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1 臺 灣 二 OO 四 年 國 際 科 學 展 覽 會 科 別 : 微 生 物 學 科 作 品 名 稱 : 耐 熱 性 酵 素 生 產 菌 Bacillus Subtilis WLA12 之 分 離 與 定 性 得 獎 獎 項 : 微 生 物 學 科 第 一 名 候 補 作 品 學 作 校 : 臺 北 市 立 第 一 女 子 高 級 中 學 者 : 李 昱 蓉

2 耐 熱 性 酵 素 生 產 菌 Bacillus Subtilis WLA12 之 分 離 與 定 性 Isolation and Analysis of Enzyme-producing Thermophile Bacillus Subtilis WLA12 摘 要 本 實 驗 針 對 一 取 自 台 北 縣 烏 來 南 勢 溪 下 游 之 溫 泉 菌, 進 行 微 生 物 學 生 物 化 學 分 子 生 物 學 三 方 面 之 觀 察 與 實 驗, 期 能 得 到 一 可 生 產 特 定 酵 素 之 菌 種, 且 具 耐 高 溫 之 抗 逆 境 能 力 對 其 酵 素 進 行 定 性, 並 嘗 試 轉 殖 出 相 關 基 因, 使 之 可 大 量 表 現 目 前 已 篩 選 出 一 種 可 生 產 多 種 酵 素 之 菌 種 依 其 採 集 地 點 暫 稱 WL-A12 經 菌 種 鑑 定 為 Bacillus subtilis WL-A12 藉 由 菌 落 檢 測 法 以 及 Zymogram 的 方 式 做 酵 素 分 析, 並 以 電 導 轉 形 等 技 術, 希 望 能 成 功 轉 至 E. coli 上 表 現 另 外, 也 對 該 菌 種 作 了 一 些 基 本 微 生 物 方 面 的 觀 察 如 需 氧 情 況 最 適 生 長 溫 度 Abstract We isolated enzyme-producing thermophilic bacteria from hot springs near downriver of Nan-shi, Wulai, Taipei ( 北 縣 烏 來 南 勢 溪 ). Through microbiological, biochemistry and molecular biological analyses, a multiple enzyme-producing Bacillus subtilis strain, designated WLA12, has been isolated. The growth condition of WLA12 was observed. Using basic colony assay and zymogram analysis (gel electrophoresis) to observe the expressed enzymes, molecular weight and gene size of the enzymes were revealed. With comparison to E. coli control strain, the related enzymes were only found in WLA12. To express the Bacillus genes in E. coli, molecular cloning and gene transformation via electroporation was carried out

3 一 前 言 ( 一 ) 研 究 動 機 不 論 是 環 保 或 者 工 業 生 產, 在 物 質 分 解 的 方 面, 微 生 物 都 有 很 大 的 貢 獻 利 用 一 些 細 菌 所 生 產 出 的 酵 素, 進 而 轉 變 為 高 價 值 的 工 具, 是 為 技 術 上 的 一 大 邁 進, 且 較 不 具 其 他 人 造 化 學 物 質 所 可 能 產 生 之 環 保 問 題 而 若 一 種 微 生 物 能 具 有 多 種 功 能, 如 抗 逆 境 的 能 力 較 高 或 單 一 菌 種 可 生 產 多 種 不 同 受 質 之 水 解 酶, 則 其 應 用 價 值 又 益 發 提 昇 因 此, 經 由 跟 教 授 的 討 論, 我 們 希 望 可 以 找 出 一 種 同 時 具 備 耐 高 溫 以 及 酵 素 生 產 等 能 力 的 菌 種, 對 其 做 酵 素 的 定 性 分 析 並 嘗 試 用 基 因 轉 殖 的 方 式 將 該 酵 素 大 量 製 造 ( 二 ) 研 究 目 的 本 實 驗 針 對 一 取 自 台 北 縣 烏 來 南 勢 溪 下 游 之 溫 泉 菌, 進 行 微 生 物 學 生 物 化 學 分 子 生 物 學 三 方 面 之 觀 察 與 實 驗, 期 能 得 到 一 可 生 產 特 定 酵 素 之 菌 種, 且 具 耐 高 溫 之 抗 逆 境 能 力, 對 其 酵 素 進 行 定 性, 並 嘗 試 轉 殖 出 相 關 基 因, 使 之 可 大 量 表 現 目 前 已 篩 選 出 一 種 可 生 產 多 種 酵 素 之 菌 種, 實 驗 中 以 其 取 樣 地 點 暫 稱 WLA12, 經 菌 種 鑑 定 為 Bacillus subtilis, 藉 由 菌 落 檢 測 法 以 及 Zymogram 的 方 式 做 酵 素 分 析, 並 以 電 導 轉 形 等 技 術, 希 望 能 成 功 轉 至 E-coli 上 表 現 另 外, 也 對 該 菌 種 作 了 一 些 基 本 微 生 物 方 面 的 觀 察 如 需 氧 情 況 最 適 生 長 溫 度 ( 三 ) 研 究 問 題 針 對 在 台 北 縣 烏 來 南 勢 溪 下 游 的 溫 泉 湧 出 口 所 採 集 到 的 樣 本, 篩 選 出 一 種 可 生 產 多 種 酵 素 之 菌 種 且 具 耐 高 溫 特 性 的 菌 種, 針 對 以 下 三 方 面 做 研 究 : 1. 微 生 物 學 方 面 : 觀 察 其 需 氧 程 度 最 適 生 長 溫 度 及 菌 落 型 態 2. 生 物 化 學 方 面 : 對 其 生 產 之 酵 素 作 定 性 分 析 3. 分 子 生 物 學 方 面 : 嘗 試 將 其 酵 素 以 基 因 轉 殖 之 方 式 大 量 生 產 - 2 -

