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June 物理化学学报 (Wuli Huaxue Xuebao) Acta Phys. Chim. Sin. 202, 28 (6), 50959 509 [Article] doi: 0.3866/PKU.WHXB20203272 www.whxb.pku.edu.cn 人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗剂的构效关系分析 * 乔康曾凌晓金宏威 刘振明 * 张亮仁 ( 北京大学药学院, 天然药物及仿生药物国家重点实验室, 北京 009) 摘要 : 构建人类腺苷受体 A 3 亚型药效团模型和三维蛋白结构模型用于作用模式研究. 以 8 个来源于文献具有腺苷受体 A 3 亚型拮抗活性的化合物作为训练集, 使用 HypoGen 方法构建药效团模型. 通过同源模建和分子动力学模拟构建了人类腺苷受体 A 3 亚型的三维蛋白模型, 并利用 PROCHECK 方法评估该模型的合理性, 对所得的结构使用分子对接程序进行作用模式分析, 药效团模型和同源模建结果相互匹配较好. 使用新药效团模型对 MDL 药物数据库 (MDDR) 中包含的约 20000 个化合物进行虚拟筛选, 得到了 8 个候选化合物, 用于进一步的生物学评价和活性测定. 本工作对于人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗剂的设计和抗哮喘药物的研发具有一定的理论指导和应用价值. 关键词 : 药效团模型 ; 同源模建 ; 分子对接 ; 虚拟筛选 ; 人类腺苷受体 A 3 亚型 ; 拮抗剂 中图分类号 : O64 QSAR Analysis of Human Adenosine A 3 Receptor Antagonists QIAO Kang ZENG LingXiao JIN HongWei * LIU ZhenMing ZHANG LiangRen * (State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 009, P. R. China) Abstract: Ligandbased and receptorbased methods were implemented together to investigate the binding modes of human adenosine A 3 antagonists. First, pharmacophore models were developed using the HypoGen program with a training set of 8 diverse human adenosine A 3 receptor antagonists from literature. Meanwhile, the threedimensional structure of A 3 receptor was modeled by homology modeling and molecular dynamics, and validated by PROCHECK. Molecular docking was conducted further to investigate receptorligand interactions. The pharmacophore model and homology models of A 3 receptor matched well, allowing some important information to be obtained. One of the new pharmacophore models was used to screen the MDL drug database report (MDDR) including about 20000 compounds. As a result, eight candidate compounds that can be used for biological evaluation were discovered. These findings are important for the development and discovery of novel selective A 3 antagonists and antiasthmatic compounds. Key Words: Pharmacophore modeling; Homology modeling; Molecular docking; Virtual screening; Human adenosine A 3 receptor; Antagonists Received: February 22, 202; Revised: March 27, 202; Published on Web: March 27, 202. Corresponding authors. ZHANG LiangRen, Email: liangren@bjmu.edu.cn; Tel: 86082802567. JIN HongWei, Email: jinhw@bjmu.edu.cn; Tel: 8608280554. The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (2097200) and Doctoral Fund of Ministry of Education of China (200900020049). 国家自然科学基金 (2097200) 和教育部博士点基金 (200900020049) 资助项目 C Editorial office of Acta PhysicoChimica Sinica

