中 国 组 织 工 程 研 究 第 18 卷 第 49 期 2014 11 30 出 版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research November 30, 2014 Vol.18, No.49 力 竭 运 动 后 24 h 模 型 大 鼠 肾 脏 结 构 和 炎 症 因 子 对 黑 加 仑 提 取 物 干 预 的 反 应 刘 霞 1, 蒋 嘉 烨 2, 陆 海 英 3, 顾 翠 英 1, 蔡 美 琴 4 ( 上 海 中 医 药 大 学, 1 公 共 健 康 学 院, 2 教 学 实 验 中 心, 3 护 理 学 院, 上 海 市 201203; 4 上 海 交 通 大 学 医 学 院, 上 海 市 200025) 文 章 亮 点 : 黑 加 仑 提 取 物 可 减 少 急 性 运 动 后 24 h 模 型 大 鼠 肾 脏 组 织 中 核 因 子 κb 蛋 白 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 表 达, 降 低 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平, 减 少 炎 症 反 应, 保 护 肾 脏 组 织 结 构, 为 今 后 研 制 运 动 营 养 补 充 剂 提 供 实 验 依 据 关 键 词 : 实 验 动 物 ; 组 织 工 程 ; 黑 加 仑 提 取 物 ; 力 竭 运 动 后 24 h; 核 因 子 κb; 肿 瘤 坏 死 因 子 α; 肾 脏 结 构 主 题 词 : 醋 栗 属 ; 运 动 ; 肾 ;NF-κB; 肿 瘤 坏 死 因 子 α 基 金 资 助 : 上 海 市 教 委 预 算 内 项 目 (A1-20140315) 摘 要 背 景 : 急 性 运 动 后 肾 脏 组 织 易 出 现 运 动 性 肾 缺 血 再 灌 注 现 象, 自 由 基 生 成 增 加, 发 生 炎 症 反 应, 导 致 肾 功 能 异 常 目 的 : 观 察 黑 加 仑 提 取 物 对 力 竭 运 动 后 24 h 大 鼠 肾 脏 结 构 肿 瘤 坏 死 因 子 α 和 核 因 子 κb 表 达 的 影 响 方 法 :30 只 雄 性 Wistar 健 康 大 鼠 随 机 分 为 3 组, 每 组 10 只, 黑 加 仑 提 取 物 组 给 予 0.44 g/kg 黑 加 仑 提 取 物 灌 胃, 安 静 对 照 组 力 竭 运 动 后 24 h 组 灌 服 同 等 体 积 的 蒸 馏 水, 连 续 灌 胃 6 周 力 竭 运 动 后 24 h 组 和 黑 加 仑 提 取 物 组 于 末 次 灌 胃 后 进 行 无 负 重 游 泳 运 动 直 至 力 竭 疲 劳, 于 24 h 后 取 材, 电 镜 和 光 镜 观 察 肾 脏 组 织 形 态 和 超 微 结 构 变 化, 免 疫 组 化 法 检 测 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 和 核 因 子 κb 蛋 白 表 达,RT-PCR 检 测 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 和 核 因 子 κb mrna 的 表 达 结 果 与 结 论 : 与 安 静 对 照 组 比 较, 力 竭 运 动 后 24 h 组 中 肾 脏 核 因 子 κb 蛋 白 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 高 表 达, 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平 极 显 著 增 加 (P < 0.01); 与 力 竭 运 动 后 24 h 组 比 较, 黑 加 仑 提 取 物 组 中 肾 脏 核 因 子 κb 蛋 白 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 低 表 达, 核 因 子 κb mrna 表 达 水 平 显 著 性 降 低 (P < 0.05); 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平 极 显 著 性 下 降 (P < 0.01) 力 竭 运 动 后 24 h 组 大 鼠 肾 脏 发 生 明 显 的 形 态 变 化 和 超 微 结 构 损 伤, 黑 加 仑 提 取 物 组 大 鼠 肾 脏 结 构 趋 于 正 常 结 果 表 明 黑 加 仑 提 取 物 可 修 复 力 竭 运 动 后 24 h 肾 脏 组 织 结 构, 减 少 炎 症 因 子 的 表 达, 防 止 肾 脏 发 生 炎 症 性 损 伤 刘 霞, 女,1981 年 生, 江 苏 省 盐 城 市 人, 硕 士, 讲 师, 主 要 从 事 运 动 营 养 与 健 康 方 面 的 研 究 通 讯 作 者 : 蔡 美 琴, 教 授, 上 海 交 通 大 学 医 学 院, 上 海 市 200025 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.49.026 [http://www.crter.org] 中 图 分 类 号 :R318 文 献 标 识 码 :B 文 章 编 号 :2095-4344 (2014)49-08020-06 稿 件 接 受 :2014-10-20 刘 霞, 蒋 嘉 烨, 陆 海 英, 顾 翠 英, 蔡 美 琴. 