4 二 研 究 方 法 或 過 程 ( 一 ) 研 究 設 計 微 生 物 方 面 需 氧 程 度 檢 測 繪 製 生 長 曲 線 推 知 最 適 生 長 溫 度 畫 菌 培 養 菌 落 型 態 觀 察 進 行 實 驗 得 知 該 菌 種 最 適 生 長 環 境 以 利 培 養 生 物 化 學 方 面 無 該 酵 素 活 性 菌 落 檢 測 有 該 酵 素 活 性 SDS PAGE 電 泳 酵 素 檢 測 整 理 結 果 由 電 泳 結 果, 推 知 酵 素 之 蛋 白 質 大 小 以 選 取 基 因 分 子 生 物 學 方 面 基 因 轉 殖 菌 種 鑑 定 抽 取 菌 體 DNA 以 限 制 切 出 適 當 大 小 之 片 段 ligation; 抽 取 質 粒 DNA 將 片 段 接 入 質 粒 將 質 粒 轉 入 E-coli 表 現 檢 測 是 否 有 該 酵 素 抽 取 16S rdna 轉 入 T vector DNA 定 序 資 料 庫 比 對 ( 二 ) 實 驗 器 材 離 心 機 蛋 白 質 電 泳 槽 振 盪 器 定 溫 培 養 箱 分 光 光 度 計 基 質 skim milk, casein, pectin, CMC, xylan..., 其 他 藥 品 以 及 實 驗 室 必 備 的 實 驗 用 品 ( 三 ) 研 究 方 法 微 生 物 學 方 面 樣 本 篩 選 1. 將 5 個 樣 本 自 南 勢 溪 下 游 5 個 採 樣 點 取 得 的 溫 泉 水 各 100ml 以 濾 膜 過 濾, 至 少 兩 次 以 上 2. 準 備 10 個 培 養 皿, 內 盛 含 有 基 質 Skin milk 的 培 養 基, 將 5 個 樣 本 的 濾 膜 和 泉 水 分 別 放 置 在 一 個 培 養 皿 上 3. 將 10 個 培 養 皿 置 於 37 下 做 隔 夜 培 養 4. 觀 察 培 養 基 上 是 否 出 現 酵 素 水 解 圈, 以 了 解 是 否 具 有 欲 取 得 之 酵 素 - 3 -

5 菌 種 的 純 化 與 保 存 1. 以 接 種 環 從 酵 素 活 性 帶 挑 出 細 菌 2. 將 之 接 種 至 另 一 培 養 皿 上 並 編 號 3. 將 培 養 皿 放 在 37 下 做 隔 夜 培 養 4. 將 長 出 的 菌 落 做 三 次 的 單 株 分 離, 並 確 定 沒 有 其 他 雜 菌, 以 純 化 菌 種 5. 將 純 化 過 的 菌 種 再 做 一 次 蛋 白 酶 活 性 測 定, 確 定 具 活 性 後, 接 種 至 16mm x 160mm 懸 蓋 玻 璃 試 管 (LB/Agar mm MnCl2) 中 保 存 需 氧 程 度 檢 測 1. 以 解 剖 針 於 pre-culture 的 菌 液 中 取 樣 2. 將 解 剖 針 刺 入 裝 有 LA 固 態 培 養 基 之 試 管 中, 於 一 定 溫 度 下 本 實 驗 設 定 為 攝 氏 50 度 加 蓋 做 隔 夜 培 養 3. 觀 察, 若 菌 落 分 布 在 管 底, 則 為 厭 氧 菌 ; 若 在 與 空 氣 交 界 處, 則 為 好 氧 菌 ; 若 無 固 定 分 布, 則 為 兼 性 菌 最 適 生 長 溫 度 1. 對 Pre-culture 之 菌 液 做 200 倍 稀 釋 2. 使 用 分 光 光 度 計 測 OD600 以 LB 注 入 玻 璃 比 色 管 歸 零 校 正 以 推 算 出 菌 液 中 之 菌 濃 度 3. 分 時 間 點 紀 錄 每 隔 30 分 鐘 紀 錄 一 次, 繪 製 對 數 圖 4. 得 出 各 溫 度 之 生 長 曲 線 5. 利 用 圖 表 求 出 菌 生 長 之 doubling-time, 時 間 最 短 者 即 為 此 菌 種 之 最 適 生 長 溫 度 生 物 化 學 方 面 Zymogram 之 樣 本 製 備 1. 取 1 ml 菌 液 置 於 空 的 Eppendorf 中 2. 將 Eppendorf 放 在 4 0 C 離 心 機 中 以 12,000 rpm 離 心 10 分 鐘 3. 將 Eppendorf 中 之 上 清 液 以 water pump 吸 乾, 將 菌 體 懸 浮 於 適 量 之 Sample Buffer 混 勻 後 置 入 4 0 C 保 存 蛋 白 水 解 酶 菌 落 檢 測 法 依 Sacherer et al., 將 細 菌 塗 在 固 體 培 養 基 LA 上 2. 將 100μl 之 菌 液 稀 釋 液 加 入 3.5~5 ml 含 1.5% skim milk 之 1%Bacto-agar 中, 混 勻 後 倒 在 固 體 培 養 基 上 3. 將 培 養 皿 放 在 適 當 的 溫 度 下 做 隔 夜 培 養 4. 在 乳 白 色 背 景 中, 有 酵 素 活 性 的 菌 落 周 圍 會 呈 現 透 明 之 水 解 圈 - 4 -

