養 殖 魚 類 疾 病 之 檢 診 服 務 及 監 測 黃 淑 敏 * 涂 堅 程 健 智 郭 舒 亭 林 上 海 蕭 終 融 行 政 院 農 業 委 員 會 家 畜 衛 生 試 驗 所 摘 要 利 用 病 毒 分 離 PCR 技 術 API 生 化 鑑 定 套 組 與 16S rrna 基 因 選 殖 定 序 等 技 術 進 行 台 灣 重 要 養 殖 魚 類 之 病 毒 及 細 菌 性 疾 病 診 斷 與 監 測, 從 2004 年 1 月 份 至 12 月 份 共 收 集 820 個 病 例, 自 病 例 資 料 來 源 分 析 顯 示 民 間 自 送 病 例 共 計 673 例 ( 佔 82%); 各 縣 市 動 物 疾 病 防 治 所 及 機 關 學 校 病 例 共 計 51 例 ( 佔 6.2%); 輸 出 及 輸 入 國 檢 疫 病 例 共 計 57 例 ( 佔 6.9%); 其 它 試 驗 研 究 病 例 共 計 39 例 ( 佔 4.7%) 水 產 動 物 病 例 種 類 分 析 結 果 顯 示 養 殖 淡 水 魚 佔 15.4%; 養 殖 海 水 魚 佔 66%; 觀 賞 魚 佔 6.2%; 貝 類 佔 0.3%; 兩 棲 類 佔 4.3%; 甲 殼 類 佔 6.5%; 其 他 未 知 魚 種 隻 病 例 佔 1.3% 疾 病 診 斷 分 析 結 果, 在 細 菌 性 疾 病 共 檢 出 252 例 ( 佔 37.3%), 其 中 以 94 株 鏈 球 菌 (Streptococcus iniae) 為 最 多 23 例 ( 佔 9.1%) 努 卡 氏 菌 (Nocardia seriolae) 次 之, 以 上 兩 種 細 菌 為 最 常 見 且 廣 泛 發 生 於 海 水 及 淡 水 魚 種 而 Vibrio Spp 共 計 25 例 ( 佔 9.9%) 且 好 發 於 夏 天 ;Aeromonas hydrophila 計 16 例 ( 佔 6.3% ), 且 好 發 於 夏 天 ;Photbacterium damselae subsp. piscicida 計 12 例 ( 佔 4.7%) 並 好 發 於 冬 天 病 毒 性 疾 病 共 計 診 出 327 例, 其 中 虹 彩 病 毒 感 染 症 (Iridovirus infection)160 例 ( 佔 49%) 病 毒 神 經 壞 死 病 毒 感 染 症 (Virus nervous necrosis virus ) 為 114 例 ( 佔 36.2%) 虹 彩 病 毒 及 病 毒 神 經 壞 死 病 毒 合 併 感 染 共 計 42 例 ( 佔 13 %) 4 例 淋 巴 囊 腫 症 5 例 錦 鯉 疱 疹 病 毒 感 染 症 2 例 螃 蟹 之 Birnavirus-like 感 染 症 ; 8 例 寄 生 蟲 感 染 性 疾 病 及 1 例 水 黴 病 及 其 他 病 因 6 例 等 共 計 7 例 由 以 上 結 果 顯 示 目 前 養 殖 魚 類 重 要 病 毒 性 疾 病 主 要 以 虹 彩 病 毒 感 染 症 及 病 毒 神 經 壞 死 感 染 症 為 主, 細 菌 性 疾 病 以 鏈 球 菌 奴 卡 氏 菌 及 弧 菌 為 主, 本 結 果 可 提 供 作 為 疫 苗 研 發 或 防 疫 政 策 參 考 等 所 需, 以 解 決 養 殖 業 者 對 水 產 疾 病 發 生 之 困 擾 關 鍵 字 : 養 殖 魚 類 診 斷 魚 類 疾 病 9 前 言 國 內 既 有 之 水 產 動 物 疾 病, 隨 著 飼 養 的 環 境 及 氣 候 溫 度 之 劇 烈 變 化, 疾 病 之 發 生 率 亦 隨 之 增 加, 我 國 水 產 養 殖 環 境 大 多 為 密 集 式 飼 養, 更 亦 因 緊 迫 等 因 素 造 成 疾 病 發 生 率 增 高, 且 我 國 加 入 WTO 後, 國 際 間 水 產 品 自 由 輸 入 我 國, 同 時 增 加 海 外 水 產 動 物 傳 染 病 境 外 移 入 之 機 會, 因 此 水 產 動 物 疾 病 之 診 斷 防 治 與 監 測 急 需 解 決 本 試 驗 利 用 本 所 已 開 發 出 部 分 魚 類 之 細 胞 株 與 PCR 技 術, 進 行 魚 類 病 毒 性 疾 病 之 分 離 與 研 究 ; 而 細 菌 性 疾 病 則 於 培 養 分 離 後, 進 行 API 生 化 測 定 或 16S rrna 基 因 選 殖 定 序 等 技 術 來 檢 診 再 依 據 疾 病 發 生 之 概 況 進 行 分 析 探 討, 以 瞭 解 我 國 水 產 動 物 疾 病 疫 情 發 生 情 形 並 提 供 疫 苗 研 發 或 防 疫 政 策 等 參 考 所 需, 目 的 乃 為 預 防 水 產 動 物 疾 病 發 生 減 少 養 殖 戶 損 失 並 提 昇 養 殖 產 業 之 國 際 競 爭 力 *