50 Acta Phys. Chim. Sin. 202 Vol.28 引言腺苷 (adenosine) 作为一种遍布人体细胞的内源性核苷, 参与包括核酸合成 氨基酸代谢 细胞代谢调节在内的多个关键生命步骤, 其生物调控涉及心血管系统 呼吸系统和神经系统等多种疾病. 2 腺苷在生物体内的诸多生理作用都是由其受体介导的, 目前的研究结果已经证实了多种腺苷受体的存在. 3 细胞内生成的腺苷通过扩散或主动转运方式到达胞外, 与腺苷受体 (AR) 结合后发挥其生理作用. 根据受体结合腺苷的能力以及对腺苷环化酶的活性调控作用的不同, 腺苷受体被分成四个亚型 : A, A 2A, A 2B 和 A 3. 4 其中腺苷受体 A 3 亚型 ( 后文简称为 A 3 受体 ) 在纹状体 嗅球 听神经 海马 下丘脑 丘脑和小脑都有较多的分布, 而在皮层与杏仁核中的密度较低. 5 已有研究发现, 激活 A 3 受体能引发肥大细胞脱颗粒状态 并促进释放缩血管物质, 导致脱敏作用和低血压应答, 同时与运动的衰退 受体的脱敏有关 ; 68 因此, A 3 受体拮抗剂在哮喘治疗上具有良好的应用前景. 药物呈现药理作用是与体内生物大分子发生结合作用的结果, 药物分子以特定的三维结构与受体的结合部位相结合, 在三维空间中采取特定构象是呈现药理活性的必要前提 ; 从药物分子的三维特征把握药物与受体的作用, 是药物分子设计和构效关系研究中常用的策略. 药效团模型方法是计算机辅助药物设计中基于配体的一种药物设计方法, 可最大限度地利用已知药物的三维结构信息发现新的活性化合物. 9 本文利用计算机辅助药物设计方法, 构建出能够选择性作用于 A 3 受体的药效团模型, 从受体结构角度予以验证, 并通过虚拟筛选方法发现了一些具有潜在活性的候选化合物. 2 计算方法采用 Accelrys 公司的 Discovery Studio (DS) 进行药效团模型研究, DS 中所用主要模块包括 Clean Geometry( 生成最低能量构象 ), Generate Conformations( 分子多构象模型生成 ), Feature Mapping( 化合物分子特征搜索 ), 3D QSAR Pharmacophore Generation/HypoGen( 构建药效团模型 ), Cluster Pharmacophores( 药效团聚类分析 ), Build/Search 3D Database( 用已知药效团预测化合物活性 ). A 2A 受体 ( 分辨率 0.26 nm, PDB 编号 3EML) 结构数据来源 于 PDB 蛋白晶体结构数据库. 2 A 3 受体的氨基酸序 列来源于 SWISSPROT 数据库 ( 登记号为 P33765). 3 所有蛋白建模 模型优化 动力学模拟计算均在 DELL PowerEdge 2950(Xeon E5402.33G 2, 内存 8.0 G) 计算机工作站完成, 所用程序来自 DS 4 (Accelrys 公司 ) 分子设计软件包和 Gromacs 3.3.3 软件包, 5,6 分子对接使用 GOLD 3.0. 程序. 7 除特殊 说明外, 所有参数均为系统默认值. 2. 训练集化合物的选择 825 将文献报道的具有高选择性 A 3 受体拮抗活 性的化合物组成一个分子集合, 构建所有化合物分 子的化学结构, 使用 DS 中的 Clean Geometry 模块对 每个化合物进行能量优化, 寻找到最低能量的三维 空间结构. 为了能根据得到的药效团模型筛选出具有更 好活性的化合物, 26 我们随机挑选了活性跨度达 4 个 数量级, 且结构尽可能多样的化合物作为训练集, 用于构建药效团模型, 其余化合物为测试集, 用于 评价药效团模型. 2.2 构象分析 考虑到分子在与受体作用时构象的柔性, 同时 为了尽可能覆盖每个分子完整的活性区域, 27 得到 一组在合理的能量范围内有代表性的构象, 能量优 化和产生构象采用 Generate Conformations 模块, 生 成构象的方法为 BEST, 能量间隔为 83.74 kj mol, 最大构象数设定为 250 个. 在体内环境下, 这种能量 差可以通过药物与受体相结合时所产生的分子间 自由能降低得到补偿. 26 2.3 药效团特征 DS 定义的药效特征可表征药物与受体结合所 发生的静电 氢键和疏水作用, 主要有氢键受体 (HBA) 氢键供体 (HBD) 疏水基团 (HYD) 负电荷基 团 (NC) 负电离子化基团 (NI) 正电荷基团 (PC) 正 电离子化基团 (PI) 和芳香环 (RA). 药效团模型中除 包含药效特征元素之外, 还包括特征元素之间的距 离 角度和二面角来定义的空间约束, 其中距离限 制是最为常见的约束形式. 28 搜寻药效团特征采用 Feature Mapping 模块, 输 入配体为经 BEST 方法生成构象后的配体文件, Features 项选择全部由 DS 提供的药效团特征项目. 2.4 药效团模型计算及评价 HypoGen 算法计算药效团模型的计算过程包 括构建相, 排除相, 优化相三个步骤. 通过构建相识