6 多 醣 類 水 解 酶 菌 落 檢 測 法 依 Wood et al., 1988; DalbØge and Heldt-Hansen 將 細 菌 塗 在 固 體 培 養 基 LA 上 2. 在 培 養 基 表 面 加 3.5ml 含 1% 基 質 xylan for xylase, CMC for endoglucanase, Avicel for cellobiohydrolase 之 0.7% agarose 倒 在 固 體 培 養 基 上 3. 將 培 養 皿 放 在 適 當 的 溫 度 下 做 隔 夜 培 養 4. 在 培 養 基 表 面 加 10~15ml 之 0.1% congo red 溶 液 5. 作 用 約 10~15 分 鐘 後, 倒 去 多 餘 之 溶 液, 以 10~15 ml 之 1M NaCl 沖 洗 兩 次 6. 在 紅 色 背 景 中, 有 酵 素 活 性 的 菌 落 周 圍 會 呈 現 白 色 或 粉 紅 色 蛋 白 質 水 解 酶 多 醣 類 水 解 酶 SDS-PAGE 檢 測 法 Zymogram, 依 Blanco et al., 1998 方 式 : 基 質 配 製 於 電 泳 膠 體 中, 當 分 析 之 樣 本 電 泳 完 成 後 直 接 進 行 染 色 1. SDS-PAGE 依 一 般 方 式 配 製, 唯 在 separation gel( 10% acrylamide) 中 加 入 0.1~0.2% 之 基 質 2. 將 酵 素 以 SDS-PAGE 電 泳 分 離 3. 將 膠 體 以 適 當 之 緩 衝 液 (50mM PBS, ph7.0 ) 洗 滌 30 分 鐘 4. 將 膠 體 以 2.5% Triton X-100 浸 泡 overnight, 並 振 盪 之 5. 將 膠 體 以 適 當 之 緩 衝 液 (50mM PBS, ph7.0 ) 洗 滌 30 分 鐘 6. 將 膠 體 浸 入 0.1%congo red 中 染 色 30 分 鐘 ( 此 步 驟 適 用 於 多 醣 類 水 解 酶 之 測 定, 蛋 白 水 解 酶 之 測 定 直 接 跳 至 步 驟 9) 7. 以 1M NaCl 溶 液 洗 滌 膠 體 二 至 三 次, 每 次 10~20 分 鐘, 直 至 酵 素 活 性 帶 能 以 目 視 察 覺 8. 以 5% acetic acid 浸 泡 膠 體 始 背 景 轉 為 深 藍 色 ( 多 醣 類 水 解 酶 之 測 定 到 此 步 驟 止 ) 9. 膠 體 以 Coomassie Btilliant Blue R-250 染 色 觀 察 註 :(a)xylan pectin 等 與 Congo red 親 和 力 低 的 多 醣 若 使 用 Congo red 染 色 會 有 較 不 明 顯 的 結 果, 可 改 用 其 他 染 劑, 如 pectin starch 可 用 Iodine 溶 液 染 色 (b) 如 果 將 agarose 酸 化 ( 如, 以 10~15 ml 的 5% acetic acid 洗 幾 次 ), 背 景 會 轉 成 深 藍 色 分 子 生 物 學 方 面 菌 體 染 色 體 DNA 之 抽 取 材 料 :Buffers(for 30 ml bacterial culture) A B C* Conc. H2O 43.75ml 5ml ml 1 M Tris, ph ml 125μl 125μl 50mM 0.5 M EDTA, ph ml 400μl 400μl 40mM 5 M NaCl 1.25 ml 100μl 100μl 100mM Lysozyme (powder) - 2.5mg - 0.5mg/ml - 5 -

7 RNase Solution - 10μl** - 0.2mg/ml 10% SDS - - 1ml 2% Proteinase K (powder) mg 20μg/ml Total 50ml 5ml 5.0ml *Buffer C: 使 用 前, 在 37 中 保 溫 1-2 小 時 **RNase Solution:10 mg/ml H2O, 以 100 加 熱 一 分 鐘, 冷 凍 備 用 1. 將 培 養 的 菌 亦 以 10000rpm,4 o C 離 心 10 分 鐘 2. 加 入 2.5ml 的 Buffer A, 搖 勻 後 離 心 3. 加 入 2.5ml 的 Buffer B 並 混 勻 4. 將 混 合 液 靜 置 於 37 o C 下 至 少 30 分 鐘 待 其 作 用 5. 加 入 5ml 的 Buffer C 並 混 勻 6. 靜 置 於 37 o C0.5~2 小 時 直 到 混 合 液 呈 現 澄 清 7. 加 入 5ml 的 liquefied phenol 並 混 合 數 次 使 均 勻 8. 加 入 5ml 的 chloroform 並 混 合 數 次 使 均 勻 9. 將 混 合 液 以 6000rpm, 室 溫 離 心 5~10 分 鐘 10. 倒 掉 上 清 液, 加 入 10ml 的 chloroform 混 勻, 此 步 驟 重 複 兩 次 11. 加 至 EtOH 中 使 DNA 沉 澱, 用 乾 淨 的 玻 棒 將 DNA 取 出, 待 其 乾 燥 12. 將 取 出 的 DNA 溶 於 5~10ml 的 TE Buffer 中 DNA 濃 度 測 定 1. 在 測 定 前 30 分 鐘, 將 UV 分 光 光 譜 儀 (UV Spectrophotoneter) 啟 動 暖 機, 待 燈 光 固 定 後 再 行 測 量 2. 以 無 菌 水 500μl 注 入 石 英 比 色 管 歸 零 校 正 3. 以 無 菌 水 將 試 樣 稀 釋 20 倍 後, 取 500μl 進 行 測 定,Vis260nm 的 讀 值 即 代 表 中 的 DNA 濃 度 μg/μl 質 粒 DNA 之 抽 取 1. 將 含 質 粒 的 菌 養 在 適 宜 的 液 態 培 養 基 含 選 定 的 抗 生 素 中, 體 積 約 1~5ml, 做 隔 夜 培 養 約 12~16 小 時 2. 離 心 1~2 分 鐘, 用 water pump 抽 掉 上 清 液, 僅 留 下 菌 體 3. 加 入 250μl 的 MX1 Buffer, 混 合 均 勻 4. 加 入 250μl 的 MX2 Buffer, 輕 輕 的 搖 晃 約 4~6 次 使 其 均 勻 的 作 用 直 到 混 合 液 呈 現 澄 清 5. 在 室 溫 下 放 置 1~5 分 鐘 - 6 -

