性; 1000 r/min 离心; SDSPAGE; 于 4 'C 100 V 转膜 组 培养 1 周后开始干预 ①正常对照组:普通 S h; 5 % 脱脂奶粉封闭 1 h ; 分别加入抗 NQ01 培养液;② THA 模型组 : S 培养液中加入 1 阳nol/L 及!)肌动蛋白 一抗温育 4 '

http://www.cjcb.org 11 相酶诱导剂 CPDT 对运动神经元损伤 卡晖 1 李斌 1 郭艳苏 1 李哲刘晓云 1 保护作用的机制初探 李 春岩 1 * (河北 省 人民 医院癫瘸病矛斗 石家庄 0500日.1 河 北 医科大第二医院 石家庄 050000; 利 用 谷氨酸转运体抑制剂制备选择性运动神经 元损伤 的 脊髓 片 培养模型 在此基础上 摘要 河北省心脑血 管 病研究所 石家庄 050000 ) 探讨 II 相 酶诱导 剂 5 6 二 氢环戊烯并 1 二硫环 戊烯 硫嗣 (CPDT)对运动神 经 元的保护 作用 及机制 乳 大 鼠脊髓 片 分为正 常对 J照 组 THA 模型纽 (1 00μmollL苏 在 天冬氨酸 ;THA) 和 II 相酶 诱导剂 CPDT 干 预纽 (15 和 0μmol/L) 通 过免疫纽化方 法对 脊髓腹角 α 运动神 经 元进行计数 并 利用 RTPCR 半 定量 方 法 免疫 印 迹及酶活性检测等 方法 分析各组问眠氧化还原酶 1 (NQ01 ) 和 铁蛋 白 重链 的 表达 结果表明 CPDT (1 5 或 0μmol/L)干 预 纽 脊髓腹角 的运动 神经 元数 明 显增多 与 THA 模型 纽相 比 差 异 显著 (P<0.05 P<O. OI) 并且经 CPDT 干 预 可 以 有 效 的 诱导 NQOl 以及铁 是选择性侵犯上 下运动神经元的慢性进行性变性 单克隆抗体 SI (Sternberger onoclonals 公司) 二 抗为素 化 马抗鼠 IgG ( Vector 公司 ) 反转录 有效的治疗方法 但越来越多的证据提示 谷氨酸 PCR 试剂 : RNA 提取试剂 逆转录酶 (AV RT), Taq 兴奋 毒 和氧 化应激在 ALS 的发病机制中发挥了重要 DNA 聚合酶等购自 Promega 公司 免疫印迹试剂: 作用 氧化应激更被认为是发病机制中的 一个中 心环 PVDF 膜购自 illipore 公司 抗 NQOl 及 β 肌 节 [ 1 ] 文献报道 II 相酶诱导剂 二 唾环戊 二 烯硫酣类 动蛋白抗体均购自 美 国 Sant a Crutz 公司 化合可以在多 种 组织中激活 N砌成E 通路 诱导 1. 方法 游的多种抗氧化 酶和抗氧化 蛋白协同表达 发挥强大 1..1 的抗氧化作用 [] 我们在前期实验中发现此类化合 快速断头 分离脊髓 显微镜下剪断神经根 将 腰髓 中的 5 6 二 氢 环戊烯并 1. 二 硫环戊烯 硫酣 切 成 50μm 厚的薄片 6 孔培养板内每孔放入 1 ml 将 8 日龄 SD 乳鼠 个板插上放 5 片 入 CO 培养箱 1.. 选择性运 动神经 元 死 亡的 脊髓 片培 养模型 [5] 培养基 S 并放置板插 将脊髓片转移至板插上 每 究进一 步探讨其保护作用的机制 在这 一 部分我们 原理为通过谷 氨酸 转运体 抑 制剂苏 起天冬氨酸 蛋白质水平以及酶活性上观察 CPDT 是否在脊髓薄片 (threohydroxyaspartate, THA) 造成 外谷 氨酸堆 中诱导了 Nrf/ARE 通路下游 NQOl 和 的表达 积从而对运动神经元造成选择性损伤 脊髓 薄片 培养 1 周 性状稳定后 1 材料与方法 S 培养液中加入浓度为 蛋白铁蛋白重链 (ferritinh ) 为代表 从转录水平 动中心) 培养液为 S [4] 实验试剂包括 CPDT 纯品(美国 Rosewell Park 癌症研究院 Yuesheng Zhang 收稿日期: 0080505 接受日期 0080805 国家自然科基金资助项目 (No. 06707) *通讯作者 Te l : 单纯 0 118775, Fax: 011 8706404, Emai1: hblicy5@yahoo.com.cn 实验动采用 8 日龄 SD 乳鼠(河北 医科大实验 11 相 酶诱导 剂 干预(分两个时间点) 1.. 1. 