力 竭 运 动 后 24 h 模 型 大 鼠 肾 脏 结 构 和 炎 症 因 子 对 黑 加 仑 提 取 物 干 预 的 反 应 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究,2014,18(49):8020-8025. Response of the structure of rat kidney and inflammatory factors to Blackcurrant Extract at 24 hours after exhaustive exercise Liu Xia 1, Jiang Jia-ye 2, Lu Hai-ying 3, Gu Cui-ying 1, Cai Mei-qin 4 ( 1 School of Public Health, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2 Experiment Center for Teaching and Learning, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3 School of Nursing, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 4 School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China) Abstract BACKGROUND: The kidney tissues easily affected exercise ischemia reperfusion, increased free radicals and inflammation, resulted in abnormal renal function after acute exercise. OBJECTIVE: To observe the influence of Blackcurrant Extract on the structure of kidney and expression of tumor necrosis factor-α and nuclear factor-κb at 24 hours after exhaustive exercise. METHODS: A total of 30 male Wistar rats were randomly divided into three groups (n=10). Rats in the Blackcurrant Extract group were intragastrically administered 0.44 g/kg Blackcurrant Extract. Rats in the quietness control group and 24-hour exhaustive exercise group were intragastrically given an equal volume of distilled water for 6 consecutive weeks. Rats in the 24-hour exhaustive exercise group and Blackcurrant Extract group received no swimming motion until exhaustion fatigue after final intragastric administration. Twenty-four hours later, samples were obtained. Kidney tissue morphology and ultrastructure were observed by electron microscopy and light microscopy. Protein expression of tumor necrosis factor-α and nuclear factor-κb was detected using immunohistochemistry. Tumor necrosis factor-α mrna and nuclear factor-κb mrna expression was detected using RT-PCR. Liu Xia, Master, Lecturer, School of Public Health, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China Corresponding author: Cai Mei-qin, Professor, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025, China Accepted: 2014-10-20 8020 P.O. Box 10002, Shenyang 110180