8 6. 加 入 350μl 的 MX3 Buffer 後 立 即 混 勻 7. 離 心 5~10 分 鐘, 將 混 合 液 取 到 Mini-M TM Column 中 8. 離 心 0.5~1 分 鐘, 倒 掉 Column 之 濾 液 9. 加 入 0.5 ml 的 WF Buffer, 離 心 0.5~1 分 鐘 後 倒 掉 濾 液 10. 加 入 0.7 ml 的 WS Buffer, 離 心 0.5~1 分 鐘 後 倒 掉 濾 液 再 離 心 3 分 鐘 使 其 完 全 濾 淨 11. 將 column 置 入 ependorf 中, 在 column 的 濾 膜 上 加 50μl 的 Elution Buffer 12. 靜 置 1~2 分 鐘 待 其 作 用 後, 離 心 1~2 分 鐘, 所 得 濾 液 即 為 欲 取 得 之 質 粒 DNA DNA 黏 合 反 應 1. 將 6μl 純 化 好 的 DNA 片 段 與 2μl 適 當 的 載 體 ( 以 相 同 限 制 酶 處 理 或 是 可 相 互 黏 合 的 限 制 片 段, 如 :Sau3A 對 BanH1) 充 分 混 合 均 勻 2. 加 入 1μl 的 10x ligation buffer 1μl 的 T4 DNA ligase(1 Unit), 在 14 中 作 用 16 小 時 ( 視 DNA 濃 度 而 定 ) 以 上 大 腸 桿 菌 E. coli 菌 株 之 電 導 轉 型 1. 將 competent cell 緩 緩 解 凍 2. 取 1 ~ 2μl DNA, 加 入 至 裝 有 40μlcompetent cell 之 microfuge tube 中, 溫 和 地 混 勻 後 置 於 冰 上 約 1 min 3. 將 電 導 器 electroporator Gene Pulser II apparatus, Bio-Rad cat 設 定 電 容 為 25μFD 電 壓 為 2.5kV, 控 制 器 Pulse Controller 設 定 電 阻 為 200Ω 4. 將 細 胞 和 DNA 混 液 放 入 預 冷 之 0.2cm 電 導 沖 槽, 並 振 盪 使 之 落 入 沖 槽 底 部 5. 將 沖 槽 置 入 電 導 器 中 6. 讓 電 導 沖 槽 通 電 通 電 時 間 約 為 4.5sec 後, 立 刻 加 入 1 ml SOB 培 養 液, 將 菌 液 懸 浮 7. 把 菌 液 換 入 17X 100mm PP- 塑 膠 管 中, 置 於 37 下 以 225 rpm 振 盪 培 養 1 hr 8. 把 菌 液 作 適 當 稀 釋 塗 於 篩 選 培 養 基 上, 觀 察 是 否 轉 殖 成 功 轉 殖 成 功 者 因 帶 有 抗 抗 生 素 的 基 因 而 可 以 產 生 菌 落 菌 種 鑑 定 1. 預 先 接 種 30ml 菌 液 做 隔 夜 培 養, 之 後 以 適 當 方 式 抽 取 DNA 2. 將 抽 出 之 DNA 以 PCR 的 方 式 放 大 PCR 的 進 行, 依 下 表 一 的 比 例 添 加 反 應 試 劑, 再 依 下 表 二 的 加 溫 程 式 在 PCR machine 中 反 應, 使 用 之 引 子 則 分 別 為 primer 27f ( 序 列 為 5 -AGA GTT TGA TCC TGG CTG AG-3 ) 和 primer 1522r ( 序 列 為 5 -AAG GAG GTG ATC CA(AG) CCG CA-3 ) - 7 -

9 表 一 PCR 反 應 試 劑 Compound Original concentration Final concentration DNA sample - 3μl Primer 1522r 2µM 0.2μM Primer 27f 2µM 0.2μM Taq DNA polymerase 5U/50μl 2.5U/50μl 10x reaction buffer μl dntp mixture 2400µM 240μM d.d water μl Total volume - 50μl 表 二 PCR 之 加 溫 程 式 Procedure Temperature Reaction time Cycle (minute ) Initial denaturation Denaturation Annealing Extending Final extending 將 所 得 樣 本 送 去 定 序, 再 以 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Standard nucleotide-nucleotide BLAST[blastn] 進 行 比 對 - 8 -

10 三 研 究 結 果 與 討 論 ( 一 ) 研 究 結 果 微 生 物 學 方 面 1. 由 生 長 曲 線 的 繪 製 結 果 中, 我 們 可 計 算 出 該 菌 種 之 最 適 生 長 溫 度, 其 中 以 在 45 時, 增 倍 時 間 doubling time 為 21 分 鐘 最 短, 故 以 45 為 最 適 生 長 溫 度 The Growth Curve in Different Temperatures 10 cell mass(according to absorbance) C 40.C 45.C 50.C 55.C time(min) 圖 一 WLA12 的 生 長 曲 線 由 圖 中 可 知 其 在 45 時 的 生 長 速 度 最 快 由 斜 率 2. 需 氧 程 度 檢 測 的 方 面, 由 試 管 培 養 結 果 可 知 其 為 一 好 氧 菌 生 物 化 學 方 面 1. 蛋 白 質 水 解 酶 的 活 性, 在 菌 落 檢 測 法 和 SDS-PAGE 檢 測 中 都 可 以 看 到 明 顯 的 水 解 圈, 且 在 很 短 的 時 間 內 就 有 很 明 顯 的 活 性 表 現 菌 落 檢 測 中 overnight 可 水 解 2/3 的 基 質, 可 見 該 菌 種 生 產 的 蛋 白 酶 活 性 很 強 由 SDS-PAGE 檢 測 可 看 到 兩 個 活 性 帶, 蛋 白 - 9 -

11 質 大 小 分 別 為 130kD 與 30kD 圖 二 蛋 白 酶 的 菌 落 檢 測 由 上 而 下 分 別 劃 有 WLA12 實 驗 組 E. coli 對 照 組, 可 看 出 WLA12 的 活 性 很 強, 但 E.coli 卻 沒 有 活 性 圖 三 蛋 白 酶 的 SDS-PAGE 檢 測 圖 中 1 2 為 菌 液 離 心 之 上 清 液,3 4 5 為 菌 體 懸 浮 液, 可 看 到 酵 素 活 性 帶, 另 外, 該 酵 素 應 為 分 泌 型 因 上 清 液 中 含 量 較 多 2. CMC 水 解 酶 的 活 性 可 在 兩 種 檢 測 中 明 顯 表 現, 由 SDS-PAGE 檢 測 中 可 觀 察 到 兩 個 有 活 性 的 酵 素 蛋 白 質 片 段, 其 大 小 約 為 34kD 和 50kD 圖 四 CMCase 的 菌 落 檢 測 由 上 而 下 分 別 劃 有 WLA12 實 驗 組 BL11 實 驗 室 的 另 一 菌 種, 與 本 實 驗 無 關 E. coli 對 照 組, 可 看 出 WLA12 的 活 性 很 強, 但 E.coli 卻 沒 有 活 性 圖 五 CMCase 的 SDS-PAGE 檢 測 由 圖 中 可 看 到 兩 個 活 性 帶, 大 小 約 為 50kD 和 34kD 圖 中 標 示 之 時 間 為 回 復 活 性 的 時 間 即 浸 泡 緩 衝 溶 液 的 時 間