1 材料 100μmo l/l 的 THA 共培养 4 周 器官 型 脊髓薄 片培 养[4] (CPDT)对运动 神 经元损伤具有明显的保护作用 本研 以 Nrf从RE 通路下游经典抗氧化酶 NQOl []和抗氧化./ 目前 该病病因不清 发病 机 制不明 缺乏 疾病 教授惠赠 ); 组化试剂: 一 抗为小 鼠抗非磷酸化神经丝 肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 肌萎缩侧索硬 化 ;II 相酶;运动神经元 关键词 下 了前期基础 蛋 白 重链 的 表达增 加 为下一 步在 肌萎缩侧索硬化 (ALS)) 动 模型 或 ALS 病 人中 进行临 床干 预打 Journa1 of Cell Bio1ogy 008, 0: 78 1785 Chinese

性; 1000 r/min 离心; SDSPAGE; 于 4 'C 100 V 转膜 组 培养 1 周后开始干预 ①正常对照组:普通 S h; 5 % 脱脂奶粉封闭 1 h ; 分别加入抗 NQ01 培养液;② THA 模型组 : S 培养液中加入 1 阳nol/L 及!)肌动蛋白 一抗温育 4 'C 过夜;次日 IRDyeT7 D万 THA; ③ 15μmoνLCPDT干预组:将 15μmoνLCPDT 800DX 标 记的 二 抗温育 室 温 h ; 显色条带扫描后 加入培 养液预 处理 48 h 再加入 100μmol/L THA 和 以 Ody ssey 红外图像分析系统分析 以 NQ01 或 15μmol/L CPDT ; ④ 0μmol/L CPDT 干预组:将 0 与 札 肌动蛋白的比值表示目的蛋白的相对表达 量 μmol/l CPDT 加 入培养液预处理 48 h 再加入 100 1..7 μmol/l THA 和 0μmol/L CPDT 各组每周换液 甲荼酿 (VitK匀 还原态 VitK 使 TT 非酶性还原成 次 于培养 4 周后取出脊髓片 蓝色质的原理 以多功能酶标仪选择动力程序 NQ01 活性的 检测 根据 NQ01 能够还原 以 4% 多聚甲醒固定后做免疫组化染色;两个时间点 排除非特异性酶活性 以含 0. mmo l/l 双香 豆 素的 610 nm 连续读 5 min 测定内酶促反应速率 为 CPDT+THA 干预 周点共 4 组 每组留取 10 片 RTPCR (每组重复 5 次);每组 0 片 用来做 Western 参见 Ye 等[坷的检测方法 印迹(每组重复 5 次 ); 每组 0 片 用来做 NQ01 活性 1. 统计分析 脊髓片免疫组化染色 CPDT+THA 干预 测定结果均以均数 ± 标准 差 (主 土 s) 表示 采用 SPSS 10.0 统计软件分析 检测(每组重复 5 次) 1..4 磷酸缓冲液代替常规缓冲液做平行孔检测 具体步骤 共 7 组 每组留取 15 片迅速保存于液氮中 用来做 结果 Illlll阻断非特异性染色 单克隆抗体 SI (14 : 0).1 SI 免疫组化染色 4 'C 摇床过夜 次日加素化马抗鼠 IgG 60 min, SABC 60 min, DAB 显色 10 min 脱水 透 腹角有 150 个 左右的 α 运动神经元 ; 模型组 α 运动 CPDT+THA 干预 周点正常对照组脊髓片两侧 (1 : 000) 提前干预 α 运动神经元存活数量明显增加 与模型组 元[ 6] 相比差异显著 (P<0. 01 ); 0 μmo l/l CPDT 干预组与 两个时间点的各组脊髓片取出后 常规用 Trizol 试 15μmol/L CPDT 干预组神经元数目相近(表 1 图 1 ). NQOl 和 重链转录水平的变化 RTPCR 检测 NQ01 和 mrna 的 表达 神经元数目明显减少 (P<O.O l) ; 经 15μmol/L CPDT 明 封固 具备 个标准者(位于脊髓的腹侧 SI 阳性 体直径 >5μm) 者被确定 为 α 运动 神 经 1..5 剂提取总 阳叫A 并逆转录为 cdna NQ01 引 在单纯 CPDT 干预 48 h 点 15 0μmol/L CPDT 序列依据文献报道设计[明 NQ01: 上游 5 'AAA CAT CCA ATC CTC CA ' 下游 5 ' AAG TTA GTC 高 并且呈剂量依赖性 (表 图 ) 在 CPDT+THA CCT CAG CCA TTG TTT' ; : 上游 5 ' TGACAA 干预 用点 15 和 0μmol/L CPDT 干预组 NQOl 和 GAA TGA TCC CCA ' 下游 5'CTT AGCTCTCAT mrna 