10 材 料 與 方 法 病 例 來 源 本 試 驗 之 檢 體 來 源 為 各 縣 市 動 物 防 疫 機 關 學 術 研 究 單 位 機 關 學 校 私 人 開 業 獸 醫 師 養 殖 業 者 及 觀 賞 魚 業 者 等, 主 動 送 至 本 所 及 本 所 定 期 主 動 前 往 養 殖 場 採 材 病 例 魚 種 種 類 本 試 驗 共 計 有 日 本 鰻 歐 洲 鰻 ( 白 鰻 ) 吳 郭 魚 七 星 鱸 加 州 鱸 金 目 鱸 條 紋 鱸 毛 蟹 水 晶 蝦 白 蝦 泰 國 蝦 淡 水 蝦 草 蝦 石 斑 虎 斑 石 斑 龍 膽 石 斑 金 錢 斑 東 星 石 斑 ( 紅 條 ) 曳 絲 鑽 嘴 魚 花 身 雞 魚 虱 目 魚 星 雞 魚 ( 金 鈴 ) 台 拉 燕 魚 ( 樹 葉 ) 短 棘 ( 金 僧 ) 四 絲 馬 r( 午 仔 魚 ) 短 鰭 紅 沙 ( 黃 臘 鰺 ) 黃 金 鰺 黃 金 鮸 鮸 魚 赤 鰭 笛 鯛 ( 紅 魚 ) 銀 紋 笛 鯛 ( 紅 糟 ) 苦 身 雞 魚 ( 金 錢 魚 ) 川 紋 笛 鯛 白 星 笛 鯛 ( 白 點 ) 條 紋 簾 鯛 ( 銅 盤 ) 黃 錫 鯛 ( 枋 頭 ) 海 鱺 筍 殼 魚 烏 魚 鰱 魚 鱘 魚 丁 桂 魚 香 魚 紝 燕 尾 非 洲 王 子 七 彩 神 仙 蓋 斑 鬥 魚 錦 鯉 珠 鱗 粗 首 鱲 孔 雀 魚 金 魚 福 壽 螺 蜆 九 孔 甲 魚 牛 蛙 及 虎 皮 蛙 等 58 種 水 產 動 物 病 毒 分 離 及 鑑 定 將 檢 診 服 務 檢 驗 病 材 以 研 缽 研 磨, 並 加 入 Leibovitz s L-15 Medium 培 養 液 (Gibco TM, Grand island,n.y.), 以 2000 x g,4 離 心 10 分, 取 上 清 液 以 0.45 um 過 濾 膜 過 濾, 濾 過 液 經 10 倍 及 100 倍 稀 釋 後, 海 水 魚 病 材 接 種 0.5 ml 過 濾 液 於 自 行 開 發 之 石 斑 魚 腎 臟 及 胚 胎 細 胞 株, 淡 水 魚 則 接 種 在 FHM EPC BF-2 RTG-2 細 胞 株, 於 25 感 作 1 小 時, 加 入 含 2% 胎 牛 血 清 之 L-15 培 養 液, 每 日 觀 察 細 胞 病 變 之 出 現 若 10-15 日 後 無 細 胞 病 變 出 現, 則 再 冷 凍 解 凍 細 胞 一 次, 重 新 盲 目 繼 代 後 予 以 判 定 結 果 若 有 細 胞 病 變 之 形 成 則 先 以 電 子 顯 微 鏡 檢 查, 再 以 分 子 生 物 學 方 法 做 鑑 定 如 進 行 Random PCR 反 應 基 因 選 殖 定 序 等 方 法 確 認 細 菌 病 原 鑑 定 檢 體 以 無 菌 操 作 釣 取 細 菌, 塗 抹 於 含 5% 之 綿 羊 血 血 液 培 養 基 (BBL TM, Spark,M.D.) 並 於 25 培 養 48 小 時, 以 API 套 組 ( API 20E API 20NE API 20Strep API Staph) 進 行 生 化 鑑 定 ; 若 懷 疑 抗 酸 菌 則 塗 抹 在 Lowenstein-Jenson 培 養 基 (BBL TM, Spark,M.D.),25 培 養 1 週 後 進 行 鑑 定 若 生 化 反 應 無 法 鑑 別 時 則 以 PCR 增 幅 細 菌 之 16S rrna 基 因 產 物, 產 物 利 用 選 殖 套 組 (TOPO-TA Cloning Kit) 進 行 接 合 轉 化 等 作 用, 挑 選 菌 落 培 養 增 菌, 萃 取 質 體 經 限 制 酵 素 切 割, 電 泳 分 析 確 認 後 進 行 定 序 工 作 病 毒 RNA 核 酸 萃 取 將 組 織 臟 器 乳 劑 或 病 毒 培 養 液 取 100µL, 並 加 入 1mL 的 TRIzol Reagent (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.) 萃 取 其 RNA, 經 劇 烈 震 盪 30 秒 後, 靜 置 於 室 溫 下 5 分 鐘, 再 加 入 200 µl 的 chloroform (Merck, Darmstadt, Germany), 劇 烈 震 盪 15 秒 後, 置 於 室 溫 下 15 分 鐘, 於 4 下 13,000 xg 離 心 15 分 鐘, 取 上 清 液 並 移 到 另 一 個 1.5 ml 滅 菌 離 心 管 中, 加 入 500 µl Isopropanol (Merck, Darmstadt, Germany), 靜 置 於 室 溫 下 10 分 鐘 以 沉 澱 RNA 後, 並 於 4 下 13,000 xg 離 心 20 分 鐘 下 層 的 RNA 沉 澱 物 以 1 ml 之 70% 酒 精 清 洗, 再 靜 置 於 無 菌 操 作 台 內 約 5 分 鐘 使 RNA 乾 燥, 最 後 以 20 µl diethyl pyrocarbonate (DEPC) (Sigma, St. Louis, MO) 處 理 過 的 無 菌 水 溶 解 RNA 病 毒 DNA 核 酸 萃 取 萃 取 步 驟 應 用 QlAamp DNA Mini Kit 進 行, 取 100uL 乳 劑 加 入 1.5mL 的 微 量 離 心 管 中, 加 入 100uL ATL 試 劑 及 20uL Proteinase k 振 盪, 並 置 於 56 加 熱 30 分 鐘, 再 加 入 200uL 之 AL 試 劑 震 盪 15 秒, 置 入 70 加 熱 10 分 鐘 而 後 加 入 200uL 100% 的 酒 精, 震 盪 15 秒 後 以 8,000 rpm, 25 離 心 1 分 鐘 取 一 個 spin column 將 樣 品 加 入 其 中, 用 8,000 rpm, 25 離 心 2 分 鐘, 丟 棄 收 集 管 及 廢 液 加 入 500 µl AW1, 以 8,000 rpm, 25 離 心 2 分 鐘, 丟 棄 收 集 管 及 廢 液 再 加 入 500 µl AW2, 以 1,4000 rpm, 25 離 心 5 分 鐘, 丟 棄 收 集 管 及 廢 液 最 後 加 入 200µL 的 AE buffer 以 8000 rpm, 25 離 心 2 分 鐘, 收 集 濾 過 液