No.6 乔 康等 : 人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗剂的构效关系分析 5 别出可表达活性化合物共有药效特征的模型, 再经 过排除相排除了无活性化合物共有特征的模型, 最 后经优化相进一步优化初始模型, 得到得分最高的 模型. 29 在计算药效团时, 需要提供最多 5 个候选药效 特征. 设定如下药效团特征进行计算 : HBA (5), HBD (5), HYD (5), RA (5) 特征, 括号中为所 设定的药效团特征数. 在产生药效团的过程中采用 了 Catalyst 中参数的缺省设置. 由于训练集化合物 药理活性数据来自不同的文献, 有一定不确定性, 所以活性不确定值 (uncertainty) 设置为. 同时, 我 们对空间布局提出限制条件, 进一步约束药效团的 三维构象. 通过考察不同候选药效团特征对结果的 影响, 结合系统提供的评价方法筛选出较优药效团 模型. DS 利用费用函数 (cost function) 评价药效团模 型, 每个模型都可用此函数表达模型的复杂性 化 学特征与理想权重的偏差以及预测活性与活性实 验数据的误差, 每个模型均有自己的 total cost 值. 计 算结果给出 2 个理想化模型, 其中 个是最好的模 型, 即活性值相关曲线的斜率为, 其 cost 值为 fixed cost 值 ; 个是最差模型, 即活性值相关曲线的斜率 为 0, 其 cost 值为 null cost 值. 当 fixed cost 与 null cost 之间差值 cost>60, 说明该药效团模型在统计学意 义上有 90% 的可能反映了客观的情况, 40< cost< 60 时有 75%90% 的可能反映了客观的情况. 30 根据 Occam 3 的 Razor 原理, 认为最优药效团的 total cost 值最小, 且应接近 fixed cost 值, 小于 null cost 值. configuration cost 是另一个重要的参数, 由模型的空 间复杂程度决定, 较优模型的 configuration cost 值 应不大于 7. 药效团模型的验证 利用我们自己构建的小分子测试库, 根据 top0% 的富集因子 (EF) ROC 曲线下面积 (AUROC) 和命中物质量 (GH) 的计算结果挑选出较 优的药效团模型, 进行模型筛选能力验证. EF 是评价虚拟筛选好坏的一个重要指标, 它是 指在选择的排名前百分之几 ( 例如 0%) 的数据集中 活性分子的浓度与初始活性分子浓度的比值, 可以 用于评价模型的筛选能力, 这个指标用于评价筛选 中筛选出活性分子的阳性率. 富集因子计算公式为 : 32 EF subset = N lig selected/n subset N lig total /N total 其中, N lig selected 指选择的排名前 0% 的分子中活性小分子的数量, N subset 指选择的前 0% 的小分子的数量, N lig total 指整个测试库中活性分子的总数, 为 50, N total 指整个测试库分子的总数, 为 050. ROC(receiver operator characteristic) 曲线描绘的是敏感度 (Se) 和特异性 (Sp) 的关系. AUROC 值指的是 ROC 曲线下的面积. 33,34 这个指标用于测试虚拟筛选策略的优劣, 当被评价的筛选策略都筛选出相同比例的诱饵分子时, 筛选出活性分子的比例越高说明该策略对活性分子的敏感度越高. AUROC 值是以具体数值表示 ROC 曲线下的面积, 该值的区间是 [0, ], 表示筛出 0 个诱饵分子时筛出所有的活性分子, 0 表示筛出全部的诱饵分子中不含有活性分子. 35 命中物质量 GH 值的范围介于 0.0 与.0 之间, 其中, 0.0 代表该药效团模型筛选结果完全没有命中活性分子,.0 代表该药效团筛选结果命中了数据库中全部活性分子, 且未命中任何非活性分子. GH 值越高说明模型的筛选能力越强. 36 选用除去训练集以外的拮抗剂分子组成测试集, 对所构建的药效团模型进行可靠性验证, 使用 Build/Search 3D Database 模块用生成的药效团分别计算测试集化合物的活性数值, 之后以预测活性值为横坐标, 实测活性值为纵坐标绘制线性拟合图, 得到回归曲线, 以相关系数作为评价指标对药效团模型的活性预测能力进行验证. 通过同源模建和分子动力学模拟构建了三维蛋白结构模型, 并利用 PROCHECK 方法评估该模型的合理性, 对所得的结构使用分子对接程序进行作用模式分析, 在完成构建药效团模型和分子对接之后, 我们把药效团模型使用 DS 叠合到分子对接产生的配体构象中, 进而分析药效团特征与对接结果之间的吻合程度. 综合比对得到的药效团模型 蛋白结构模型和分子对接结果, 观察其匹配程度对药效团模型进行进一步验证. 2.6 基于药效团模型的虚拟筛选用药效团模型对取自 MDDR 数据库的约 20000 个化合物进行了虚拟筛选 ( 参数设置 : Limit Hits: All, 其余默认 ), 对所得到的化合物使用 Lipinski 五规则进行了排除 (Pipeline Pilot Professional 软件中的 Lipinski Filter 模块 ), 并通过有机化学知识排除掉认为不合理的化合物.