的表达较 THA 模型组升高明显 (P<O. OI) CAC CGT GT'; ß肌动 蛋白:上游 5 ' GCC ATG TAC (表 图 ); 模型组与对照组相比 NQ01 也有所升 因的 PCR 扩增 反 应条件:初始变性 94 'C5 min 1 个 无数目 β 肌动蛋白 55 'C 均 0 s; 7 'C 延伸 到 s 共 5 个循环; 7 'C 延伸 5 min 采用 GBOXHR 全自动凝 胶成像系统对凝胶进行 定量 以 NQOl 或 与 日 肌 动蛋白的 比值 表示目的基因的相对表达量 α 运 动 神 经元 数 组JlO 对照组 ( ~S ) 模型组 (1 00μmollL 16.8 土 5.** 4.6 土.5 THA ) 15μmollL C PDT 干 预组 16.4土 5. 8** 0μmo l/l C PDT 干 预组 CPDT+THA 干预 周点各组脊髓薄片腹角 α 运动神经 'C 0 s; 退火 NQ01 58 'C 51 循环;变性 94 表1 GCC GAT AG' (上 海工程公司合成) 目的基 GTA GCC ATC CA' 下游 5 仁 GAA CCG CTC ATT 15.6 土 4.9* 与模型组相比 叩 <0.05. 机 P<O.O I 干预组 NQOl 和 mrna 的表达较对照组明显升 TGG min, 0.6% Triton XI00 浸透 10 min, 5 % 马血清 60 周点各组脊髓片取出后 分别以 4 % 多聚甲醒固定 0 CPDT+THA 干预 周点:将脊髓片随机分为 4 小 蛋白 BCA 法测定蛋白质浓度 取 100μg 待测蛋白 质 加入等体积 5x 上样缓冲液 100 'C 煮沸 min 变 CPDT 干预组;培养 48 h 后取出 两个时间点的各组脊髓片取出后 裂解液提取总 S 培养液;② 15μmol/L CPDT 干预组;③ 0μmoνL We s tern 印迹检测 NQOl 和 的表达 1..6 1 周的损伤恢复期后开始干预 ①正常对照组:普通 研究论文 CPDT 干 预 48 h 点.将脊髓片随机分为 小 组 经过 78./

(D) Ft H 蛋白质水平 0. 土 0. 0 * 0. 土 0.0* 食 0.9 1 土 0. 1 4 1. 7 土 0.0 *.8 士 0.4 9* 食 0. 0 5 土 0.0 0.09 土 0. 01 0.07土0.0 1 0. 11 土 0.0 * 0. 1 6 土 0.0* ' 1 5 土 0.0 *' NQOl 和 的蛋白质水平变化 NQ01 和 的蛋白质表达与基因表达结果 一 99 bp 致 在单纯 CPDT 干预 48 h 点 经 15 和 0μmol/L CPDT 干预 NQ01 和 的蛋白质 表达较对照组明 1 8 bp 显升高 呈剂量依赖性 (表 图 4) (P<0, 05, P<O. O l) 在 CPDT+THA 干预 周点 15 和 0μmoνL CPDT bp 干预组 NQ01 和 的蛋白质 水 平较模型组升 高 明 显 差 异显著 ( 表 图 5) (P<O Ol); 模型组 与对照组 0μmo l/l C PDT 干 : marker 统计 差 异 高 差异有统计 意 义 (P<O O l) ; 略有增加 但无.4 抗氧化酶 NQOl 活性测定 在单纯 CPDT 干预 48 h 点 15μmol/L CPDT 干 预组 NQOl 活性较对照组升高 51 % (P< 0.01), 0 : 略有升 高 但 无统计差异 1 5 μ mo l /L CPDT 干预组 ; μmol/l CPDT 干预组较对照组升高 16 % (P<0.01), 15 和 0μmol/L CPDT 干预组相比 差 异有统计 意 : 1 : 正常对照组; 相比 NQ01 也有所升高 差 异有统计意义 (P<0.01) ; RT PCR 检 测 单 纯 CPDT 干预 48 h 点各组脊髓薄片 NQOl 和 mrna 的表达 一 74 ß JVll9) 蛋 ÎI. * #P <O.O 1 0?页组 0. 11 士 0. 0 N QOl 活性单位为 nm o l/ ( min. m g); 与对照组 相比 * P < O. O I ; 与 15μm o l / L C PDT 干预组 相比 会 P < 0. 05 ; 与 15μm o l/l CPDT 干 预组相 比 图 CPDT 0.7 :t 0.0* ' 11=5 ; mr NA 水平 0μm ol /L 0. 