12 3. Xylan 水 解 酶 的 活 性 在 兩 種 檢 測 中 皆 有 表 現, 但 沒 有 CMCase 明 顯, 由 SDS-PAGE 檢 測 中 可 觀 察 到 一 個 活 性 位 置, 其 酵 素 蛋 白 質 大 小 約 為 18kD 圖 六 Xylanase 的 菌 落 檢 測 由 上 而 下 分 別 劃 有 WLA12 實 驗 組 BL11 實 驗 室 的 另 一 菌 種, 與 本 實 驗 無 關 E. coli 對 照 組, 可 看 出 WLA12 有 活 性 表 現, 但 E.coli 卻 沒 有 活 性 圖 七 Xylanase 的 SDS-PAGE 檢 測 由 圖 中 可 看 到 一 個 活 性 帶, 大 小 約 為 18kD 4. Pectin 水 解 酶 的 活 性 在 菌 落 檢 測 法 中 表 現 很 明 顯, 但 在 電 泳 檢 測 中 卻 無 明 顯 結 果, 可 能 因 活 性 回 復 的 時 間 不 夠 或 使 用 染 劑 不 當 圖 八 Pectinase 的 菌 落 檢 測 由 上 而 下 分 別 劃 有 WLA12 實 驗 組 BL11 實 驗 室 的 另 一 菌 種, 與 本 實 驗 無 關 E. coli 對 照 組, 可 看 出 WLA12 的 活 性 很 強, 但 E.coli 卻 沒 有 活 性 圖 九 Pectinase 的 SDS-PAGE 檢 測 圖 中 看 不 出 明 顯 結 果, 可 能 是 回 復 時 間 不 夠 或 使 用 染 劑 不 當 所 致 圖 中 標 示 時 間 為 回 復 時 間

13 分 子 生 物 學 方 面 1. 菌 種 鑑 定 的 部 分, 目 前 已 確 定 該 菌 為 Bacillus subtilis 2. 基 因 轉 殖 方 面, 目 前 已 獲 得 幾 個 轉 殖 株, 其 活 性 表 現 尚 待 進 一 步 實 驗 ( 二 ) 討 論 1. 實 驗 菌 種 的 純 化 本 實 驗 是 於 九 十 一 年 七 月, 在 台 北 縣 南 勢 溪 下 游 尋 找 溫 泉 湧 出 口, 共 取 五 個 樣 本 點 約 相 距 100 公 尺 進 行 採 樣, 再 將 樣 本 帶 回 實 驗 室, 用 以 skin milk 為 substrate 的 培 養 基 進 行 初 步 篩 選 篩 選 結 果 中, 只 有 其 中 一 處 所 採 集 到 為 我 們 所 需, 因 此 之 後 的 實 驗 中 所 用 的 菌, 都 是 由 同 一 地 點 取 得 的 單 一 菌 種 培 養 而 得 2. 耐 熱 性 在 實 驗 中, 我 們 發 現 其 最 適 生 長 溫 度 為 45, 而 取 樣 地 點 水 溫 約 為 70, 基 本 上 為 耐 熱 的 菌 種 耐 熱 菌 生 長 溫 度 範 圍 45~65, 耐 熱 但 卻 不 一 定 好 熱 對 照 文 獻 可 知,Bacillus subtilis 可 生 產 內 孢 子, 因 此 對 熱 的 耐 受 力 高 亦 是 可 預 期 的 又, 文 獻 上 指 出 該 菌 種 的 最 高 生 長 溫 度 為 54, 亦 可 解 釋 為 何 實 驗 中 到 55 時 生 長 曲 線 便 呈 現 向 下 的 趨 勢, 但 這 也 引 發 該 菌 究 竟 屬 於 嗜 熱 菌 或 嗜 溫 菌 的 疑 義 嗜 溫 菌 的 生 長 溫 度 可 低 至 15~20, 最 適 生 長 溫 度 可 為 20~45 惟 本 實 驗 是 以 未 知 樣 本 做 篩 檢, 該 取 樣 地 點 的 環 境 完 全 符 合 一 般 文 獻 上 對 嗜 熱 菌 生 活 環 境 特 色 的 描 述, 故 為 典 型 的 嗜 熱 菌 採 樣 點, 實 驗 方 法 上 來 說 是 正 確 的, 誤 取 到 土 壤 菌 的 機 率 亦 低 採 樣 處 溫 泉 湧 出 口 幾 為 人 造 環 境 3. 未 知 菌 基 本 微 生 物 檢 測 本 實 驗 是 由 一 未 知 菌 之 樣 本 著 手, 故 只 能 從 一 些 基 本 的 微 生 物 檢 驗 開 始 著 手, 舉 凡 最 適 生 長 溫 度 之 測 試 需 氧 程 度 檢 測 菌 落 型 態 觀 察 生 產 酵 素 之 能 力 皆 有 進 行 再 與 菌 種 鑑 定 的 結 果 兩 相 比 較, 結 果 相 差 亦 不 遠 以 生 長 曲 線 為 例, 在 本 實 驗 中,40 時 的 增 倍 時 間 約 為 27 分 鐘, 而 在 文 獻 上 看 到 的 數 據 則 為 25.8 分 鐘, 誤 差 率 4.6%, 這 可 能 是 因 為 取 平 均 值 所 造 成 的 誤 差, 亦 可 能 是 因 為 生 活 環 境 的 差 異 所 造 成 的 結 果 4. 酵 素 生 產 能 力 本 實 驗 最 初 目 標, 是 希 望 鎖 定 蛋 白 酶 的 生 產 菌, 但 在 後 來 的 實 驗 過 程 中, 又 對 多 種 基 質 做 了 測 試, 因 此 才 發 現 其 生 產 酵 素 種 類 的 多 樣 性 其 中 多 種 酵 素 如 多 醣 類 水 解 酶, 在 農 業 工 業 上 都 有 很 高 的 利 用 價 值 ; 另 外, 此 種 同 時 具 有 多 種 水 解 酶 的 現 象, 也 值 得 注 意, 由 該 菌 種 的 sequencing 結 果, 可 看 到 與 所 得 之 酵 素 對 應 的 序 列, 而 在 同 一 屬 Bacillus 的 其 他 菌 種 之 基 因 序 列 中, 有 些 亦 帶 有 類 似 的 序 列, 但 表 現 是 否 明 顯 酵 素 活 性 和 生 產 能 力 如 何 則 有 待 進 一 步 研 究 且 探 討 Bacillus subtilis 的 酵 素 生 產 多 能 性 的 文 獻 並 不 常 見, 之 所 以 未 被 提 及 或 發 展 是 否 是 因 環 境 不 同 而 有 不 同 程 度 的 表 現 亦 可 繼 續 探 討 5. 水 解 酵 素 特 性 該 菌 生 產 之 酵 素 蛋 白 酶 纖 維 水 解 酶 應 為 分 泌 型, 即 該 蛋 白 質 來 源 位 於 細 胞 膜 上 而 非 細 菌 體 內 因 為 在 SDS-PAGE 檢 測 中 可 發 現, 以 由 隔 夜 培 養

