在早期,β- 受体激动剂类兽药多采用气质联用仪来进行检测, 但采用此方法需要样品衍生后再测定, 且灵敏度有限 近 10 年来, 随着液质联用系统和相关技术的发展 普及, 以及对此类禁用药物越来越苛刻的检出限要求,LC/QQQ 技术已成为动物源性食品中 β- 受体激动剂类兽药残留的主要检测和确证技术手

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1 采用安捷伦三重四极杆液质联用系统对动物源性食品中 β- 受体激动剂类兽药残留进行分析 应用简报 食品检测和农业 作者李建中, 薄涛, 郭启雷, 吴翠玲, 安蓉, 张之旭 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司 摘要 本文采用 Agilent 190 Infinity 液相色谱系统 /6495 三重四极杆液质联用系统, 建立了同时检测动物源性食品中 18 种 β- 受体激动剂类兽药 ( 包括克伦特罗 莱克多巴胺和沙丁胺醇等 ) 的分析方法 该方法在 ng/ml 浓度范围内线性相关性良好, 相关系数 R 0.990; 在添加浓度 0.05 µg/kg 下, 各化合物峰面积稳定性在 0.6%-5.8% 之间 ; 各化合物定量下限均可达到 0.05 µg/kg 通过对方法灵敏度 精密度和线性范围等方法学参数进行考察, 得到所建立的方法能在 15 min 内对动物源性食品中 18 种 β- 受体激动剂类目标化合物完成快速 高灵敏度的检测分析, 完全满足法规监测要求 前言 瘦肉精主要是指肾上腺素类药物, 又称 β- 受体激动剂 (β-agonist), 用于治疗支气管哮喘 慢性支气管炎和肺气肿等疾病 瘦肉精添加在饲料中可以促进动物的快速增长 减少脂肪含量 提高瘦肉率, 但其在肉制品中的残留会对消费者的身体健康造成损害 鉴于 瘦肉精 对消费者的潜在危害性, 农业部 1997 年发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用,001 年和 00 年, 农业部分别下发文件禁止食品动物使用 β- 激动剂类药物作为饲料添加剂 ( 农业部 176 号 193 号公告 35 号公告 560 号公告 1519 号条例 ) [1-3] 近年来, 在畜产品中非法使用瘦肉精的食品安全事件仍然频发, 如双汇瘦肉精事件 浙江毒饲料事件等等 目前各级农产品 食品安全监管部门不断加大监督检查力度, 以确保消费者的健康与安全