15 土 0. 0 * ì活. 性 CPDT 0. 0 7 土 0. 01 蛋白质水平 1 5 μm o l / L 对照组 7)<平 单纯 CPDT 干预 48h 点各组脊髓薄片 NQ01 和 的表达 表 C: 15μm o l/ L C PDT 干预组 ; D: 0 μm ol/ L CPDT 干预 组 CPDT+THA 干预 周点各组 脊髓片腹角 α 运动神经元 SI 兔症组化染色 (100x) A: 正常对照组 ; B: TH A 模型组; NQO l 图 1 mrna... 78 (B) (A) (c) 哲等 : 1I 相酶诱导剂 CPDT 对运动神经元损伤保护作用的机制初探 李

CPDT +THA 0.4 0 主 0. 0 0. 士 0. 05 *. 58 土 0. 04 0. 90 土 0. 0 * 1. 1 7 土 0. 05 * ' NQOl 活性 1. 4 主 0. 7 *. 61 主 0.4.84 土 0. 4 * 5.4 9 土 0.*' 1') 土 忐 0. 0 0. 1 0.0 0.7 0. 7 牛(l 土 0. ()~ 0 * 门们_ _() 0.06 士 0. 01 0. 14 土 0.01 * v.. 组较 THA 模型 组 NQ01 活性升高 47.1 %; 0μmo l/l 卡一iI' bp CPDT 干 预组较模型组升 高 110. % (P<O.OI ); THA 18 bp 模型组与对照组相 比 NQ01 活性 也 有所升高 差 异 有统计意义 (P<O. OI) ( 表 ) 74 bp C PDT 干预 组; 1 kda 0μm o l / L C PDT 干 预脊髓组织抗氧 化 能力明 显增 加 ( 数据未显 示 ) 我 们进 一 步就 II 相酶诱导剂 CPDT 对运 动 神 经元损伤 保护作用的 机制进行初 步探 时 从转 录 水 平 蛋白 4 质水平及酶活性角度 发现经 15 0μmo l/l CPDT... 1 kda E 令 1 kda 干预 脊髓组织 中 NQOl 和 表达 明 显增 加 推 测 二 者的高表达增强了脊髓组织的抗氧化能力 从而 对抗了 THA 所致 的 运动神经元损伤 令 4 kda 文献报道 每天用 II 相酶诱 导 剂 CPDT ( 1 5 1: 正常对照组 ;: TH A 模型 组 ; : l5μm o l /L C PDT 干 预 组; 4: 0 μmo l/l C PD T 干预组; : m a r ke r 信号 通路 诱导 NQOl 活性升 高 ( 1. 5...().17 倍) [10] 本 NQOl 和 的蛋白质表达 脾等不同的非神经系统脏器内 都可激活 Nrf/ARE 实验 证 实 CPDT 在神 经组织中 可诱导 Nrf灿RE 信号 通路下游革巴基因表 达 显著增 加 经 15 0μm o lll 免疫 印迹分析 CPDT+THA 干预 周点各组脊髓薄片 CPDT 干预 48 h 后体外培 养 的脊髓 薄片组织中 NQ01 活性即为对照组的 1. 51 倍 ( 1. 7/0.91)和.6 倍 μmollkg) 给 SD 大鼠灌胃 连续 5 天 在大鼠 心 肝 义 ( P<O. OI) ( 表 ) ß JVl动主任臼 图5 我 们 在前期实验中发现经 15 0μmollL CPDT 干 : 并且 C PDT 干预组; FtH THA 模型组相 比 差 异显著 说明 15μmol/L CPDT 干 预己对运动神经元损伤具有明显保护作用 : 预组 0μmollL CPDT 干预 可完全 抑 制 THA 引起的选择性 4 kda NQOl 和 的蛋 白 质表达 : 15μm o l/l ma rke r o 的保护作用 谷氨酸转运体抑 制剂 THA 使脊髓腹角 SI 阳性的 α 运动 神 经元数目 明 显 减少 经 15 运动神经元的丢失 α 运动 神 经元数目 明显增 多 与 等 免疫 印迹分析单纯 CPDT 干预 48 h 点各组脊髓薄片 正常对照组 ; 模型 为 基础 观察 n 相酶诱 导 剂 CPDT 对 运动 神 经元 ß JVL动蛋 白 本研 究 以 选择性运动神经元死亡的脊髓片培养 _ 1 kda 也只能延 缓 ALS 的 病程 因此 对 ALS 有效治疗药 的筛选己成为神 经 科 领域 的研究热 点 4: 0 图4 : l5μm o l/ L markero : THA 模型 组 ; μmo l/ L C PDT 干预 组 该病病因 和 发病 机制不 明 目前缺乏有效 的 治疗方法 由美国 FDA 和 欧盟 批 准用于治疗 ALS 的药利 鲁 I哇 NQ01 和 mrna 的 表达 : 讨论 ALS 是 一 种 慢性 进行性 神 经系统变性疾病 RTPCR 检 ;911J CPDT + THA 干预 周点各组脊髓薄片 正常对照组 ; 0 在 CPDT+THA 干预 周点 15μmol CPDT 干预 等 99 自 )jjl L9J 蛋向 图 0. 