52 Acta Phys. Chim. Sin. 202 Vol.28 3 结果与讨论 3. 训练集的选择 825 从文献所得的 45 个高选择性 A 3 受体拮抗剂 中, 随机选取 8 个作为训练集 ( 化合物结构式见图 ), 其余 27 个作为测试集 ( 化合物结构式见图 2), 训 练集化合物活性值相差 4 个数量级, 以保证药效团 结果具有显著的统计学意义. 3.2 药效团特征识别 根据 DS 中的 Feature Mapping 模块对化合物的 各种化学功能基团分析, 结果显示 HBA HBD HYD RA 为药效团的基本药效元素, HBA 和 HBD 特征匹配在嘌呤环与酰胺键上, HYD 和 RA 特征匹配在烃链与芳香亲脂基团上. 3.3 药效团计算结果本实验计算结果见表, 训练集计算所得药效团 HypoHypo0, 均包含有 HBA HBD HYD 及 RA 四个药效团特征, 特征数均为, 所得 0 个药效团模型的 total cost 值范围为 82.685.9, fixed cost 值为 72.9, null cost 值为 9.6, cost difference 值为 46.7, configuration cost 值为 4.53, 显示具有较显著 82,23,25 图 应用于训练集的高选择性人类腺苷 A 3 受体拮抗剂化学结构 Fig. Chemical structures of highly selective human adenosine A 3 receptor antagonists for training set 82,23,25

No.6 乔 康等 : 人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗剂的构效关系分析 53 8,2225 图 2 应用于测试集的高选择性人类腺苷 A 3 受体拮抗剂化学结构 Fig.2 Chemical structures of highly selective human adenosine A 3 receptor antagonists for test set 8,2225 的统计学意义. 3.4 药效团筛选能力验证随机抽取 50 个 A 3 受体拮抗剂, 与来自薛定谔网站 (http://www.schrodinger.com) 上的 000 个 decoy 分子组成一个含有 050 个分子的测试库. 采用 DS 中 Build/Search 3D Database 模块, 利用生成的 0 个药效团模型对分子测试库进行活性预测, 选用 EF, AUROC 和 GH 值三个参数来评价其是否合理. 我们希望高活性化合物能够尽可能多地集中 在前 0% 的筛选结果中, 希望 AUC 曲线下面积越大越好, 也希望 GH 值越高, 借此可以选择药效团模型中最优的一个用于后续的药效团模型建立. 将 0 个药效团模型分别与测试库分子进行匹配之后, 得到相关结果如表 2 所示. 利用层次聚类分析方法, 按照药效团相似性的评价, 将 0 个药效团模型分为两类 : 药效团模型 Hypo, 5, 6, 9 为第一类, 药效团模型 Hypo2, 3, 4, 7, 8, 0 为第二类. 从模型的统计评价来看, 第二类

54 Acta Phys. Chim. Sin. 202 Vol.28 表 训练集生成 0 个药效团模型 (Hypo) 的结果分析 Table Results of top 0 pharmacophore hypotheses (Hypo) generated using training set Hypo 2 3 4 5 6 7 8 9 0 HBA a a the number of HBA feature, b the number of HBD feature, c the number of HYD feature, d the number of RA feature, e r: correlation coefficient, f fixed cost: 72.9; null cost: 9.6; cost difference: 46.7; configuration: 4.53, g RMS: the root mean squared error values of all the individual mappings in nm 中的药效团模型比第一类中的药效团模型具有更 好的预测能力. HBD b 其中, Hypo2 的 EF 0 值为 9.4, AUROC 值是 0.988, GH 值是 0.538, 说明它是 0 个药效团模型中 较为合理的, 可用于进一步大规模虚拟筛选和小分 子拮抗剂构效关系研究. HYD c 3.5 训练集化合物的匹配结果 RA d 所得最优药效团模型 Hypo2 具有较好的预测能 r e 0.997 0.954 0.900 0.9059 0.9007 0.8984 0.8954 0.895 0.8946 0.892 Total cost f 82.6 83.0 84. 84.5 84.7 85.0 85.3 85.4 85.6 85.9 RMS g 0.033 0.059 0.093 0.6 0.43 0.55 0.72 0.73 0.76 0.90 力, 其 total cost 值为 83.0, 相关系数 (r) 为 0.954, 偏方差为 0.059. 药效团 Hypo2 三维结构图如图 3 所示, 利用此药效团模型计算训练集化合物的活性值见表 3, 用, 及 来表示训练集化合物活性值大小, 将训练集化合物按活性大小分为高活性 中等活性和低活性三类, 比较训练集化合物活性实测值和计算值, 8 个训练集化合物中有 2 个化合物计算值与实测值活性存在数量级差异, 其余训练集化合物计算值与实测值分类均在相同类. 