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the quietness control group, tumor necrosis factor-α protein and nuclear factor-κb protein expression in the kidney was higher in the 24-hour exhaustive exercise group, and tumor necrosis factor-α mrna and nuclear factor-κb mrna expression was significantly increased (P < 0.01). Compared with the 24-hour exhaustive exercise group, tumor necrosis factor-α protein and nuclear factor-κb protein expression was lower in the Blackcurrant Extract group, and nuclear factor-κb mrna expression was significantly decreased (P < 0.05); tumor necrosis factor-α mrna expression was significantly reduced (P < 0.01). Kidney in the 24-hour exhaustive exercise group showed obvious morphological changes and ultrastructural damage. The structure of the kidney in the Blackcurrant Extract group tended to be normal. Results suggested that Blackcurrant Extract can repair the kidney tissue injury, reduce the expression of inflammatory factors, and prevent inflammatory damage in the kidney at 24 hours after exhaustive exercise. Subject headings: ribes; exercise; kidney; NF-kappa B; tumor necrosis factor-alpha Funding: the Budget Program of Shanghai Municipal Education Commission, No. A1-20140315 Liu X, Jiang JY, Lu HY, Gu CY, Cai MQ. Response of the structure of rat kidney and inflammatory factors to Blackcurrant Extract at 24 hours after exhaustive exercise. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(49):8020-8025. 0 引 言 Introduction 有 研 究 证 实 急 性 大 强 度 运 动 后 肾 功 能 下 降, 肾 脏 组 织 发 生 损 伤, 尤 以 肾 小 管 为 著, 且 损 伤 在 运 动 终 止 后 有 加 重 趋 势 [1] 急 性 大 强 度 运 动 导 致 横 纹 肌 细 胞 急 性 破 坏 和 崩 解, 以 及 肌 酸 激 酶 肌 红 蛋 白 等 肌 细 胞 内 成 分 进 入 细 胞 外 液 及 血 循 环, 引 起 内 环 境 紊 乱, 诱 发 横 纹 肌 溶 解 症, 引 起 急 性 肾 损 伤 [2], 而 在 急 性 肾 损 伤 后 停 止 运 动, 随 着 肾 血 供 的 逐 渐 恢 复, 又 易 出 现 运 动 性 肾 缺 血 再 灌 注 现 象 [3], 使 肾 脏 损 伤 进 一 步 加 重, 导 致 肾 功 能 异 常, 具 有 较 高 的 发 病 率 因 此 如 何 减 缓 或 预 防 力 竭 运 动 后 肾 脏 缺 血 再 灌 注 损 伤, 探 讨 力 竭 运 动 后 肾 脏 损 伤 机 制 已 然 成 为 研 究 热 点 黑 加 仑 (blackcurrant) 是 一 种 超 级 水 果 [4], 具 有 很 强 的 抗 氧 化 性 [5] 保 护 心 血 管 [6-7] 抗 疲 劳 [8-9] 抗 突 变 [10-11] 抗 微 生 物 [12] 抗 肿 瘤 等 生 物 学 功 能 [13-14] 但 是, 它 是 否 会 在 促 进 急 性 运 动 后 肾 脏 炎 症 性 损 伤 中 起 重 要 作 用 还 不 确 定 所 以, 本 研 究 建 立 力 竭 运 动 肾 损 伤 24 h 后 动 物 模 型, 观 察 黑 加 仑 提 取 物 改 善 肾 脏 炎 症 性 损 伤 的 程 度, 促 进 其 肾 脏 组 织 结 构 快 速 恢 复, 保 护 肾 组 织 1 材 料 和 方 法 Materials and methods 设 计 : 随 机 对 照 动 物 实 验 时 间 及 地 点 : 实 验 于 2013 年 2 至 8 月 在 上 海 中 医 药 大 学 科 技 实 验 中 心 实 验 室 完 成 材 料 : 实 验 动 物 : 雄 性 Wistar 健 康 大 鼠 30 只, 体 质 量 (130± 10) g, 由 上 海 中 医 药 大 学 动 物 实 验 室 提 供 分 笼 饲 养, 自 由 摄 水 进 食, 动 物 室 温 度 控 制 在 22-24, 湿 度 控 制 在 40%-60%, 自 然 光 照, 适 应 性 喂 养 1 周 后 进 入 实 验 实 验 方 法 : 动 物 分 组 : 雄 性 Wistar 大 鼠 30 只, 随 机 分 为 安 静 对 照 组 力 