11 聚 合 酉 每 鏈 鎖 反 應 於 0.2mL 離 心 管 中 加 入 5µL 之 待 測 樣 品 0.5 µl Taq DNA polymerase (5 units/µl;gibcobrl, Gauthershurg, MD) 5 µl 之 10 x PCR buffer (200 mm Tris-HCl ph 8.4 500 mm KCl 及 1% Triton x-100) 1.5 µl 之 25 mm MgCl2 1 µl 之 10 mm dntp mixture (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) 及 2.5 µl 之 10 µm primers, 各 組 反 應 的 引 子 序 列 如 表 一 表 二 最 後 加 入 37.5 µl 之 無 菌 去 離 子 水, 使 總 反 應 液 達 到 50 µl 將 上 述 所 列 之 參 與 反 應 物 置 於 管 中 振 盪 使 混 合 均 勻, 經 短 暫 快 速 離 心, 使 所 有 反 應 試 劑 均 位 於 微 量 離 心 管 底 部 後, 放 入 PCR 反 應 器 (MJ Research, INC, USA) 中 進 行 聚 合 連 鎖 反 應 每 一 循 環 之 反 應 條 件 為 : 先 以 94 進 行 10 分 鐘, 再 依 次 為 94 1 分 鐘,57 2 分 鐘 及 72 2 分 鐘, 共 進 行 30 個 循 環 增 幅 反 應, 最 後 以 72 作 用 7 分 鐘 將 未 完 成 的 反 應 完 成, 並 將 PCR 產 物 以 2% 洋 菜 膠 (FMC, Rockland, M.E) 進 行 電 泳 分 析, 確 認 增 幅 產 物 之 長 度 基 因 選 殖 定 序 將 萃 取 的 DNA 以 TOPO-TA Cloning Kit Dual Promoter 及 PCR II 載 體 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 進 行 基 因 選 殖, 其 選 殖 之 過 程 包 括 :(1) 接 合 作 用 ( 2) 轉 形 作 用 (3) 篩 選 (4) 質 體 之 純 化 (5) 限 制 酶 切 割 (6) 基 因 定 序 分 析 (7) 基 因 比 對 分 析 (1 ) 接 合 作 用 - 將 4 µl 之 PCR 產 物 1 µl 之 Salt solution 1 µl 之 TOPO 載 體 置 入 1.5 ml 離 心 管 中 混 合, 於 室 溫 下 作 用 5 分 鐘 進 行 接 合 反 應, 將 作 用 後 的 產 物 置 於 4, 以 供 進 行 轉 形 作 用 (2) 轉 形 作 用 - 以 heat shock (42,30 秒 ) 方 式 進 行 轉 形 作 用, 將 50 µl 之 One Shot Chemically Competent E. coli 自 -70 冰 箱 取 出, 置 於 冰 上 解 凍, 再 加 入 2 µl 上 述 接 合 作 用 後 之 產 物, 經 混 合 後 置 於 冰 上 作 用 30 分 鐘, 然 後 進 行 heat shock 反 應, 即 於 42 水 浴 槽 中 反 應 40 秒, 將 此 溶 液 立 即 置 於 冰 上 2 分 鐘, 再 加 入 250 µl S.O.C 培 養 基, 並 於 37 水 平 式 搖 動 培 養 1 小 時, 培 養 後 的 菌 液 即 可 進 行 篩 選 的 步 驟 (3) 篩 選 - 分 別 將 50µL 及 200 µl 轉 形 作 用 後 之 菌 液, 均 勻 塗 抹 在 兩 個 含 有 LB/Ampicillin/X-gal/IPTG 之 培 養 基 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% Bactoagar, Ampicillin 50 µg/ml) 上, 置 入 含 5% CO2 之 恆 溫 箱 於 37 培 養 18 小 時 ; 選 擇 數 個 白 色 單 獨 菌 落, 分 別 置 入 於 5 ml 之 LB/Ampicillin broth 中 (1 % tryptone, 0.5 % yeast extract, 1 % NaCl, Ampicillin 50 µg/ml), 於 37 水 平 式 搖 動 下 進 行 增 菌 18 小 時, 培 養 後 之 菌 液 保 留 2 ml 並 與 1 ml 之 100% 甘 油 混 合 均 勻 後 立 刻 置 於 -70 的 冰 箱 中 保 存, 其 餘 之 3mL 進 行 質 體 之 純 化, 並 進 一 步 確 定 基 因 的 載 入 是 否 成 功 (4) 質 體 之 純 化 - 應 用 QIAGEN Plasmid Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) 及 其 所 附 之 步 驟 進 行 將 篩 選 及 培 養 後 之 菌 液 3 ml 於 4 下 以 5,000 x g 離 心 10 分 鐘, 倒 棄 上 清 液 後 加 入 250 µl 之 P1 溶 液, 並 將 菌 塊 完 全 懸 浮, 再 加 入 250 µl 之 P2 溶 液, 於 室 溫 下 靜 置 5 分 鐘, 再 將 菌 液 與 250 µl 之 溶 液 P3 混 合 均 勻 後 冰 浴 30 分 鐘, 以 13,000 xg 離 心 10 分 