14 菌 液 中 所 分 離 出 的 上 清 液 和 菌 體 懸 浮 液 做 比 較, 上 清 液 中 的 酵 素 含 量 較 多, 菌 體 中 則 僅 含 微 量 由 文 獻 可 知, 微 生 物 吸 收 養 分 的 方 式 仍 需 要 將 大 分 子 養 分 水 解 成 小 分 子 氮 原 碳 原, 才 易 於 吸 收 以 CMCase 為 例, 該 菌 水 解 酶 打 斷 C1,4 鍵 結, 使 分 解 為 葡 萄 糖, 亦 可 在 文 獻 中 得 到 對 照 圖 十 CMC 的 化 學 結 構 酵 素 打 斷 C1,4 間 的 鍵 結, 使 分 解 為 葡 萄 糖 單 體 6. 細 菌 細 胞 傳 訊 在 實 驗 之 初, 曾 觀 察 該 菌 種 之 酵 素 生 產 是 否 受 到 cell-to-cell communication 的 影 響, 但 經 實 驗 證 明 其 酵 素 生 產 並 未 出 現 因 菌 量 增 加, 相 互 刺 激 而 增 加 產 量 的 情 形, 故 認 為 並 未 受 到 上 述 情 況 的 影 響 7. 酵 素 圖 zymogram 在 進 行 zymogram 酵 素 圖 檢 測 時, 曾 討 論 過 以 下 幾 種 方 式 : (1) 先 依 一 般 方 式 製 備 SDS-PAGE 做 蛋 白 質 電 泳, 並 另 外 製 備 內 含 基 質 的 agarose 待 跑 完 電 泳 後, 再 以 PBS 浸 泡 膠 體 使 蛋 白 質 恢 復 活 性 將 含 基 質 的 agarose 覆 蓋 至 電 泳 膠 體 上 靜 置, 一 段 時 間 後 將 agarose 和 原 電 泳 膠 分 別 染 色, 觀 察 是 否 有 活 性 帶 染 色 後 呈 透 明 處 地 產 生, 若 有 則 與 原 電 泳 膠 相 互 對 照 以 推 知 酵 素 大 小 (2) 同 時 做 兩 片 SDS-PAGE, 其 中 一 片 電 泳 膠 在 製 備 時 就 直 接 加 入 基 質, 另 一 片 則 依 一 般 方 式 配 製 跑 完 電 泳 後, 將 兩 片 電 泳 膠 分 別 染 色, 直 接 將 酵 素 活 性 帶 與 另 一 片 的 蛋 白 質 大 小 做 對 照, 以 推 知 酵 素 大 小 若 為 加 入 基 質 後 可 直 接 觀 察 不 須 染 色 者 如 Skim milk, 則 可 只 跑 一 片 電 泳 電 泳 膠 直 接 加 入 基 質 配 製, 並 使 用 可 直 接 觀 察 的 marker 又, 經 過 實 驗 後 發 現, 採 用 將 基 質 直 接 加 入 電 泳 膠 中 的 方 式, 不 論 直 接 對 照 膠 上 的 marker 或 跟 對 照 組 未 加 基 質 於 電 泳 膠 中 者 做 對 照 來 判 斷 蛋 白 質 大 小, 都 是 較 方 便 省 時 的 方 式

15 四 結 論 與 應 用 本 實 驗 由 一 取 自 台 北 縣 烏 來 南 勢 溪 下 游 之 未 知 溫 泉 樣 本 中, 篩 選 出 一 種 可 生 產 多 種 酵 素 且 具 備 耐 熱 能 力 的 菌 種, 以 採 集 地 暫 稱 WLA12, 經 菌 種 鑑 定 已 知 該 菌 為 Bacillus subtilis 在 實 驗 中, 進 行 了 微 生 物 學 生 物 化 學 和 分 子 生 物 學 三 方 面 的 測 試, 在 微 生 物 方 面, 可 由 實 驗 得 知 WLA12 為 一 好 氧 菌, 已 知 可 耐 高 溫 至 70 o C, 最 適 生 長 溫 度 為 45 o C, 在 該 溫 度 下 菌 生 長 之 doubling-time 為 21 分 鐘, 可 知 其 耐 熱 但 不 一 定 好 熱 生 物 化 學 方 面, 藉 由 不 同 方 式 的 zymogram 酵 素 檢 測, 已 知 WLA12 具 備 skim milk(protein) casein(protein) CMC(cellulose) pectin xylan 等 酵 素 活 性, 其 中 skim milk CMC xylan 的 水 解 酶 在 經 過 蛋 白 質 電 泳 後 仍 可 表 現 其 活 性, 因 此 可 得 知 其 酵 素 的 大 小,Protease 約 為 130kD 和 30kD,CMCase 約 為 50kD 和 34kD,xylanase 則 約 為 18kD 會 有 兩 條 活 性 帶 產 生 的 原 因, 可 能 其 酵 素 為 不 只 一 個 蛋 白 質 所 構 成 分 子 生 物 學 方 面, 除 已 確 定 其 菌 種 外, 在 基 因 轉 殖 的 部 分, 已 得 到 幾 個 轉 殖 株 (clone), 尚 在 對 其 活 性 進 行 確 認 而 此 菌 種 生 產 酵 素 種 類 的 多 樣 性, 若 加 以 發 揮 則 能 有 很 好 的 應 用, 其 中 多 種 酵 素 如 多 醣 類 水 解 酶, 在 農 業 工 業 上 都 有 很 高 的 利 用 價 值 ; 另 外, 此 種 同 時 具 有 多 種 水 解 酶 的 現 象, 也 值 得 注 意

