使用安捷伦 646 三重串联四极杆液质联用仪对春黄菊和生姜提取物中的农药残留进行定性和定量分析 应用报告 作者 Thomas Glauner 安捷伦科技公司 Waldbronn,BW 德国 Tiffany Payne 安捷伦科技公司 Santa Clara,CA 美国 Guenther Kempe, Stefan Kittlaus, Daniela Goermer State Laboratory for Health and Veterinary Affairs Saxonia, Pesticide Department Dresden, Germany 摘要本应用报告介绍了触发多反应监测模式 (tmrm) 用于春黄菊和生姜提取物中农药残留的检测 所有的分析均采用 Agilent 9 液相色谱 /646 三重串联四极杆质谱仪进行, 采集模式是触发式多反应监测模式 (tmrm) 对两个假阳性结果的例子进行了探讨和分析 : 春黄菊中的丁噻隆和生姜中的吡螨胺 一次分析就可以对这两个化合物进行定量分析, 同时通过谱库匹配进行化合物的确认 通过 tmrm 采集模式和谱库匹配的方法避免了假阳性结果
前言目前用于农药分析的多残留检测方法通常都可以覆盖几百种不同化学类别的化合物 同样的方法一般还可以适用于不同的基质 通常此类分析采用快速扫描仪器 - 一般为三重串联四极杆质谱 - 对于每一个组分, 一般选择两个 MRM 离子 ( 一个用于定量, 另一个用于确认 ) 在欧洲, 食品中的农药检测是按照欧盟法规 (EC) No 96/5 进行的, 它的附录列出了不同产品中农药残留的最大限量 截至到 8 年 月 号, 欧盟对 7 种不同基质中的不同农药定义了最大残留限量 (MRL) 欧盟指南 SANCO/684/9 设定了食品和饲料中农残分析的方法确认和质量控制步骤 对于三重串联四极杆液质分析, 化合物鉴定的指标参数包括保留时间, 质荷比 (m/z) 和峰度值 除此之外, 每个检测组分的保留时间偏差不能超过.5% 对于具有 个或更多子离子的多反应监测, 根据其与基峰的相对强度不同, 离子比例的一致性也应处于 ±% 到 5% 之内 在本文中, 使用安捷伦 646 三重串联四极杆液质联用仪和 tmrm 模式分析 5 种农药残留 我们还重点对过去被报告为假阳性的两个农药进行了分析 : 丁噻隆 ( 一种近来被报道的用于春黄菊的广谱除草剂 ), 和吡螨胺 ( 一个吡唑类杀螨剂和杀虫剂, 在生姜样品中被报道过假阳性 ) 在应用方法的条件下, 这两个农药体现了两个常见的分析情况 丁噻隆与样品基质中相邻内源干扰物很好地分离, 其中两个主要的 MRM 离子比例相近 吡螨胺与生姜基质中干扰物共流出, 它们具有相同的定量 MRM 离子 在传统的 MRM 模式下, 基质中内源性干扰物将会导致假阳性结果 然而,tMRM 采用八个额外的子离子进行干扰匹配将吡螨胺与生姜中的内源性干扰物区分开 除了丁噻隆的保留时间可能受到样品基质的影响之外,tMRM 分析能够将丁噻隆与基质干扰峰彻底区分开, 这将大大提高样品分析的准确性 tmrm 的功能强大, 一次分析就能提供定量和定性的结果 tmrm 分析从对每一个化合物进行主要 MRM 扫描开始, 覆盖所有可能的目标分析物 当某个化合物的主要 MRM 离子信号达到设定阈值时, 二级离子采集会自动启动 在 tmrm 模式下, 每个组分最多可以设置 个 MRM, 这 个 MRM 包括主要 MRM 和任意组合的二级 MRM( 一个主要 MRM 和九个二级 MRM 两个主要 MRM 和八个二级 MRM 等 ) 这种采集模式在主要 MRM 扫描阶段, 将所有可能的目标待测物的离子驻留时间最大化, 然后采集足够 MRM 数据以生成谱图 生成的子离子谱可以用于谱图检索, 因此 tmrm 分析可以同时获得定量结果和用于化合物确认检索的谱图 通过使用优化的碰撞能量和离子驻留时间,tMRM 的灵敏度远远高于传统的子离子扫描模式下的灵敏度
实验部分样品前处理样品前处理完全根据 64LFGB QuEChERS 进行, 没有进行任何修改 克匀浆后的生姜用 毫升乙腈提取 对于春黄菊, 样品量减至 克, 样品在提取之前, 用 毫升水稀释 加入硫酸镁 氯化钠和柠檬酸钠, 然后在 转下离心 5 分钟 采用分散固相萃取进行样品的净化 6 毫升的上清液转移至已经装有 9 毫克硫酸镁和 5 毫克 PSA 的分散 SPE 管中 对于春黄菊, 还加入 45 毫克石墨化碳黑 离心之后,5 毫升的上清液中加入 5 微升 5% 甲酸的乙腈溶液 液质分析仪器 Agilent 9 Infinity 液相色谱 /646 三重串联四极杆质谱仪 ( 图 ) 液相色谱分析条件表 为用于生姜和春黄菊中农残分析的液相色谱的分析条件质谱条件表 为质谱分析参数 图. 