4 土 0. 0 料 ' P<O.OI ~~ 气... 4 () 'J * ' 0. 04 土 0. 0 N QOI 活性单位 为 nm o l /( min. mg ); 与对照组相 比. * P < O. O I ; 与 15μm o l / L CPDT 干预组相比. n=5; I()...fl l) '). 10 土 0. 0 0. 79 土 0. 0 * ' 0 m RNA 水 平 0. 61 土 0. 0 * 0μmo l/l 0.18 士 0. 0 * 蛋白 质水平 1 15μmol / L CPDT +THA 模型组 CPDT+THA 干预 周点各组脊髓薄片 NQOl 和 的表达 对照组 表 水平 NQOI mrna l 研究论文 蛋白质水平 784

髓组织 内 可诱导 NrflARE 通路下游的 NQOl 以及 F出 具有明显的保护作用 但 CPDT 是直接诱导了运动神 经元本身抗氧化能力加强 还是间接通过胶质保护 了运动神经元目前还不清除 有待进一 步深入研究 可催 化 体内的酿类化合发双电子还原反应成 表达显著增加 对 THA 引起的选择性运动神经元损伤 (0. 7/0.10 ) 和 5. 70 倍 ( 0. 57/0.10) NQOl 和 都具有抗氧化应激的作用 NQOl 氢 酿 对自昆类质的损伤形成 种保护机制;它 参与 已有研究表明 二 唾环戊 二 烯硫酣类 化 合对 NQOl 和 的诱导是通过 Nrf/ARE 信号通 路实现的 在 NQOl 和 基因的 5' 侧 翼具有相同 N europrotective Effect of Phase 11 Enzyme Inducer CPDT on the Selective otor Neuron Injury and Possible echanisms 通过增加 Nrf 转录因子的表达 促进其核内移并与 (antioxidant responsive element, ARE) 此类化合 的增强子序列 这段序列被称为抗氧化反应元件 Liu l 气 Hui Bu 1., Bin Li 1 立 YanSu Guo l 气 Chun Yan Li 1,' Zhe Li, Xi aoyun 氧 化损伤 氧 化酶 可促使 Fe + 转变为可贮存的 Fe + 形式 减少 单位组成 (包括重 轻肤链) 重 肤链含有活性的铁 Simpson EP et al. Curr Opin Rheumalol, 00, 15: 70 Konwinski RR, el al. Toxicol Lell, 004, 15: 4 van uiswinkel FL el al. Curr Drug Targels CNS Neurol Disord, 005, 4: 67 [4) 刘晓云等 f!ljjjfff:':_主仿辛苦 007, 9: 15 [5 ) 肖向建等 基础E与砌成 004 4 : 687 [6) Carriedo SG el al. J Neurosci, 1996, 16: 4069 [7) Gebely S el al. Carcinogenesis, 004, 5: 169 [8) Yefimova G el al. In vesl Ophthalmol Vis Sci, 000, 41: 4 [9) Ye L et al. Carcinogenesis, 001, : 1987 [10) 如1unday R el al. Chem Biollnleracl, 006, 160: 115 [11) Kwak K el al. J Biol Chem, 00, 78: 815 铁蛋白是神经系统 内 主要 的铁贮存蛋白 由 4 个亚 参考文献 (References) [1 ) [) [) 维素 E 介导的抗氧化反应;还能充 当辅酶 Q(泛!!