16 五 參 考 文 獻 1. 何 季 庭,2000.9: 土 壤 菌 Bacillus 之 分 離 與 木 聚 糖 水 解 脢 及 纖 維 素 水 解 脢 活 性 分 析 2. 鄧 澤 民, : 脂 脢 活 性 土 壤 菌 Bacillus 之 分 離 鑑 定 與 分 析 3. 柯 勇 : 現 代 微 生 物 學, 藝 軒, Bonnie L. Bassler: Small Talk: Cell-to-Cell Communication in Bacteria 5.Margarita Ajuilera, Mercedes Monteoliva-Sânchez, Antonio Suârez, Victor Guerra, Catherine Lizama, Antonio Bennasar,Alberto Ramos-Cormenzana: Paenibacillus jamilae sp. nov., an exopolysaccharide-producing bacterium able to grow in olive-mill wastewater 6.Marilyn S. Lantz, Pawel Ciborowski: Zymographic Techniques for Detection and Characterization of Microbial Proteases 7.Philipp P. Bosshard, Reinhard Zbinden, Martin Altwegg: Paenibacillus turicensis sp. nov., a novel bacterium barbouring heterogeneities between 16S rdna genes 8.S. Pajmohan, C.E.R. Dodd, W.M. Waites: Enzymes from isolates of Pseudomonas fluorescens involved in food spoilage 9.Xiaodong Zhang,Favienne Beuron,Paul S. Freemont: Machinery of protein folding and unfolding 10.Arabinoxylan, 11.Carboxymethylcellulose, 12.Casein Micelle Structure,

17 六 附 錄 ( 一 ) 實 驗 材 料 之 配 製 1. LA 之 配 製 固 態 培 養 基 LA, 用 於 細 菌 之 培 養 Tryptone peptone Yeast extract NaCl Bacto-agar (substrate) 10 g/l 5 g/l 5 g/l 15 g/l (hard agar) 7.5 g/l (soft agar) 2. Sample Buffer 之 配 製 sample buffer 用 於 Zymogram 之 樣 本 製 備 [Working Buffer] 5x Tris (ph6.8) 250 Mm 2-Mercaptoethanol 12.5% SDS 10% Bromophenol 0.5% Glycerol 50% 3. SDS PAGE gel 之 配 製 參 考 Molecular Coning 下 層 膠 10% 5 ml H2O 1.9 ml 30% acylamide mix 1.7 ml 1.5M Tris (ph8.8) 1.3 ml 10% SDS 0.05 ml 10% ammonium persulfate 0.05 ml TEMED ml [substrate ] ml 上 層 膠 2 ml H2O 1.4 ml 30% acylamide mix 0.33 ml 1.5M Tris (ph6.8) 0.25 ml 10% SDS 0.02 ml 10% ammonium persulfate 0.02 ml TEMED 0.02 ml

18 ( 二 ) 生 長 曲 線 測 定 數 值 Time(min) 35.C 40.C 45.C 50.C 55.C Date 註 :Date 為 實 驗 進 行 的 日 期,Time 為 每 次 觀 察 的 時 間 與 開 始 的 時 間 差, 單 位 為 分 鐘 (min);o.d.600 為 分 光 儀 設 定 值, 藉 透 光 率 的 改 變 來 測 定 菌 量

19 ( 二 ) CMC 和 Xylan 的 化 學 結 構 圖 十 一 CMC 和 Xylan 的 結 構 上 圖 為 CMC, 下 圖 為 Xylan, 藍 色 線 圈 起 來 的 地 方 是 可 能 打 斷 的 鍵 結, 以 分 解 成 小 分 子 葡 萄 糖 或 葡 萄 糖 - 果 糖

20 ( 三 ) 載 體 pct

21 ( 四 ) 文 獻 探 討 1. 耐 熱 菌 / 嗜 熱 菌 thermophiles 微 生 物 對 環 境 因 子 的 耐 受 性, 隨 種 類 而 有 所 不 同 而 假 如 一 特 殊 微 生 物 能 夠 在 一 特 別 的 棲 所 生 長 和 繁 殖, 則 該 棲 所 可 能 是 最 適 合 該 微 生 物 生 長 或 含 有 某 些 該 微 生 物 生 長 所 需 的 物 質 一 些 存 在 於 大 部 分 微 生 物 都 無 法 生 長 的 極 端 環 境, 如 高 溫 高 鹽 者, 我 們 稱 之 為 極 端 微 生 物 extreme microoganism, 如 嗜 熱 菌 thermophiles 就 是 其 中 一 種 嗜 熱 菌 包 含 放 射 菌 和 芽 孢 桿 菌 Bacillus 等 好 熱 的 菌 種, 其 廣 泛 分 布 於 火 山 地 地 熱 區 海 底 火 山 附 近 溫 泉 煤 炭 堆 廄 肥 或 溼 熱 的 草 堆 等 地, 而 有 些 人 為 的 高 溫 環 境, 如 熱 水 管 裝 置 和 人 造 熱 源 等 處, 亦 為 其 生 長 的 良 好 環 境 嗜 熱 菌 能 在 溫 度 高 於 55 生 長, 最 低 生 長 溫 度 通 常 在 45 左 右, 而 最 適 生 長 溫 度 在 55~65 ; 一 般 來 說, 其 生 長 溫 度 為 45~65 或 以 上, 其 特 徵 有 代 謝 快 速 觸 反 應 溫 度 高 及 增 代 時 間 doubling time 短 等, 在 農 業 廢 棄 物 處 理 和 工 業 上 都 有 很 高 的 利 用 價 值 與 嗜 溫 性 Mesophiles 比 較, 嗜 溫 菌 之 最 適 生 長 溫 度 為 20~45, 最 低 生 長 溫 度 為 15~20 一 般 土 壤 植 物 溫 血 動 物 及 人 體 中 的 微 生 物 皆 屬 此 類 2. 枯 草 桿 菌 Bacillus subtilis 枯 草 桿 菌 Bacillus subtilis 為 格 蘭 氏 陽 性 菌, 好 氧, 容 易 培 養, 因 能 生 產 內 孢 子 endospore 故 可 在 不 適 宜 的 環 境 中 生 存 其 最 高 生 長 溫 度 約 為 54 芽 孢 桿 菌 屬 Bacillus 的 微 生 物, 其 對 於 溫 度 的 耐 受 性 都 頗 高, 接 近 廣 溫 菌, 如 Bacillus stearothermophilus 的 生 長 溫 度 範 圍 就 從 30 到 75 Bacillus 多 為 土 壤 微 生 物 或 耐 熱 耐 鹼 性 的 微 生 物, 如 蘇 力 菌 (B. thuringiensis ) 枯 草 桿 菌 ( B. subtilis ) 及 名 躁 一 時 的 炭 疽 菌 ( B. anthracis ) 等 3. 微 生 物 的 營 養 與 水 解 酶 之 作 用 形 式 微 生 物 對 養 分 的 吸 收 方 式, 有 簡 易 擴 散 便 利 性 擴 散 主 動 運 輸 基 團 移 位 等 四 種, 其 所 需 的 營 養 物 質 種 類 極 多, 環 境 中 的 眾 多 物 質 皆 可 被 微 生 物 所 利 用 其 中, 生 長 所 需 的 碳 原 和 氮 原 亦 是 不 可 或 缺 的 碳 能 供 給 微 生 物 生 長 時 的 碳 素 或 含 碳 骨 架, 微 生 物 能 利 用 的 碳 原 從 簡 單 的 無 機 含 碳 化 合 物 到 複 雜 的 有 機 含 碳 化 合 物 有 機 碳 化 合 物 都 有, 依 微 生 物 之 種 類 而 定 但 對 於 多 數 異 營 微 生 物, 最 好 的 碳 原 多 為 葡 萄 糖 果 糖 蔗 糖 和 麥 芽 糖 等, 尤 其 是 葡 萄 糖, 其 次 為 有 機 酸 醇 和 脂 肪 酸 氮 是 在 微 生 物 細 胞 中, 需 要 量 僅 次 於 碳 的 物 質 氮 是 構 成 微 生 物 細 胞 組 成 成 分 或 代 謝 產 物 的 原 料, 在 環 境 中 可 被 利 用 的 氮 原 從 分 子 態 氮 到 複 雜 的 有 機 含 氮 化 合 物 都 有, 銨 鹽 無 機 氮 化 物 和 有 機 氮 化 物 為 主 要 氮 原 實 驗 室 及 工 業 生 產 常 用 之 有 機 氮 化 物 有 牛 肉 汁 抽 出 液