安捷伦 9 液相色谱系统和 646 三重串联四极杆质谱系统 表. 液相色谱分析条件 液相色谱柱 ZORBAX Eclipse Plus C-8 RRHD column x. mm,.8 µm 柱温 C 流动相 A = 5 mm 甲酸铵水溶液 B = 5 mm 甲酸铵甲醇溶液 梯度条件 5% B 维持. min; 后在. min 的时间内 B 由 5% 提升至 %; 后在 8. min 的时间 内提升至 %; 维持.5 min; 后再降至 5% 维持 min 流速.5 ml/min 进样体积 µl 表. 质谱条件 离子化模式 安捷伦喷射流离子聚焦, 负模式 干燥气温度和流速 7 L/min @ C 雾化气压力 5 psi 鞘流气温度和流速 L/min @ 75 C 喷嘴电压 +/-5 V 毛细管电压 +5/- V 循环时间 5 ms 扫描间延迟.5 ms MRM 总数 9 并行 MRM 的最大数 84 最小离子驻留时间.64 ms 最大离子驻留时间 46.5 ms
结果与讨论上述的液质方法可以分离和检测 5 种农药 tmrm 模式可以允许每个化合物设置 个 MRM 离子, 在本文分析中, 对于每个化合物, 采用两个主要 MRM 和最多七个二级 MRM 离子 图 显示了在最低报告浓度 (MRL) 下所有农药的总离子流图和提取离子流图 为了实现一次进样即可采集定性和定量的信息, 方法采用了 tmrm 功能 第一个目标分析物是春黄菊提取物中的丁噻隆 春黄菊含有与丁噻隆相同保留时间和分子量的内源干扰物 图 显示了两个谱图 : 左边是浓度为 5ppb 的丁噻隆, 右边是春黄菊空白样品提取物 ( 已知空白样品不含丁噻隆 ) 数据显示, 丁噻隆具有很好的峰形和信号, 5 个农药全部可以分离, 没有发现共流出峰 即使干扰物的保留时间 ( 其保留时间和质量与丁噻隆类似 ) 超过了 SANCO 的指导范围, 但是仍然可能会被误判为丁噻隆 x 5 A.4..8.6.4. 4 5 6 7 8 9 x 4 7 B 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) 6 5 4 4 5 6 7 8 9 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) 图. 5 种农药在最低报告浓度 ( ng/ml) 下的总离子流色谱图 (A) 和提取离子流色谱图 (B) x 4 x 4 6.69.5 QC 5 ppb 空白春黄菊提取物 6.65 594 544 保留时间 6.69 min 保留时间 6.65 (+.8%) 定性 / 定量比例.5% 计算浓度.6 μg/kg 定性 / 定量比例 4.7% (89.9%).5 x 5.4..8.6.4. x4 6.69.5 6.6 479 6978.5.5.5 5.9 6 6. 6. 6. 6.4 6.5 6.6 5.9 6 6. 6. 6. 6.4 6.5 6.6 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) 图. 5 ppb 质控标样丁噻隆 ( 左 ) 和空白洋甘菊提取物 ( 右 ) 的主要 MRM 离子流图 上图代表丁噻隆第一个定性离子 (m/z 9. > 6.), 下图代表定量离子 (m/z 9. > 7.) 4
基质中干扰物的保留时间与丁噻隆标准保留时间相差.8%( 最大允许偏差.5%), 定性 / 定量的离子比例 89.9%(SANCO 截取期望值是 %) 而春黄菊提取物中的干扰物与丁噻隆相近, 根据 SANCO 指导标准, 将有可能被判定为假阳性 在这种情况下,tMRM 分析提供了确认的证据证明基质中的内源干扰物是不是丁噻隆, 根据这两个化合物的保留时间差异即可按照 SANCO 指导标准判定正确结果 通过谱库检索,tMRM 分析可以定性地确认春黄菊中的内源干扰物 此外,tMRM 分析可以确认春黄菊中的内源化合物是不是丁噻隆 然而,tMRM 除了可以进行定性分析之外, 还可以获得三重串联四级杆的高性能定量结果, 这一点我们可以利用向空白春黄菊样品中添加丁噻隆的样品进行说明 即使这些化合物彼此间的保留时间非常接近, 以及在相邻化合物都启动二级离子采集, 空白洋甘菊添加丁噻隆样品 的分析获得了很好地线性校正曲线,R 为.9997( 见图 4) 春黄菊样品提取物 ppb 加标的 5 次进样分析的 %RSD=.94 5 个农药的春黄菊样品提取物 ppb 加标的 5 次进样分析的 %RSD 为. 本方法的线性和定量重现性都非常好 x 6 R =.9997.9.8.7 响应.6.5.4... 4 5 6 7 8 9 浓度 (ng/ml) 图 4. 空白春黄菊样品提取物为基质的丁噻隆的校正曲线, 浓度范围为 ppb 到 ppb 线性相关系数 R 为.9997 5