药效团 Hypo2 与训练集化合物的匹配结果见表 3 中 mapped features 项下, 其中 表示与相应的药效团特征有匹配, 表示未匹配上. 结果显示药效团模型与训练集化合物具有较好的匹配. 36 将编号为 A3037 的化合物与药效团模型进行叠合, 结果非常匹配 ( 四个药效团特征均吻合, 预测 K i= 0.20 nmol L, 实测 K i=0.5 nmol L ). 3.6 药效团可靠性验证为了检测该药效团模型的预测能力, 用训练集以外的 27 个高选择性 A 3 受体拮抗剂作为测试集, 采用与训练集化合物一样的构象优化处理, 采用 DS 中 Build/Search 3D Database 模块, 针对训练集与测试集的所有化合物同时计算药效团 Hypo2 真实活性与预测活性, 得到相应的回归曲线 ( 图 4), 训练集相关系数是 0.68, 测试集相关系数是 0.897. 由此可 Table 2 表 2 药效团模型筛选能力评价 Evaluations of screening ability with pharmarcophore model Hypo 2 3 4 5 6 7 8 9 EF0 AUROC GH 3.8 9.4 9.2 9.2 2.8 2.8 9.0 9.4.6 0.792 0.988 0.982 0.96 0.796 0.438 0.963 0.98 0.577 0.2 0.538 0.526 0.526 0.55 0.55 0.54 0.538 0.088 EF0: enrichment factor of top 0%; AUROC: area under ROC (receiver operator characteristic) curve; GH: goodness of hit 0 9.0 0.975 0.54 图 3 最优药效团模型 Hypo2 Fig.3 The best pharmacophore model Hypo2 distance in nm; distance constraint of Hypo2 (left), ligand (A3037) aligned to Hypo2 (right)

No.6 乔 康等 : 人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗剂的构效关系分析 55 Table 3 表 3 训练集分子与药效团的匹配情况 Matching of compounds of training set with pharmacophore Name A3009 A3037 A304 A3027 A3040 A364 A366 A3057 A3099 A363 A300 A385 A38 A34 A35 A3092 A324 A3072 active 82,23,25 0.4 0.5 0.24 0.27 0.30 0.5 0.65 0.80 0.80 0.90 5 8 8.9 36 57 69.3 98 00 Ki/(nmol L ) estimate 0.37 0.20 0.4 0.24 0.23.7 0.58 0.29 4.62.30 3.36 20.42 0.26 20.79 60.77 22.37 27.55 Uncertainty Active a, Ki 0 nmol L (high active);, 0 nmol L <Ki 90 nmol L (moderately active);, Ki>90 nmol L (low active). b mapped features: means that the compound reveals the corresponding chemical feature, means that the compound lacks the corresponding chemical feature. scale a Estimate scale a HBA Mapped features b HBD HYD RA Fig.4 图 4 药效团模型 Hypo2 实测值与预测值回归曲线 Regression of actual versus predicted activities by pharmacophore model Hypo2 (A) training set; (B) test set 以看出该药效团模型具有较强的预测能力. 27 3.7 A 3 受体与拮抗剂作用模式分析我们对 A 3 受体结构进行了同源模建. 通过 Align Sequence to Templates 程序的序列比对, A 3 受体和 A 2A 受体具有较高的序列相似度 (66.%) 和一致性 (4.4%), 这是以其他 GPCRs 蛋白晶体结构为模板的序列比对达不到的. 根据序列比对的结果, 以 A 2A 受体的蛋白晶体结构为模板蛋白, 采用 DS 中的 Build Homology Models 模块对 A 3 受体模型进行搭建, 而且保留了 A 3 受体在保守残基 CYS83 与 CYS66 之间的二硫键, 选出最优结构进行分子动力学能量优化与修正. 37 我们使用 PROCHECK 程序对模型结构的立 体化学参数进行了评价. 评价结果中主要考察所有 氨基酸残基骨架的二面角分布, 并通过程序生成的 Ramachandran 图来表示. 结果显示模建的蛋白质有 90.2% 的残基落入最佳区域 (the most favored regions), 9.8% 的残基落入其它许可区 (additional allowed regions), 无残基落入勉强许可区 (generously allowed regions) 和不允许区 (disallowed regions). 结