鐘 並 抽 取 其 上 清 液 加 入 QIA prep column 中 進 行 過 濾, 以 750 µl 清 洗 緩 衝 液 沖 洗 管 柱 2 次, 最 後 以 50µL 之 buffer EB 沖 洗 出 管 柱 中 的 質 體, 加 入 等 量 之 Isopropanol, 並 於 4 13,000 xg 下 離 心 20 分 鐘 沉 澱 質 體, 加 入 0.5 ml 70% 酒 精 清 洗 質 體, 以 13,000 xg 離 心 5 分 鐘, 倒 掉 上 清 液 並 將 離 心 管 置 於 室 溫 下 風 乾 10 分 鐘, 加 入 20 µl 之 滅 菌 的 蒸 餾 水 溶 解 純 化 的 質 體 後 進 行 限 制 酶 之 切 割 及 電 泳 分 析 (5) 限 制 酶 切 割 - 以 限 制 酶 EcoR1 (Promega, Madison, WI ) 進 行 質 體 切 割 反 應, 以 確 定 PCR 產 物 是 否 成 功 載 入 質 體 中 取 10 µl 質 體 1 µl 限 制 酶 EcoR1(12 unit/µl) 2 µl 10 x buffer H 及 7 µl 滅 菌 之 二 次 蒸 餾 水 使 反 應 總 體 積 為 20 µl, 於 37 下 作 用 2 小 時, 作 用 完 成 後, 取 10 µl 反 應 後 之 溶 液, 以 1 x TAE buffer 泡 製 的 2% 洋 菜 膠 進 行 電 泳 分 析, 選 擇 載 入 核 酸 片 段 正 確 的 質 體 進 行 定 序 (6) 選 殖 基 因 之 定 序 - 核 酸 序 列 分 析 以 PE Taq DiDeoxy terminator cycle sequencer (Applied Biosystems Inc., CA, USA) 進 行 (7) 利 用 BLAST 系 統 進 行 基 因 序 列 比 對
12 結 果 病 例 來 源 分 析 執 行 九 十 三 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 之 檢 診 及 監 測 計 畫, 利 用 病 毒 分 離 PCR 技 術 API 生 化 鑑 定 套 組 與 16S rrna 基 因 選 殖 定 序 等 技 術 進 行 病 毒 性 及 細 菌 性 疾 病 之 診 斷 與 監 測, 全 年 共 收 集 820 個 病 例, 自 病 例 資 料 來 源 分 析 顯 示 民 間 自 送 病 例 計 673 例 ( 佔 82%); 各 縣 市 動 物 疾 病 防 治 所 及 機 關 學 校 病 例 計 51 例 (6.2%); 輸 出 及 輸 入 國 檢 疫 病 例 計 57 例 ( 佔 6.9%); 其 它 試 驗 研 究 病 例 計 39 例 ( 佔 4.7 %), 結 果 詳 見 圖 三 水 產 動 物 種 類 及 病 例 數 檢 送 的 病 例 中 依 其 水 產 動 物 種 類 分 析, 本 年 度 共 計 有 日 本 鰻 歐 洲 鰻 ( 白 鰻 ) 吳 郭 魚 七 星 鱸 加 州 鱸 金 目 鱸 條 紋 鱸 毛 蟹 水 晶 蝦 白 蝦 泰 國 蝦 淡 水 蝦 草 蝦 石 斑 虎 斑 石 斑 龍 膽 石 斑 金 錢 斑 東 星 石 斑 ( 紅 條 ) 曳 絲 鑽 嘴 魚 花 身 雞 魚 虱 目 魚 星 雞 魚 ( 金 鈴 ) 台 拉 燕 魚 ( 樹 葉 ) 短 棘 鰏 ( 金 僧 ) 四 絲 馬 鮁 ( 午 仔 魚 ) 短 鰭 紅 沙 ( 黃 臘 鰺 ) 黃 金 鰺 黃 金 鮸 鮸 魚 赤 鰭 笛 鯛 ( 紅 魚 ) 銀 紋 笛 鯛 ( 紅 糟 ) 苦 身 雞 魚 ( 金 錢 魚 ) 川 紋 笛 鯛 白 星 笛 鯛 ( 白 點 ) 條 紋 簾 鯛 ( 銅 盤 ) 黃 錫 鯛 ( 枋 頭 ) 海 鱺 筍 殼 魚 烏 魚 鰱 魚 鱘 魚 丁 桂 魚 香 魚 紝 燕 尾 非 洲 王 子 七 彩 神 仙 蓋 斑 鬥 魚 錦 鯉 珠 鱗 粗 首 鱲 孔 雀 魚 金 魚 福 壽 螺 蜆 九 孔 甲 魚 牛 蛙 及 虎 皮 蛙 等 58 種 水 產 動 物, 依 其 分 類 科 別 統 計 病 例 數 如 下 : 鰻 魚 科 (24 例 ) 吳 郭 魚 (10 例 ) 鱸 魚 科 (75 例 ; 其 中 以 金 目 鱸 佔 71 例 ) 其 他 重 要 淡 水 魚 (17 例 ) 石 斑 科 (242 例 ) 鮸 魚 (3 例 ) 鰺 科 (3 例 ) 笛 鯛 科 (93 例 ) 鯛 科 (2 例 ) 海 鱺 (106 例 ) 其 他 重 要 海 水 魚 類 (92 例, 其 中 短 棘 鰏 佔 43 例 ; 午 仔 魚 佔 24 例 ) 觀 賞 魚 (51 例, 其 中 錦 鯉 魚 為 39 例 ) 貝 類 (3 例 ) 兩 棲 類 ( 35 例, 其 中 虎 皮 蛙 為 27 例 ) 蟹 類 (2 例 ) 蝦 類 (51 例, 其 中 泰 國 蝦 為 22 例 ; 白 蝦 為 18 例 ) 其 他 走 私 魚 無 名 魚 (11 例 ) 統 計 分 類 水 產 動 物 結 果 顯 示 養 殖 淡 水 魚 佔 15.4%( 其 中 鱸 魚 為 75 例 為 最 高 ); 養 殖 海 水 魚 佔 66%( 其 中 石 斑 為 242 例 海 鱺 為 106 例 笛 鯛 科 海 水 魚 為 93 例 等 為 較 多 之 魚 種 短 棘 û 為 43 例 四 絲 馬 鮁 為 24 例 ); 觀 賞 魚 佔 6.2%( 其 中 錦 鯉 魚 為 39 例 ); 貝 類 佔 0.3%; 兩 棲 類 佔 4.3%; 甲 殼 類 佔 