对于生姜提取物中的吡螨胺分析, 即使按照 SANCO 指导标准, 如需避免假阳性结果 tmrm 分析也是至关重要的 图 5 是浓度为 5ppb 质控标准品吡螨胺的主要 MRM 离子 ( 左图 ) 和不含吡螨胺的生姜空白样 ( 右图 ) 的离子流图 在这种情况下, 生姜基质中的内源干扰物 ( 图 5 中右侧图 ) 保留时间与吡螨胺的保留时间的误差只有.47%( 完全符合法规的要求 ) 生姜基质中的内源干扰物的定性 / 定量的比例是吡螨胺的离子比例的.%, 而 SANCO 指南的要求是 % 这个内源干扰物与吡螨胺非常相似, 因此传统的分析方法很容易导致假阳性结果 但是,tMRM 分析利用谱库匹配获得准确的定性结果 9.66 x 4 质控 5 ppb 489 x 4 保留时间 9.66 min 定性 / 定量的比例 89.8 %.5 x 4 9.66 79 x 4 4 9.68 589 9.69 6689 空白生姜提取物保留时间 9.68 min (-.47 %) 计算浓度 85 µg/kg 定性 / 定量的比例.6 % (. %).5 9.45 9.5 9.55 9.6 9.65 9.7 9.75 9.8 9.45 9.5 9.55 9.6 9.65 9.7 9.75 9.8 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) 图 5. 浓度为 5ppb 质控标准品的吡螨胺 ( 左图 ) 和生姜提取物 ( 右图 ) 的主要 MRM 离子流图 上图是吡螨胺的定量离子 (m/z 4. > 7.), 下图是第一个定性离子 (m/z 4. > 45.) 6
图 6 显示生姜样品中内源干扰物与吡螨胺相比具有相似保留时间, 定性离子和定量离子 下面的窗口是谱库中的标准谱图, 上面的窗口是采集的生姜内源干扰物谱图 中间窗口中的谱图是分析所得谱图与谱库中的谱图比较 在使用传统方法时这种共流出物常常导致假阳性结果, 而对于 tmrm 分析, 吡螨胺的很多质谱峰在生姜内源干扰物没有出现 结果, 谱库匹配的分值为 7.4, 满分是, 因此我们可以断定不是吡螨胺 x 8 6 4 9. 7. 45. 采集的 tmrm 谱图生姜中内源性干扰物 x 9. 7. 45. 采集的谱图与谱库中的谱图的比较 76 5. 9.. 7. 4. 4. - 7 45 x 7 45 吡螨胺的 tmrm 谱库的质谱图.5 76 9.. 5. 7. N N 8 4 6 8 4 6 8 4 响应 vs. 采集时间 ( 分钟 ) H C H C CH NH O Cl H C CH 4. 图 6. 生姜中内源干扰物在 tmrm 谱库检索匹配结果, 与吡螨胺的匹配分值是 7.4, 可以判定化合物不是吡螨胺, 所以避免了假阳性结果 7
结论一次进样,tMRM 就可以对春黄菊和生姜提取物中的农药进行准确的定量, 并提供可靠的定性结果 丁噻隆和吡螨胺都能与样品基质中的内源性干扰物区分, 因而避免了假阳性结果 tmrm 采集是一种数据依赖的扫描功能, 一次进样分析, 即可同时提供定量和定性的数据结果 参考文献. Regulation (EC) No 96/5 of the European Parliament and of the Council of February 5 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 9/44/ EEC (including amendments as of 8 March 8).. European Guideline SANCO/684/9: Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed.. Official collection of test procedures according to 64 law on food and animal feed (LFGB), Beuth-Verlag. www.agilent.com/chem/qqq:cn 本应用只用于研究目的, 不可用于诊断 本文中的信息 描述和指标如有更改, 恕不另行通知 安捷伦不对本文可能存在的错误或由于提供 展示或使用本文所造成的间接损失承担任何责任 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 7 月 日中国印刷 599-846CHCN