56 Acta Phys. Chim. Sin. 202 Vol.28 图 5 最优药效团模型 Hypo2 和 A 3 受体蛋白与 A3037 配体对接结果的叠合 Fig.5 The best pharmacophore model of Hypo2 mapped to the binding sites of A 3 homology model with ligand (A3037) 果显示 A 3 受体的模建结果是可靠的. 编号 A3037 的小分子配体是高选择性高活性 的 A 3 受体拮抗剂分子, 该分子与 A 3 受体的亲和力 K i 值为 0.5 nmol L, 其选择性表现为该分子与其他 亚型受体的亲和力 K i 值分别为 A : 76 nmol L A 2A: 62 nmol L A 2B: 24 nmol L. 8 因此, 我们研 究了化合物 A3037 号分子与 A 3 受体的相互作用, 选 7 择 GOLD3.0. 程序中的 Goldscore 作为打分函数 进行了分子对接. 我们把药效团模型匹配到分子对接复合物中 来分析受体与配体相互作用, 如图 5 所示. 结果显示 A3037 号小分子的酰胺键中的氮原子与 SER263 SER267 分别有氢键作用, 与氢键给体特征相匹配. 氢键相互作用在生物分子的结构和活性功能上起 着非常重要的作用, A3037 与 A 3 受体共形成两对氢 键, 这也可能是该化合物产生高活性的重要分子基 础. 嘌呤环及其并环杂环与 HIS64 有 ππ 作用, 呋喃 环与 GLY54 有 πσ 作用, 与芳香环特征相匹配. 同 时, 小分子配体与周围疏水性的氨基酸残基通过范 德华力的相互作用也加强了复合物的稳定性, 与疏 水中心相匹配. 因此, 分子对接结果显示的相互作 用模式与药效团特征之间比较吻合. 3.8 基于药效团模型的虚拟筛选 用药效团模型 Hypo2 对 MDDR 类药性化合物 数据库 ( 共约 20000 个化合物 ) 使用药效团筛选 Lipinski 五原则筛选 排除不合理结构后得到了 8 个 候选化合物, 如图 6, 其匹配值 (fit value) 均大于 7( 表 4), 表中 mapped features 项下, 其中 表示与相应 的药效团特征有匹配, 表示未匹配上. 结果显示 8 个候选化合物均与所构建的药效团模型良好匹 配. Fig.6 图 6 虚拟筛选得到的 8 个候选化合物的化学结构 Chemical structures of the 8 candidate compounds from virtual screening

No.6 乔 康等 : 人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗剂的构效关系分析 57 表 4 Table 4 Name A3VS A3VS2 A3VS3 A3VS4 A3VS5 A3VS6 A3VS7 A3VS8 我们研究了化合物 A3VS 与腺苷 A 3 受体的相 7 互作用, 选择 GOLD 3.0. 程序中的 Goldscore 作为 打分函数进行分子对接, 并把药效团模型匹配到分 子对接复合物中来分析受体与配体相互作用, 如图 7 所示. 虚拟筛选的 8 个候选化合物的评分情况 Evaluation of 8 candidate compounds from virtual screening Fit value 7.65 7.58 7.57 7.48 7.45 7.4 7.39 7.39 Molecular weight 337.42 298.34 308.37 294.35 37.20 329.44 297.42 40.39 分子对接结果显示, A3VS 号小分子的侧链氮 原子及羟基氧原子与 SER263 SER267 共形成 5 个 氢键, 与氢键给体特征相匹配, 与来自训练集的 A3037 号小分子 (K i 值为 0.5 nmol L ) 的分子间氢 键作用模式相一致, 且 A3VS 号分子的氢键作用力 更强. 含氮原子并环杂环与 HIS264 形成 2 个 ππ 作 用, 侧链苯环与 LEU82 形成 πσ 作用, 与芳香环特征 相匹配. 同时, 小分子配体与周围疏水性氨基酸残 基通过范德华力的相互作用也加强了复合物的稳 定性, 与疏水中心相匹配. HBA mapped features: means that the compound reveals the corresponding chemical feature, means that the compound lacks the corresponding chemical feature. Mapped features HBD HYD 图 7 最优药效团模型 Hypo2 和腺苷 A 3 受体蛋白与 A3VS 配体对接结果的叠合示意图 Fig.7 The best pharmacophore model of Hypo2 mapped to the binding sites of adenosine A 3 receptor homology model with ligand (A3VS) RA 将 A3VS 与 A3037 两个小分子配体与 A 3 受体 蛋白的作用力模式相互比较可以发现, 二者作用力 模式基本一致, 且 A3VS 比 A3037 的作用模式中多 出三个氢键作用, 因此 A3VS 可能具有较好的 A 3 受 体拮抗活性, 作为候选化合物我们将进行进一步的 生物学评价和活性测定. 3.9 讨论 药效团模型中两个重要药效特征氢键供体和 氢键受体表征配体和受体相互识别的氢键相互作 用, 疏水特征可表征药物非极性区域与受体的非极 性区域之间的疏水相互作用, 芳香环主要参与药物 分子与蛋白受体中 π 电子离域系统相互作用, 药效 团中芳香环特征表征这一作用. 