竭 运 动 后 24 h 组 黑 加 仑 提 取 物 组, 每 组 10 只 适 应 性 喂 养 后 1 周 后 开 始 给 药 给 药 方 案 : 黑 加 仑 提 取 物 组 每 日 清 晨 以 0.44 g/kg [15] 灌 黑 加 仑 提 取 物 干 预 力 竭 运 动 后 24 h 大 鼠 肾 脏 结 构 和 炎 症 因 子 实 验 用 药 品 试 剂 和 仪 器 : 药 品 试 剂 和 仪 器 黑 加 仑 提 取 物 ( 花 青 素 含 量 为 25%) 戊 巴 比 妥 钠 Trizol 来 源 上 海 诺 特 生 物 科 技 有 限 公 司 上 海 中 医 药 大 学 实 验 动 物 中 心 美 国 Invitrogen Fast SYBR Green Master Mix,GeneAmp 美 国 Applied Biosystems RNA PCR GAPDH 核 因 子 κb 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 引 物 生 工 生 物 工 程 ( 上 海 ) 股 份 有 限 公 司 Stepone TM 实 时 荧 光 定 量 PCR 扩 增 仪 美 国 Applied Biosystems TECNAI-12 透 射 电 镜 EM UC7 超 薄 切 片 机 光 学 显 微 镜 Bond-max 全 自 动 免 疫 组 化 染 色 机 全 自 动 生 化 分 析 仪 SK-1 快 速 混 匀 漩 涡 器 荷 兰 PHILIPS-FEI 公 司 德 国 Leica 公 司 日 本 Olympus 公 司 德 国 Leica 公 司 湖 南 永 和 阳 光 生 物 科 技 有 限 公 司 常 州 图 美 电 子 设 备 有 限 公 司 80-2 离 心 机 上 海 手 术 器 械 厂 服 黑 加 仑 提 取 物 1 次, 安 静 对 照 组 和 力 竭 运 动 后 24 h 组 分 别 灌 服 等 体 积 生 理 盐 水 1 次, 持 续 6 周 第 1 次 灌 胃 前 和 第 6 周 末 最 后 1 次 灌 胃 结 束 后 分 别 称 量 各 组 大 鼠 体 质 量 力 竭 运 动 后 24 h 组 和 黑 加 仑 提 取 物 组 末 次 灌 胃 后 进 行 无 负 重 游 泳 运 动 直 至 力 竭 疲 劳 力 竭 运 动 方 案 : 力 竭 运 动 后 24 h 组 和 黑 加 仑 提 取 物 组 大 鼠 在 恒 温 不 锈 钢 游 泳 池 [150 cm 60 cm, 水 深 80 cm, 水 温 (30±1) ] 进 行 无 负 重 游 泳 大 鼠 游 泳 力 竭 标 准 按 [16] Thomas 等 报 道 的 标 准 进 行 判 断 : 大 鼠 沉 入 水 中 10 s 不 能 自 主 上 水 面, 且 放 在 平 面 上 无 法 完 成 翻 正 反 射 样 本 采 集 : 按 文 献 标 准 实 验 动 物 达 力 竭 运 动 终 点 时, 迅 速 捞 离 游 泳 槽, 记 录 力 竭 时 间, 于 24 h 后 采 用 戊 巴 比 妥 钠 麻 醉, 迅 速 取 出 肾 脏, 浸 入 冰 生 理 盐 水 中 洗 净 残 余 血 液 后, 左 肾 组 织 用 于 实 时 定 量 PCR 检 测, 右 肾 组 织 用 于 形 态 学 观 察 和 免 疫 组 化 检 测 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 8021
表 1 合 成 引 物 序 列 及 扩 增 产 物 Table 1 Synthetic primer sequences and amplification products 基 因 引 物 序 列 表 2 各 组 肾 组 织 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 情 况 Table 2 Nuclear factor-κb mrna and tumor necrosis factor-α mrna expression in the kidney of rats from every group (x _ ±s) 肿 瘤 坏 死 因 子 α 核 因 子 κb GAPDH 5 - CAT GGA TCT CAA AGA CAA CAA A -3 5 - CTC CTG GTA TGA AAT GGC AAA T -3 5 - TTT TCT CTA TTG GCC TCT GACC C -3 5 - CGC TAG AGT GAC CCC CTG C - 3 5 - CAG AAC ATC ATC CCT GCA TC - 3 5 - CTG CTT CAC CAC CTT CTT GA -3 组 别 n 核 因 子 κb 肿 瘤 坏 死 因 子 α 安 静 对 照 组 10 1.03±0.05 1.07±0.19 力 竭 运 动 后 24 h 组 8 2.84±0.23 a 2.10±0.06 a 黑 加 仑 提 取 物 组 9 2.30±0.18 b 1.01±0.37 c 表 注 : 与 安 静 对 照 组 相 比, a P < 0.01; 与 力 竭 运 动 后 24 h 组 相 比, b P < 0.05, c P < 0.01 指 标 检 测 : 苏 木 精 - 伊 红 染 色 观 察 肾 脏 组 织 病 理 变 化 : 甲 醛 溶 液 固 定, 通 过 石 蜡 包 埋, 采 用 Leica 超 薄 切 片 机, 切 片 厚 度 为 4 μm, 苏 木 精 - 伊 红 染 色, 选 用 日 本 