwou P. Cisplatin in cancer therapy: Molecular mechanisms of action[j]. Eur J Pharmacol, 4, 74(5): 364-78. [5]Galasso M, Sana ME, Volinia S. Non-coding RNs: a key to future personalized molecular therapy[j]. Genome Med,, 4():.