36 本研究利用 DS 软件构建 A 3 受体拮抗剂药效团 模型, 所得较优药效团模型含有四个药效团特征, 包括 个氢键受体和 个氢键供体, 个疏水基团和 个芳香环. 氢键受体和氢键供体特征匹配在嘌呤 环与酰胺键上, 疏水基团和芳香环特征匹配在烃链 与芳香亲脂基团上. 同时, 我们对空间布局提出限 制条件, 进一步约束药效团的三维构象. 38 Manetti 等提出了 A 受体包含两个氢键受体 一个氢键给体, 三个疏水区的药效团模型. 本研究 得到的 A 3 受体药效团模型与 A 受体药效团的区别 在于芳香环结构特征. 39 魏静研究认为, 黄嘌呤 A 2A 药效团模型包括两 个氢键受体 两个疏水作用和两个芳香环 ; 非黄嘌 呤 A 2A 药效团模型含有一个疏水作用 一个正离子 中心和两个氢键受体, 正离子中心是区分 A 2B 拮抗 剂的特异性药效团. 本研究得到的 A 3 受体药效团模 型与 A 2A 受体药效团的区别在于氢键供体. 40 Cheng 等提出的 A 2B 药效团模型包含一个氢键 受体, 两个芳香环, 一个疏水基团, 在 A 2B 受体上的 ASN254 残基与氢键形成作用相关, HIS25 和 TRP247 残基表现出与 A 2B 拮抗剂的疏水力作用. 本 研究得到的 A 3 受体药效团模型与 A 2B 受体药效团的 区别在于氢键供体. 由此可以体现出 A 3 受体药效团 选择性作用于腺苷受体不同亚型的结构特征. 4 Tafi 等研究认为, A 3 受体药效团模型由一个氢 39 键受体 三个氢键给体和一个芳香环组成. 魏静研 究认为 A 3 药效团模型由一个疏水基团 一个芳香 环 三个氢键受体组成, 芳香环周围有潜在空间位 阻. 本研究得到的 A 3 受体药效团模型的区别在于特 征组成不同, 同时包含他们所探索出的特征类型.

58 Acta Phys. Chim. Sin. 202 Vol.28 训练集化合物选择时以高选择性 结构多样性为原则, 尽可能体现人类腺苷受体 A 3 亚型拮抗作用的化合物母核结构, 但是难免存在结构骨架相对单一的问题. 综合比对得到的药效团模型 蛋白结构模型和分子对接结果, 我们发现 A 3 受体拮抗剂与受体活性位点之间的相互作用形式主要包含氢键相互作用 疏水相互作用 ππ 和 πσ 相互作用, 各药效基团之间均需满足一定的空间限制, 从而产生拮抗 A 3 受体的活性作用. 本研究所得三维药效团模型定义了药效作用特征元素, 并进行了虚拟筛选, 预测数据库中化合物活性, 可用于寻找具有潜在活性的化合物. 4 结论使用文献中报道的 A 3 受体高选择性拮抗剂构建药效团模型, 并对其进行验证. 通过同源模建和分子动力学方法构建 A 3 受体的三维结构, 对所得的结构使用分子对接方法进行作用模式分析. 用构建的药效团模型虚拟筛选得到候选化合物, 为进一步潜在活性分子的结构优化提供理论依据. Supporting Information Available: Sequence alignment, homology modeling result, and Ramachandran plot have been included. This information is available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn. References () Stone, T. W. Purines: Pharmacology and Physiological Roles; MacMillan: London, 985. (2) Li, S. Y. Adenosine: a Procursor of Atp, with Cytoprotective and Cytotoxic Effects. Ph. D. Dissertation, Guangzhou Medical University, Guangdong, 200. [ 李舒珏. 腺苷的细胞保护和细胞毒性作用 [D]. 广东 : 广州医学院, 200.] (3) Ralevic, V.; Burnstock, G. Pharmacol. Rev. 998, 50, 43. (4) Fredholm, B. B.; Ijzerman, A. P.; Jacobson, K. A.; Linden, J.; Müller, C. E. Pharmacol. Rev. 200, 53, 527. (5) Dixon, A. K.; Gubitz, A. K.; Sirinathsinghji, D. J.; Richardson, P. J.; Freeman, T. C. Br. J. Pharmacol. 996, 8, 46. (6) Ramkumar, V.; Nie, Z.; Rybak, L. P. Trends Pharmacol. Sci. 995, 6, 283. (7) Carruthers, A. M.; Fozard, J. R. Eur. J. Pharmacol. 993, 250, 85. (8) Ferre, S.; Fredholm, B. B.; Morelli, M.; Popoli, P.; Fuxe, K. Trends Neurosci. 997, 20, 482. (9) Xu, X. J.; Hou, T. J.; Qiao, X. B.; Zhang, W. ComputerAided Drug Molecular Design; Chemical Industry Press: Beijing, 2004; pp 295300. [ 徐筱杰, 侯廷军, 乔学斌, 章威. 