Olympus 显 微 镜 进 行 观 察 并 照 相 透 射 电 镜 观 察 肾 脏 组 织 超 微 结 构 : 安 静 对 照 组 任 选 2 只, 力 竭 运 动 后 24 h 组 黑 加 仑 提 取 物 组 分 别 任 选 3 只 大 鼠, 肾 脏 置 于 2%-2.5% 戊 二 醛 固 定 2 h, 磷 酸 缓 冲 液 清 洗 3 次, 用 1% 饿 酸 固 定 1.0-2.0 h, 再 用 磷 酸 缓 冲 液 清 洗 3 次, 脱 水, 无 水 丙 酮 与 包 埋 液 浸 透 4 h, 分 别 在 37,60 包 埋 12, 48 h, 半 薄 定 位 超 薄 切 片, 醋 酸 双 氧 铀 - 柠 檬 酸 铅 双 染 法 染 色,TECNAI-12 透 射 电 镜 观 察 并 摄 片 免 疫 组 化 检 测 核 因 子 κb 蛋 白 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 表 达 : 采 用 Leica Bond-max 全 自 动 免 疫 组 化 染 色 机 染 色, 染 色 完 毕 以 后, 待 玻 片 晾 干, 中 性 树 脂 胶 进 行 封 固, 于 显 微 镜 下 观 察 RT-PCR 法 检 测 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平 : 取 大 鼠 肾 脏 组 织 约 100 mg, 直 接 加 Trizol 试 剂 1 ml, 严 格 按 试 剂 盒 说 明 进 行 RNA 提 取, 所 用 RNA 的 A 260 /A 280 均 在 1.8-2.0 之 间 1 将 各 样 本 的 RNA 反 转 录 成 cdna; 反 应 条 件 为 42 2 h 95 5 min 2 分 别 用 相 应 的 引 物 ( 表 1) 扩 增 肿 瘤 坏 死 因 子 α 核 因 子 κb 及 GAPDH 其 中 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 条 件 为 :95 预 变 性 20 s,1 个 循 环 ;95 3 s,60 30 s 40 个 循 环, 绘 制 熔 解 曲 线 3 结 果 由 荧 光 定 量 分 析 仪 自 动 采 集 给 出 目 的 基 因 和 对 照 基 因 的 Ct 值, 参 照 文 献 将 Ct 值 转 化 为 相 对 倍 数, 基 因 表 达 量 采 用 实 验 组 / 对 照 组 = 2 - Ct 进 行 计 算 统 计 学 分 析 : 采 用 SPSS13.0 软 件 进 行 统 计 学 分 析, 计 量 资 料 用 x _ ±s 表 示, 多 组 比 较 采 用 单 因 素 方 法 分 析 (ANOVA 检 验 ),P < 0.05 为 差 异 有 显 著 性 意 义 2 结 果 Results 2.1 实 验 动 物 数 量 分 析 参 加 实 验 大 鼠 有 30 只, 中 途 有 3 只 大 鼠 游 泳 死 亡, 其 中 力 竭 运 动 后 24 h 组 2 只, 黑 加 仑 提 取 物 组 1 只, 进 入 结 果 分 析 共 计 27 只 2.2 黑 加 仑 提 取 物 对 肾 脏 结 构 的 影 响 2.2.1 光 镜 观 察 结 果 安 静 对 照 组 肾 脏 组 织 着 色 均 匀, 结 构 清 晰 致 密, 核 大 小 均 匀 ( 图 1A) 力 竭 运 动 后 24 h 组 肾 小 管 上 皮 细 胞 出 现 疏 松 化, 重 度 空 泡 变 性, 肾 间 质 少 量 炎 细 胞 浸 润 ( 图 1B) 黑 加 仑 提 取 物 干 预 后 肾 组 织 少 数 肾 小 管 上 皮 细 胞 空 泡 变 性, 较 力 竭 运 动 后 24 h 组 有 明 显 改 善 ( 图 1C) 2.2.2 电 镜 观 察 结 果 安 静 对 照 组 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 整 齐 ( 图 2A) 力 竭 运 动 后 24 h 组 中 系 膜 区 增 宽, 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 紊 乱, 肾 小 管 上 皮 细 胞 空 泡 变 性, 部 分 肿 胀, 溶 酶 体 吞 噬 ( 图 2B) 黑 加 仑 提 取 物 组 较 力 竭 运 动 后 24 h 组 有 改 善, 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 稍 紊 乱, 系 膜 区 基 质 增 生 ( 图 2C) 2.3 黑 加 仑 提 取 物 对 肾 脏 组 织 中 核 因 子 κb 蛋 白 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 表 达 的 影 响 安 静 对 照 组 大 鼠 肾 脏 细 胞 胞 浆 未 见 任 何 染 色 的 阳 性 颗 粒, 核 因 子 κb 蛋 白 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 呈 阴 性 表 达 ( 图 3A,4A); 力 竭 运 动 后 24 h 组 大 鼠 肾 脏 细 胞 胞 浆 内 可 见 棕 黄 色 阳 性 颗 粒 数 明 显 增 多, 着 色 较 深, 核 因 子 κb 蛋 白 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 呈 阳 性 表 达 ( 图 3B,4B), 尤 以 病 灶 