6.5%; 其 他 未 知 魚 種 病 例 佔 1.3%, 統 計 結 果 如 圖 四 水 產 動 物 病 例 檢 測 結 果 分 析 疾 病 診 斷 分 析 結 果, 細 菌 性 疾 病 共 檢 出 252 例, 其 中 以 94 株 鏈 球 菌 (Streptococcus iniae) 為 最 多, 佔 37.3% 23 株 努 卡 氏 菌 (Nocardia seriolae ) 次 之, 佔 9.1%, 以 上 兩 種 細 菌 為 最 常 見 且 廣 泛 發 生 於 海 水 及 淡 水 魚 種 而 Vibrio SPP 共 計 25 例, 佔 9.9%, 其 中 Vibrio aliginolyticus 為 13 例,Vibrio parahaemolyicus 為 3 例,Vibrio vulificus 為 9 例, 本 菌 好 發 於 夏 天 ;Aeromonas hydrophila 計 16 例, 佔 6.3 % 本 病 好 發 於 夏 天 ; Photobacterium damselae subsp. piscicida 共 計 12 例, 其 中 10 例 發 生 於 海 鱺, 佔 4.7 %, 本 病 好 發 於 冬 天 ; Streptococcus agalactiae 感 染 症 共 計 6 例 大 都 發 生 於 吳 郭 魚 及 海 鱺, 此 外, 鱘 魚 病 例 分 離 出 海 洋 型 分 枝 桿 菌 (Mycobacteria marinum), 為 新 出 現 之 疾 病, 統 計 結 果 如 圖 五 病 毒 性 疾 病 共 計 診 斷 出 327 例, 其 中 虹 彩 病 毒 感 染 症 為 160 例 ( 佔 49%), 以 石 斑 佔 77 例 笛 鯛 科 19 例 其 他 重 要 海 水 魚 18 例 鱸 科 魚 類 14 例 鰻 魚 8 例 兩 棲 類 12 例 海 鱺 6 例 等 為 較 多 ; 而 野 田 病 毒 感 染 症 114 例 ( 佔 36.2 %), 以 石 斑 56 例 及 赤 鰭 笛 鯛 36 例 為 較 多 其 中 虹 彩 病 毒 及 野 田 病 毒 合 併 感 染 共 計 42 例 ( 佔 13% ) 4 例 淋 巴 囊 腫 症 5 例 錦 鯉 û 疹 病 毒 感 染 症 2 例 螃 蟹 類 birnavirus 感 染 症, 統 計 結 果 如 圖 六 本 年 度 統 計 之 寄 生 蟲 感 染 性 疾 病 共 有 8 例, 主 要 以 車 輪 蟲 指 環 蟲 鐘 型 蟲 及 白 點 蟲 感 染 為 主, 其 他 疾 病 為 1 例 水 黴 病 及 其 他 病 因 6 例 等 共 計 7 例 討 論 台 灣 的 養 殖 場 現 今 主 要 的 細 菌 性 疾 病, 以 鏈 球 菌 ( Streptococcus iniae ) 奴 卡 氏 菌 (Nocardia seriolae ) 及 弧 菌 (Vibrio spp. ) 為 主, 其 中
13 Streptococcus iniae 及 Nocardia seriolae 在 全 年 度 都 會 高 的 發 生 率 且 無 好 發 季 節 的 特 異 性 ; 而 日 本 的 Nocardia 感 染 則 好 發 於 秋 天 (6),Nocardia seriolae 可 感 染 的 魚 種 宿 主 非 常 廣 泛, 可 侵 犯 淡 水 魚 及 海 水 魚, 被 感 染 魚 體 會 造 成 全 身 之 肉 牙 腫 病 變, 將 細 菌 包 裹 於 肉 牙 腫 內, 以 躲 避 免 疫 細 胞 的 攻 擊, 若 不 幸 感 染 本 病 則 必 須 長 期 投 藥 才 能 控 制, 且 一 旦 感 染 本 病 後 要 自 養 殖 場 內 清 除 是 非 常 困 難 的 台 灣 的 Streptococcus infection 主 要 有 兩 種 病 源 Streptococcus agalactiae 及 Streptococcus iniae, 其 中 Streptococcus agalactiae 好 發 於 吳 郭 魚 但 亦 在 海 水 魚 ( 海 鱺 ) 上 發 現 Streptococcus iniae 在 台 灣 之 感 染 率 非 常 高 且 全 年 都 會 發 生 感 染, 可 感 染 於 淡 水 魚 及 海 水 魚 ; 日 本 的 Streptococcus iniae 則 好 發 於 高 水 溫 期, 且 於 1997 年 即 以 福 馬 林 不 活 化 疫 苗 控 制 本 病, 因 此, 本 病 亦 為 現 今 養 殖 魚 類 必 須 加 以 重 視 的 重 要 疾 病 弧 菌 感 染 症 (Vibrio spp. infection), 在 分 析 病 例 中 以 Vibrio aliginolyticus 為 主, 此 結 果 與 地 中 海 國 家 的 弧 菌 感 染 症 相 似 (7), 此 病 會 對 幼 苗 幼 魚 及 成 魚 造 成 感 染 Photobacterium damselae subsp. piscicida 在 分 析 病 例 中 主 要 好 發 冬 天, 此 結 果 與 中 東 地 區 日 本 相 似 本 年 度 新 分 離 之 海 洋 型 分 支 桿 菌 (Mycobacterium marinum), 在 台 灣 首 先 被 發 現, 相 對 的 本 病 在 地 中 海 地 區 亦 為 其 主 要 的 流 行 的 疾 病 目 前 養 殖 魚 類 重 要 病 毒 性 疾 病 主 要 以 虹 彩 病 毒 感 染 症 (Iridovirus infection ) 及 病 毒 神 經 壞 死 病 毒 感 染 症 (viral nervous necrosis infectiom) 為 主, 虹 彩 病 毒 感 染 症 在 台 灣 主 要 有 兩 種, 一 種 為 淋 巴 囊 腫 型 ; 另 依 為 內 臟 型 虹 彩 病 毒 感 染, 目 前 這 兩 種 疾 病 都 普 遍 存 在 台 灣 淡 水 海 水 之 養 殖 場 及 箱 網 養 殖, 也 廣 泛 發 生 於 新 加 坡 日 本 中 東 地 區 及 中 國 大 陸 (2) 目 前 日 本 已 研 發 內 臟 型 虹 彩 病 毒 的 不 活 化 疫 苗 來 控 制 本 病 (3,4) 日 本 的 病 毒 神 經 壞 死 病 毒, 好 發 於 夏 天, 此 病 毒 可 從 種 魚 的 生 殖 腺 受 精 卵 魚 苗 以 至 二 吋 幼 苗 階 段 等 皆 可 被 偵 測 出, 以 上 兩 種 病 毒 已 散 佈 全 世 界 各 地, 造 成 全 球 養 殖 業 相 當 大 的 損 失 臺 灣 養 殖 的 生 產 模 式, 基 本 上 分 為 種 魚 仔 魚 稚 魚 成 魚 銷 售 等 階 段 之 分 工 制, 與 歐 美 日 本 從 種 魚 到 養 成 的 一 貫 作 業 生 產 方 式 不 同, 因 此 當 有 垂 直 感 染 的 疾 病 發 生 時, 其 防 治 的 方 法 是 非 常 困 難 的, 所 以 必 須 發 展 一 個 敏 感 性 高 之 檢 測 工 具 以 期 早 期 偵 測 本 病 毒, 以 減 少 養 殖 戶 之 損 失 參 考 文 獻 1. Gilad, O., S.Yun, K.B. Andree, M. A. Adkison, A. Zlotkin, H.Bercorier, A.Eldar, R. P.Hedrick. 2002. Initial characteristics of kol herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis. Aquat Org. 48: 101-108. 2. Kazuhiro Nakajima, Kiyoshi Inouye, Minoru Sorimachi. 1998. Viral disease in cultured marine fish in Japan. Fish Pathol 33(4): 181-188. 3. Kazuhiro Nakajima, Yukio Maeno, Atsushi Honda, Kenichi Yokoyama, Tetsurou Tooriyama, Sadao Manabe.,1999. Effectiveness of a vaccine against red sea bream iridoviral disease in a field trial test. Dis Aquat. Org 36: 73-75. 4. Kazuhiro Nakajima, Takafumi lto,jun Kurita, Hidemasa Kawakami, Tomokazu ltano, Yutaka Fukuda, Yumkio Aoi, Tetsurou Tooriyama, Sadao Manabe, Effectiveness of a vaccine against red sea bream iridoviral disease in various cultured marine fish under laboratory conditions, 2002, Fish Pathol, 37(2): 90-91. 5. Nishizawa T, Mori K, Furuhashi M, Nakai T, Furusawa I, Muroga K., 1995, Comparison of the coat protein gene of fish nodaviruses, the causative agents of viral nervous necrosis(vnn) in marine fish. J Gen Virol 76: 1563-1569. 6. Riichi Kusuda, Kenji Kawai, 1998. Bacterial Diseases of cultured marine fish in Japan. Fish Pathol 33(4): 221-227. 7. Rodgers, C.J., Furones, M.D., 1998. Disease Problems in cultured marine fish in the Mediterranean, Fish Pathol, 33(4): 157-164
14 表 一 水 產 動 物 病 毒 性 疾 病 RT-PCR PCR 使 用 引 子 序 列 及 參 考 文 獻 Primer sources Viral diseases Primer sequence References IHN IHNF 5 -TCA AGG GGG GAG TCC TCG A 3 IHNR 5 -CAC CGT ACT TTG CTG CTA C 3 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 VHS First step VHSF 5 -GGG GAC CCC AGA CTG T 3 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 Second step VHSF 5 -GGG