计算机辅助药物分子设计. 北京 : 化学工业出版社, 2004: 295300.] (0) Guo, Z. R. Drug Molecular Design; Science Press: Beijing, 2005; pp 372373. [ 郭宗儒. 药物分子设计. 北京 : 科学出版社, 2005: 372373.] () Osman, F. G. Pharmacophore Perception, Development, and Use in Drug Design; International University Line: La Jolla, 2000; pp 89. (2) PROTEIN DATA BANK. http://www.rcsb.org (accessed Mar. 26, 202). (3) Expasy Bioinformatics Resource Portal. http://expasy.org/sprot/ (accessed Mar. 26, 202). (4) Discovery Studio Software. Version ; San Diego: Accelrys. Inc., 2009. (5) Berendsen, H. J. C.; van der Spoel, D.; van Drunen, R. Comp. Phys. Commun. 995, 9, 43. (6) Lindahl, E.; Hess, B.; van der Spoel, D. J. Mol. Model. 200, 7, 306. (7) Jones, G.; Willett, P.; Glen, R. C.; Leach, A. R.; Taylor, R. J. Mol. Biol. 997, 267, 727. (8) Baraldi, P. G.; Cacciari, B.; Moro, S.; Spalluto, G.; Pastorin, G.; Da Ros, T.; Klotz, K. N.; Varani, K.; Gessi, S.; Borea, P. A. J. Med. Chem. 2002, 45, 770. (9) Borghini, A.; Pietra, D.; Domenichelli, P.; Bianucci, A. M. Bioorg. Med. Chem. 2005, 3, 5330. (20) Baraldi, P. G.; Preti, D.; Tabrizi, M. A.; Romagnoli, R.; Saponaro, G.; Baraldi, S.; Botta, M.; Bernardini, C.; Tafi, A.; Tuccinardi, T.; Martinelli, A.; Varani, K.; Borea, P. A. Bioorg. Med. Chem. 2008, 6, 028. (2) Baraldi, P. G.; Preti, D.; Tabrizi, M. A.; Fruttarolo, F.; Romagnoli, R.; Zaid, N. A.; Moorman, A. R.; Merighi, S.; Varani, K.; Borea, P. A. J. Med. Chem. 2005, 48, 4697. (22) Melman, A.; Wang, B.; Joshi, B. V.; Gao, Z. G.; Castro, S.; Heller, C. L.; Kim, S. K.; Jeong, L. S.; Jacobson, K. A. Bioorg. Med. Chem. 2008, 6, 8546. (23) Okamura, T.; Kurogi, Y.; Nishikawa, H.; Hashimoto, K.; Fujiwara, H.; Nagao, Y. J. Med. Chem. 2002, 45, 3703. (24) Baraldi, P. G.; Tabrizi, M. A.; Preti, D.; Bovero, A.; Fruttarolo, F.; Romagnoli, R.; Zaid, N. A.; Moorman, A. R.; Varani, K.; Borea, P. A. J. Med. Chem. 2005, 48, 500. (25) Baraldi, P. G.; Borea, P. A. Trends Pharmacol. Sci. 2000, 2, 456. (26) Chen, X.; Liu, X. X.; Huang, H.; Hu, H. H.; Jiang, F. C. Acta Phys. Chim. Sin. 2008, 24, 28. [ 陈曦, 刘心霞, 黄慧, 胡慧慧, 姜凤超. 物理化学学报, 2008, 24, 28.] (27) Huang, W. H.; Hu, C. Q.; Liao, Y.; Sheng, R.; Hu, Y. Z. Acta Chim. Sin. 2008, 66, 889. [ 黄文海, 胡纯琦, 廖勇, 盛荣, 胡永洲. 化学学报, 2008, 66, 889.] (28) Bao, H. J.; Tang, Y. L.; Xu, X. J.; Xiang, J. F.; Zheng, Z. H.; Lu, X. H. Chem. J. Chin. Univ. 200, 3, 938. [ 鲍红娟, 唐亚林, 徐筱杰, 向俊峰, 郑智慧, 路新华. 高等学校化学学报, 200,

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