î1'È) 的还原酶 保护膜组织不被氧自由基损伤 而 综上所述 本实验证实 II 相酶诱导剂 CPDT 在脊. 61)倍; 的蛋白质水平为 THA 模型组的.70 倍 分 别 为 THA 模型组的 1. 47 倍 (.84/.61)和.6(5.49/ 同加强了组织 内 的抗氧化能力 [1 1 1 (0.1110. 07 ) 和.14 倍 (0. 15/0.07) 在 CPDT+THA 干 顺式作用元件 ARE 结合 诱导下游靶基因的表达 协 预 周点 15 和 0μmoνLCPDT 干预组 NQOl 活性 785 (. 8/0.91 ); 的 蛋白质水平为对照组的 1. 57 倍 (' Department of Epilepsy, Hebei General Hospital, Shijia zhuang 050051, China; 'The Second Hospital of Hebei edical Uniνersity Shijiazhuang 050000, China; Hebei Province 1nstitute of Cardiocerebrovascular Disease, Shijiazhuang 050000, China ) On the basis of the model of selective motor neuron injury which induced by inhibitor of A b stract glutamate transporter, to investigate the neuroprotection effect and mechanism of phase II enzyme inducer 5,6 dihydrocyclopenta[ C] I, dithiolethione (CPDT). Organotypic spinal cord slices of rat pup were divided into normal control group, THA model group (THA 100μmo1/L) and phase II enzyme inducer CPDT (1 5, 0μmoνL) treatment groups. Ventra1 αmotor neurons ' survival of spinal cord slices in each group was evaluated by immuno histochernical staining. The expression ofnqol and ferritin in each group was evaluated by the method ofrtpcr, (1 5μmoνL or 0μmol/L). And the expression of antioxidant enzyme of NQOl and heavy chain of ferritin increased significantly in CPDT treatment group. The result provided Received: ay 5 008 Accepted: August 5 008 This work was supported by the Nationa l Natural Science Foundation of China (No.06707) *Corresponding author Tel: 86118775, Fax: 86 J 18706404, Email : hblicy5 @yahoo.com.cn amyotrophic lateral sclerosis ; phase II enzyme ; motor neuron WOI由 Key fu ndamental conditions for intervention on animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and ALS patients. significantly increased with interventi on of CPDT Western blot and assay of enzyme activity et al.. Compared with THA model group, the number of αmotor neurons 哲等 : II 相酶诱导剂 CPDT 对运动神 经元损伤保护作用的机制初探 李