22 peptone 尿 素 yeast casein 等, 通 常 須 經 過 水 解 後 才 能 吸 收 利 用 4. 酵 素 圖 Zymogram 酵 素 圖 Zymogram 是 一 種 酵 素 活 性 檢 測 的 方 法, 結 合 了 酵 素 活 性 的 表 現 和 蛋 白 質 分 子 量 大 小 的 量 測,zymogram 是 一 個 較 為 簡 易 的 方 法 以 SDS-PAGE 電 泳 的 方 式, 我 們 可 以 將 樣 本 中 的 各 個 蛋 白 質 分 開, 使 之 依 分 子 量 大 小 做 排 列, 藉 以 得 知 蛋 白 質 的 大 小 而 zymogram 則 是 更 進 一 步, 將 欲 檢 測 知 基 質 加 入 SDS-PAGE 的 電 泳 膠 中, 使 蛋 白 質 酵 素 與 之 直 接 反 應, 則 一 方 面 可 得 知 酵 素 活 性, 一 方 面 可 量 測 蛋 白 質 大 小, 總 而 觀 之 可 得 知 該 酵 素 的 大 小, 在 細 菌 中 更 可 推 出 該 酵 素 所 對 應 之 基 因 序 列 長 度 以 SDS-PAGE 的 方 式 亦 有 其 風 險, 該 酵 素 的 活 性 可 能 因 為 界 面 活 性 劑 SDS 的 作 用, 在 跑 電 泳 時 遭 到 破 壞 此 時 可 利 用 一 些 緩 衝 溶 液 的 作 用, 使 蛋 白 質 的 活 性 回 復 ; 而 在 此 步 驟 中 時 間 亦 扮 演 重 要 角 色, 可 藉 延 長 緩 衝 溶 液 作 用 的 時 間, 使 酵 素 活 性 近 於 原 貌 Zymogram 後 看 到 的 電 泳 膠, 可 在 特 定 大 小 的 地 方 看 到 一 個 明 顯 的 band, 因 基 質 被 水 解 而 呈 現 透 明 貌, 與 周 圍 基 質 經 染 色 後 的 部 分 有 所 對 比 實 驗 中 可 和 同 一 片 電 泳 膠 中 判 別 大 小 的 marker 直 接 做 比 照, 亦 可 將 一 般 的 SDS-PAGE 檢 測 結 果 與 zymogram 結 果 兩 相 比 較, 以 獲 得 較 清 楚 的 結 果 5. 菌 種 鑑 定 :16S rrna 的 遺 傳 鑑 定 微 生 物 的 分 類 與 鑑 定 可 由 許 多 特 徵 或 特 性 著 手, 除 傳 統 的 特 徵 外, 亦 可 由 分 子 的 特 性 來 進 行 分 析 傳 統 的 特 徵 含 : 個 體 型 態 特 徵 形 狀 結 構 染 色 反 應 群 體 型 態 特 徵 菌 落 型 態 顏 色 生 理 特 徵 生 長 條 件 營 養 需 求 生 化 特 徵 代 謝 產 物 生 成 酵 素 生 態 特 徵 呼 吸 類 型 環 境 耐 受 力 抗 原 特 徵 抗 體 反 應 遺 傳 分 析 染 色 體 積 因 互 換 的 研 究 等, 可 根 據 其 做 基 本 的 分 類 而 以 分 子 特 徵 為 依 據 的 分 類, 則 可 由 核 酸 鹼 基 組 成 核 酸 雜 交 和 核 酸 定 序 分 析 Nucleic acid sequencing 進 行 在 細 菌 的 核 糖 體 中 分 離 出 的 rrna 是 研 究 微 生 物 演 化 的 理 想 材 料, 尤 其 是 16S rrna, 因 為 其 一 級 結 構 極 為 保 守 卻 又 同 時 具 有 可 變 區 段, 因 此 適 於 研 究 微 生 物 間 之 親 緣 關 係 ; 其 大 小 約 為 1500bp, 儲 存 的 訊 息 量 大 且 易 分 析, 一 般 的 分 類 學 家 接 受 度 較 高, 是 個 較 客 觀 可 信 度 也 較 高 的 菌 種 鑑 定 方 式

23 評 語 及 建 議 事 項 本 研 究 由 烏 來 溫 泉 附 件 取 得 一 株 抗 熱 性 細 菌, 並 從 其 中 分 析 四 種 水 解 酵 素 分 別 作 進 一 步 的 探 討, 實 驗 設 計 相 當 嚴 謹, 所 得 的 結 果 有 學 術 與 應 用 價 值