及 其 周 边 部 位 明 显 ; 黑 加 仑 提 取 物 组 肾 脏 细 胞 胞 浆 内 阳 性 颗 粒 数 明 显 减 少, 着 色 变 浅 ( 图 3C, 4C) 2.4 补 充 黑 加 仑 提 取 物 对 肾 脏 组 织 中 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 的 影 响 与 安 静 对 照 组 比 较, 力 竭 运 动 后 24 h 组 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平 极 显 著 增 加 (P < 0.01); 与 力 竭 运 动 后 24 h 组 比 较, 黑 加 仑 提 取 物 组 核 因 子 κb mrna 表 达 水 平 显 著 性 降 低 (P < 0.05); 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平 极 显 著 性 下 降 (P < 0.01) 黑 加 仑 提 取 物 组 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 水 平 与 安 静 组 相 比 差 异 均 无 显 著 性 意 义 (P > 0.05), 见 表 2 3 讨 论 Discussion 3.1 黑 加 仑 提 取 物 对 力 竭 运 动 大 鼠 肾 脏 结 构 的 影 响 肾 脏 是 机 体 的 重 要 生 命 器 官, 其 生 理 功 能 主 要 是 排 泄 代 谢 产 物 和 调 节 水 电 解 质 酸 碱 平 衡, 从 而 维 持 机 体 内 环 境 的 稳 定, 同 时 还 具 有 内 分 泌 功 能 有 研 究 报 道 力 竭 运 动 后, 肾 脏 出 现 功 能 下 降 和 一 系 列 的 病 理 形 态 学 的 改 变 [17-18], 其 中 力 竭 运 动 后 24 h 肾 脏 损 伤 最 严 重 [19], 如 何 防 止 肾 脏 损 伤 程 度, 已 成 为 亟 需 解 决 的 问 题 因 此 本 研 究 建 立 力 竭 运 动 后 8022 P.O. Box 10002, Shenyang 110180
图 1 各 组 Wistar 大 鼠 肾 组 织 病 理 形 态 观 察 ( 苏 木 精 - 伊 红 染 色, 200) Figure 1 Pathomorphological observation of the kidney in Wistar rats of every group (hematoxylin-eosin staining, 200) 图 注 : 图 中 A 显 示 安 静 对 照 组 肾 组 织 着 色 均 匀, 结 构 清 晰 致 密, 核 大 小 均 匀 ;B 显 示 力 竭 运 动 后 24 h 组 肾 小 管 上 皮 细 胞 出 现 疏 松 化, 重 度 空 泡 变 性, 肾 间 质 少 量 炎 细 胞 浸 润 ;C 显 示 黑 加 仑 提 取 物 组 肾 组 织 少 数 肾 小 管 上 皮 细 胞 空 泡 变 性, 较 力 竭 运 动 后 24 h 组 有 明 显 改 善 图 2 各 组 Wistar 大 鼠 肾 组 织 超 微 结 构 观 察 ( 透 射 电 镜, 6 000) Figure 2 Ultrastructural observation of the kidney in Wistar rats of every group (transmission electron microscopy, 6 000) 图 注 : 图 中 A 显 示 安 静 对 照 组 肾 组 织 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 整 齐 ;B 显 示 力 竭 运 动 后 24 h 组 中 系 膜 区 增 宽, 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 紊 乱, 肾 小 管 上 皮 细 胞 空 泡 变 性, 部 分 肿 胀, 溶 酶 体 吞 噬 ;C 显 示 黑 加 仑 提 取 物 组 较 力 竭 运 动 后 24 h 组 有 改 善, 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 稍 紊 乱, 系 膜 区 基 质 增 生 图 3 各 组 Wistar 大 鼠 肾 组 织 核 因 子 κb 蛋 白 表 达 ( 免 疫 组 化, 400) Figure 3 Expression of nuclear factor-κb protein in the kidney of Wistar rats of every group (immunohistochemistry, 400) 图 注 : 图 中 A 显 示 安 静 对 照 组 大 鼠 肾 脏 组 织 核 因 子 κb 蛋 白 呈 阴 性 表 达 ;B 显 示 力 竭 运 动 后 24 h 组 大 鼠 肾 脏 细 胞 胞 浆 内 可 见 棕 黄 色 阳 性 颗 粒 数 明 显 增 多, 着 色 较 深, 核 因 子 κb 蛋 白 呈 阳 性 表 达 ;C 显 示 黑 加 仑 提 取 物 组 肾 脏 细 胞 胞 浆 内 阳 性 颗 粒 数 明 显 减 少, 着 色 变 浅 图 4 各 组 Wistar 大 鼠 肾 组 织 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 表 达 ( 免 疫 组 化, 400) Figure 4 Expression