GAC CCC AGA CTG T 3 VHSR 5 -TCT CTG TCA CCA TGA TCC 3 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 SVC First step SVCR2 5 -AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC ATH ACN CAY 3 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 Second step SVCF1 5 -TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC 3 SVCR4 5 - CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY TGY 3 KHV KHV 9/5F 5 -GAC GAC GCC GGA GAC CTT GTG 3 Gilad et al., 2002(1) KHV 9/5R 5 -CAC AAG TTC AGT CTG TTC CTC AAC 3 Iridovirus F91 5 -GAC GAC GAC GAC GCC ACT ACG TAC TTT ATC -3 Unpublished paper Virus nervous necrosis virus R475 5 -GCC AGC ACC CGC TGG TGT TTC CGA TCA TG 3 Noda F2 5 - CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT 3 Noda R3 5 - CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA 3 Nishizawa et al., 1995(5) 表 二 水 產 動 物 細 菌 性 疾 病 PCR 使 用 引 子 序 列 Primer sources Primer sequences Bacterial disease Streptococcus iniae SHep 144N 5 -GGA AAG AGA CGC AGT GTC AAA AGA C-3 SHep 516N 5 -CTT ACC TTA GCC CCA GTC TAA CGA C-3 Nocardia seriolae NS1 5 -ACT CAC AGC TCA ACT GTG G -3 NG1 5 -ACC GAC CAC AAG GGG G-3 16S rrna gene 16SDNA20F 5 -AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3 16 SDNA1500R 5 -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 Streptococcus agalactiae SAGAF 5 -CCA CGA TCT AGA AAT AGA TTG 3 SAGAR 5 -TGC CAA GGC ATC CAC C 3
圖 三 九 十 三 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 監 測 病 例 資 料 來 源 分 析 病 例 數 700 600 500 400 300 200 100 93 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 監 測 病 歷 資 料 來 源 分 析 0 民 間 自 送 病 例 673 防 治 所 及 學 校 51 輸 出 國 檢 疫 57 其 他 試 驗 研 究 39 民 間 自 送 病 例 防 治 所 及 學 校 輸 出 國 檢 疫 其 他 試 驗 研 究 圖 四 九 十 三 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 檢 測 之 水 產 動 物 種 類 分 析 93 年 度 水 產 動 物 種 類 分 析 70.00% 比 分 百 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% 養 殖 海 水 魚 養 殖 淡 水 魚 觀 賞 魚 貝 類 種 別 兩 棲 類 甲 殼 類 其 他 養 殖 海 水 魚 養 殖 淡 水 魚 觀 賞 魚 貝 類 兩 棲 類 甲 殼 類 其 他
圖 五 九 十 三 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 監 測 細 菌 性 疾 病 結 果 分 析 九 十 三 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 監 測 細 菌 性 疾 病 結 果 比 分 百 40 35 30 Streptococcus iniae Nocardia seriolae 25 20 15 10 5 Vibrio spp Aeromonas hydrophila Photo. damselae subsp. piscicida Streptococcus agalactiae 0 疾 病 名 稱 圖 六 九 十 三 年 度 養 殖 魚 類 疾 病 監 測 病 毒 性 疾 病 結 果 分 析 93 年 度 養 殖 魚 類 病 毒 性 疾 病 結 果 分 析 60 比 分 50 百 40 30 20 10 0 疾 病 類 別 Iridovirus infection Virus nervous necrosis virus infection Iridovirus and Virus nervous necrosis virus infection Ly mp hocy stivirus infection koi herpesvirus infection