of tumor necrosis factor-α protein in the kidney of Wistar rats of every group (immunohistochemistry, 400) 图 注 : 图 中 A 显 示 安 静 对 照 组 大 鼠 肾 脏 组 织 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 呈 阴 性 表 达 ;B 显 示 力 竭 运 动 后 24 h 组 大 鼠 肾 脏 细 胞 胞 浆 内 可 见 棕 黄 色 阳 性 颗 粒 数 明 显 增 多, 着 色 较 深, 肿 瘤 坏 死 因 子 α 蛋 白 呈 阳 性 表 达 ;C 显 示 黑 加 仑 提 取 物 组 肾 脏 细 胞 胞 浆 内 阳 性 颗 粒 数 明 显 减 少, 着 色 变 浅 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 8023
24 h 的 动 物 模 型, 观 察 黑 加 仑 提 取 物 对 力 竭 运 动 后 24 h 大 鼠 肾 脏 形 态 学 的 影 响, 实 验 中 光 镜 和 电 镜 研 究 结 果 显 示 力 竭 运 动 后 24 h 组 肾 小 管 上 皮 细 胞 出 现 疏 松 化, 重 度 空 泡 变 性, 肾 小 管 微 绒 毛 排 列 紊 乱, 部 分 肿 胀, 系 膜 区 增 宽, 溶 酶 体 吞 噬 肾 间 质 少 量 炎 细 胞 浸 润, 其 原 因 是 正 常 生 理 条 件 下, 肾 血 流 量 约 占 心 输 出 量 的 25%, 运 动 时, 由 于 全 身 血 液 重 新 分 配 肾 血 流 量 急 骤 下 降, 形 成 运 动 性 肾 缺 血, 停 止 运 动 后, 随 着 肾 血 供 的 逐 渐 恢 复, 形 成 运 动 性 肾 缺 血 再 灌 注, 导 致 自 由 基 增 多, 使 细 胞 膜 的 流 动 性 下 降 通 透 性 增 高 [3], 引 起 钙 离 子 浓 度 升 高, 诱 导 细 胞 凋 亡 [17], 进 而 导 致 肾 脏 结 构 损 伤 黑 加 仑 提 取 物 干 预 后 肾 脏 结 构 有 明 显 改 善, 肾 小 管 上 皮 细 胞 少 部 分 空 泡 变 性, 微 绒 毛 排 列 稍 紊 乱, 系 膜 区 基 质 少 量 增 生, 其 原 因 是 黑 加 仑 提 取 物 可 提 高 肾 脏 的 抗 氧 化 能 力 [5], 减 少 肾 脏 自 由 基 的 生 成, 保 护 细 胞 膜 的 流 动 性 和 通 透 性, 进 而 使 细 胞 和 组 织 损 伤 减 轻 3.2 黑 加 仑 提 取 物 对 力 竭 运 动 大 鼠 24 h 后 炎 症 因 子 的 影 响 核 因 子 κb 是 一 种 普 遍 存 在 的 转 录 因 子, 几 乎 存 在 于 体 内 所 有 细 胞, 主 要 参 与 体 内 许 多 炎 性 细 胞 及 炎 症 介 质 基 因 转 录 调 节, 诱 发 炎 症 反 应 它 调 控 多 种 基 因 的 表 达, 是 多 种 信 号 传 导 途 径 的 汇 聚 点, 在 调 节 炎 症 反 应 的 基 因 中 起 关 键 作 用 [20-22] 肿 瘤 坏 死 因 子 α 是 一 种 主 要 由 单 核 巨 噬 细 胞, 淋 巴 细 胞 产 生 的 细 胞 因 子, 参 与 机 体 炎 症 和 免 疫 应 答 的 调 节, 在 多 种 肾 脏 疾 病 的 发 生 发 展 中 发 挥 重 要 作 用 近 年 发 现, 转 录 因 子 核 因 子 κb 与 炎 症 反 应 密 切 相 关, 活 化 的 核 因 子 κb 可 直 接 调 控 参 与 肾 缺 血 再 灌 注 后 炎 性 损 伤 的 多 种 介 质 基 因 的 表 达, 因 而, 核 因 子 κb 活 化 被 认 为 是 介 导 或 加 剧 肾 缺 血 再 灌 注 后 炎 性 损 伤 的 中 心 环 节 [23] 本 实 验 研 究 结 果 显 示, 力 竭 运 动 后 24 h, 肾 脏 组 织 核 因 子 κb 阳 性 细 胞 明 显 表 达, 且 核 因 子 κb mrna 表 达 显 著 增 加 其 机 制 可 能 是 : 力 竭 运 动 恢 复 期, 随 着 肾 血 供 的 逐 渐 恢 复, 形 成 运 动 性 肾 缺 血 再 灌 注 缺 血 再 灌 注 时, 出 现 活 性 氧 产 生 增 多 和 机 体 抗 氧 化 能 力 的 下 降, 产 生 氧 化 应 激, 组 织 脂 质 过 氧 化 水 平 提 高, 能 够 激 活 核 因 子 κb, 主 要 机 制 是 蛋 白 激 酶 诱 导 核 因 子 κb 抑 制 蛋 白 发 生 磷 酸 化 降 解, 核 因 子 κb 抑 制 蛋 白 / 核 因 子 κb 二 聚 体 解 离, 暴 露 核 因 子 κb 的 核 定 位 片 段, 核 因 子 κb 则 转 移 至 胞 核, 与 核 内 有 κb 序 列 的 DNA 结 合, 进 而 活 化 核 因 子 κb 核 因 子 κb 的 过 度 活 化 又 可 上 调 炎 症 因 子 的 表 达, 又 是 引 起 肾 脏 过 度 炎 症 反 应 和 炎 性 损 伤 的 关 键 因 素 有 研 究 发 现 肿 瘤 坏 死 因 子 α 作 为 核 因 子 κb 的 调 节 产 物 [24], 含 有 核 因 子 κb 的 结 合 位 点, 又 可 作 为 核 因 子 κb 的 细 胞 外 刺 激 信 号, 再 次 激 活 核 因 子 κb, 核 转 录 因 子 抑 制 亚 