17 Practice service and surveillance of cultured fish diseases Sue-Min Haung, Chien Tu, Chien-Chin Cheng, Shu-Ting Kuo, Shang-Hai Lin, Jong-Rong Shiau Animal Health Research Institute, Couni of Agriculture Eight hundred twenty cases of aquatic animal speciments were collected for diagnosis and monitoring program from January to December 2004 in Taiwan.Diagnosis of bacterial and viral diseases were carried out utilizing the techniques of viral isolation, PCR methods, API kits and analysis of 16S rrna gene. Analysis of case sources revealed that 82% were from private fish farms, 6.2% from local Livestock Diseases Control Centers and university, 6.9% from quarantine bureaus and 4.7% from research programs. The percentage distribution of species in collected specimens include 15.4% of freshwater fish (mainly Percidae spp), 66% of seawater fish (maninly Epinephlus spp, Cobia, Lutjanidae spp), 6.2% of pet fish(mainly koi), 6.5% of crustacean, 4.3% of amphibians, 0.3% of shellfish and others 1.3% from the total cases. Out of 252 cases of bacterial infections, both Streptococcus iniae (37.3%) and Nocardia seriolae (9.1%) infection were commonly found in freshwater and seawater fish. Vibrio spp infection(9.9%) usually occurred in summer, whereas Photobacterium damselae subsp. piscicida (4.7%) did in winter. A total of 327 cases of viral infection were diagnosed, which is composed of Iridovirus infection (49 %), Virus nervous necrosis virus infection (36.2%), mixed infecton of above both virus (13%), Lymphocystivirus infection (4 cases), Koi herpesvirus infection (5 cases), birnavirus-like virus infection in crab (2 cases).besides, 8 cases of parasitic infection, 1 case of fungal infection and 6 cases of other disease contributed to the total cases. The above results showed the major viral diseases in cultured fish are caused by Iridovirus and Virus nervous necrosis virus and the major bacterial diseases are caused by Streptococcus iniae, Nocardis seriolae, Vibrio spp infection. The above data of disease prevalence can provide reference for vaccine development and prevention policy, also resolving diseases problem for fish farmers. Keyword:cultured fish, diagnosis, diseases *Corresponding Author Animal Health Research Institute