单 位 的 磷 酸 化, 导 致 核 转 录 因 子 抑 制 亚 单 位 - 核 转 录 因 子 复 合 体 中 的 核 转 录 因 子 抑 制 亚 单 位 解 离, 游 离 的 核 转 录 因 子 进 入 细 胞 核 内 结 合 于 核 转 录 因 子 结 合 部 ( 肿 瘤 坏 死 因 子 α 启 动 8024 子 ), 从 而 引 起 肿 瘤 坏 死 因 子 α 转 录, 进 一 步 放 大 初 始 的 炎 症 信 号 导 致 瀑 布 效 应 的 发 生 [25] 本 实 验 研 究 结 果 显 示, 力 竭 运 动 后 24 h, 肾 脏 组 织 肿 瘤 坏 死 因 子 α 阳 性 细 胞 表 达 增 加, 且 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 显 著 增 加, 提 示 肿 瘤 坏 死 因 子 α 表 达 可 能 与 其 上 游 的 核 因 子 κb 调 控 有 关 同 时 肿 瘤 坏 死 因 子 α 表 达 增 强, 一 方 面 可 促 使 炎 症 性 细 胞 因 子 的 合 成 与 释 放, 使 炎 症 细 胞 聚 集 黏 附, 引 起 肾 组 织 的 炎 症 性 损 伤 ; 另 一 方 面, 在 缺 血 缺 氧 的 情 况 下, 肿 瘤 坏 死 因 子 α 与 细 胞 表 面 的 死 亡 受 体 结 合, 通 过 肿 瘤 坏 死 因 子 相 关 的 凋 亡 诱 导 配 体 受 体 通 路 介 导 肾 组 织 细 胞 凋 亡 的 发 生 本 研 究 结 果 提 示, 力 竭 运 动 恢 复 期 肾 脏 组 织 的 损 伤 与 大 鼠 肾 组 织 核 因 子 κb 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 分 布 及 其 表 达 量 增 强 有 关, 提 示 力 竭 运 动 24 h 后 大 鼠 肾 缺 血 再 灌 注, 引 发 炎 症 性 损 伤 有 研 究 表 明, 黑 加 仑 提 取 物 可 降 低 大 强 度 运 动 引 起 的 血 清 中 肿 瘤 坏 死 因 子 α 的 含 量, 抑 制 炎 症 反 应 [26], 而 关 于 黑 加 仑 提 取 物 是 否 可 抑 制 力 竭 运 动 后 24 h 中 肾 脏 组 织 中 炎 症 反 应, 研 究 甚 少 本 实 验 结 果 显 示, 补 充 黑 加 仑 提 取 物 后, 大 鼠 力 竭 运 动 24 h 后 核 因 子 κb 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α 的 阳 性 细 胞 表 达 减 少, 核 因 子 κb mrna 表 达 显 著 性 下 降 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 极 显 著 性 下 降, 提 示 黑 加 仑 提 取 物 可 抑 制 力 竭 运 动 后 24 h 中 肾 脏 组 织 中 炎 症 因 子 的 表 达, 促 进 肾 脏 组 织 炎 症 损 伤 的 快 速 恢 复 结 论 : 力 竭 运 动 后 24 h 大 鼠 肾 脏 组 织 结 构 和 超 微 结 构 发 生 病 理 性 变 化, 肾 组 织 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 增 加, 上 调 肾 组 织 炎 症 信 号 通 路 的 表 达, 导 致 肾 脏 炎 症 性 损 伤 黑 加 仑 提 取 物 可 减 少 肾 脏 中 核 因 子 κb mrna 和 肿 瘤 坏 死 因 子 α mrna 表 达 减 少, 修 复 肾 脏 组 织 结 构, 预 防 炎 症 性 损 伤, 为 力 竭 运 动 致 肾 损 伤 的 治 疗 提 供 一 个 新 的 治 疗 靶 点 致 谢 : 感 谢 上 海 中 医 药 大 学 科 技 实 验 中 心 陆 熊 老 师 林 敏 老 师 袁 琳 老 师 和 胡 娜 老 师 对 病 理 切 片 及 观 察 给 予 的 指 导! 感 谢 本 科 生 张 婷 许 清 参 与 实 验! 作 者 贡 献 : 实 验 设 计 刘 霞, 实 验 实 施 刘 霞 顾 翠 英, 蒋 嘉 烨, 实 验 评 估 陆 海 英, 资 料 收 集 为 顾 翠 英 刘 霞 成 文, 蔡 美 琴 审 校 并 对 文 章 负 责 利 益 冲 突 : 文 章 及 内 容 不 涉 及 相 关 利 益 冲 突 伦 理 要 求 : 实 验 过 程 中 对 动 物 的 处 置 符 合 2009 年 Ethical issues in animal experimentation 相 关 动 物 伦 理 学 标 准 的 条 例 学 术 术 语 : 核 因 子 κb- 是 一 种 普 遍 存 在 的 转 录 因 子, 几 乎 存 在 于 体 内 所 有 细 胞, 主 要 参 与 体 内 许 多 炎 性 细 胞 及 炎 症 介 质 基 因 转 录 调 节, 诱 发 炎 症 反 应 它 调 控 多 种 基 因 的 表 达, 是 多 种 信 号 传 导 途 径 的 汇 聚 点, 在 调 节 炎 症 反 应 的 基 因 中 起 关 键 作 用 作 者 声 明 : 文 章 为 原 创 作 品, 无 抄 袭 剽 窃, 无 泄 密 及 署 名 和 专 利 争 议, 内 容 及 数 据 真 实, 文 责 自 负 P.O. Box 10002, Shenyang 110180
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