2 在早期,β- 受体激动剂类兽药多采用气质联用仪来进行检测, 但采用此方法需要样品衍生后再测定, 且灵敏度有限 近 10 年来, 随着液质联用系统和相关技术的发展 普及, 以及对此类禁用药物越来越苛刻的检出限要求,LC/QQQ 技术已成为动物源性食品中 β- 受体激动剂类兽药残留的主要检测和确证技术手段, 被广泛应用于监督监管中 目前国内检测 β- 受体激动剂类药物的主要参照标准包括 : GB/T 动物源性食品中多种 β- 受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法 农业部 105 号公告 动物源性食品中 β- 受体激动剂残留检测液相色谱 - 串联质谱法 [4-9] 等 由于属于禁用药物, 其检出为 零允许量 (Zero tolerance), 考虑到 LC/QQQ 的检测灵敏度, 克伦特罗最低检出限为 0.05 µg/kg, 其他 β- 受体激动剂检出限为 0.1 µg/kg 针对此类禁用药物严苛的监测需求, 本文采用 Agilent 190 Infinity 液相色谱系统 /6495 三重四极杆液质联用系统, 建立了同时快速检测常见的 18 种 β- 受体激动剂类兽药的可靠定量方法 该方法可以满足动物肌肉 内脏和饲料等动物源性食品中 β- 受体激动剂残留量的检测要求 实验部分 试剂与化学品所有试剂和溶剂均为色谱纯或者分析纯级 甲醇和乙腈购自德国默克 (MERCK) 甲酸和乙酸铵购自美国 Sigma- Aldrich 公司 β- 受体激动剂标准品及同位素内标购自 Dr. Ehrenstorfer( 德国奥格斯堡 ) 所用实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水 仪器配置实验采用 Agilent 190 Infinity 液相色谱系统进行分离, 其由下列部件组成 : 采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 电喷雾离子源和 ifunnel 离子传输聚焦技术的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统, 在正离子模式下进行检测 采用 Agilent MassHunter 工作站软件 (B.07 版本 ) 进行数据采集和分析 标准溶液配置所有 β- 受体激动剂标准品用甲醇配制为浓度 1 mg/ml 的储备液, 储存在 -0 C 冰箱内 ( 有效期 1 年左右 ) 用乙腈: 水 (50:50) 混合溶剂将储备液配制为 10 µg/ml 的混合标准溶液, 储存在 4 C 下 ( 有效期 1 个月左右 ) 使用时, 用乙腈 : 水 (10:90) 混合溶剂将 10 µg/ml 混合标准溶液进行适当逐级稀释, 临用新制 样品前处理称取 g 左右的均质样品 ( 精确至 0.1 g), 依次添加 0 ml 的 0. mol/l 乙酸铵缓冲液和 50 µl 的 units/mg β- 葡萄糖甙酶 / 芳基硫酸酯酶, 混合均匀后,37 C 下反应过夜 (14-16 h), 取出冷却后,5000 r/min 离心 5 min, 移取上层清液, 加 0.1% 高氯酸溶液调节 ph 至 1.0±0.3,5000 r/min 离心 5 min, 再次移取上层清液, 加 10 mol/l NaOH 溶液调节 ph 至 11.0, 依次加入 10 ml 饱和 NaCl 溶液和 10 ml 异丙醇 : 乙酸乙酯 (6:4) 混合溶液, 萃取后离心, 取有机相, 氮气下吹至近干后, 用 5 ml 乙酸铵缓冲液溶解, 待净化 依次用甲醇 水活化 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取 (SPE), 将上述复溶样品溶液全部转移到 SPE 柱上, 依次用 % 甲酸溶液和甲醇淋洗柱子除去基质, 最后用 5% 氨化甲醇洗脱, 收集洗脱液, 氮气吹干后用液相色谱起始流动相溶解, 定容至 1 ml, 过滤或高速离心后待测 Agilent 190 Infinity 二元泵 (G40A) Agilent 190 Infinity 标准自动进样器 (G46A) Agilent 190 Infinity 取样冷却器 (G1330B) Agilent 190 Infinity 柱温箱 (G1316C)

3 液相色谱条件 色谱柱 : Agilent Poroshell 10 EC-C18, 3.0 x 100 mm,.7 µm 柱温 : 40 C 进样量 : µl 自动进样器温度 : 10 C 流动相 : A) 含 0.1% 甲酸和.5 mmol/l 乙酸铵 的水溶液 B) 含 0.1% 甲酸的乙腈 流速 : 0.4 ml/min 梯度程序 : 时间 B% 停止时间 : 13.0 min 后运行时间 :.0 min 质谱条件 离子模式 : 正离子 干燥气温度 : 150 C 干燥气流量 : 15 L/min 鞘气温度 : 350 C 鞘气流量 : 11 L/min 雾化器压力 : 35 psi 毛细管电压 : 500 V 喷嘴电压 : 0 V EMV: 00 V MS 1 和 MS 分辨率 : 单位分辨率 MRM 参数 : 如表 1 所示 表 1. 化合物 MRM 参数列表 化合物 特布他林 (Terbutaline) 齐帕特罗 (Zilpaterol) 沙丁胺醇 (Salbutamol) D3- 沙丁胺醇 (D3-Salbutamol) 西马特罗 (Cimaterol) 西布特罗 (Cimbuterol) 菲诺特罗 (Fenoterol) 莱克多巴胺 (Ractopamine) D5- 莱克多巴胺 (D5-Ractopamine) 克伦普罗 (Clenproperol) 氯丙那林 (Clorprenaline) 妥洛特罗 (Tulobuterol) 克伦特罗 (Clenbuterol) D9- 克伦特罗 (D9-Clenbuterol) 溴布特罗 (Brombuterol) 班布特罗 (Bambuterol) 盐酸克伦潘特 (Clenpenterol) 马布特罗 (Mabuterol) 马喷特罗 (Mapenterol) 普萘洛尔 (Propranolol) 喷布洛尔 (Penbutolol) 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碎裂电压 (V) 碰撞能量 (V) 碰撞池加速器电压 (V) 保留时间 (min)

4 9.84 结果与讨论 如图 1 所示, 采用配有 Poroshell 10 EC-C18 色谱柱 ( 薄壳型填料,3.0 x 100 mm,.7 um) 的安捷伦三重四极杆液质联用系统, 可在 15 min 内对 0.1 ng/ml 混合标准溶液中 18 种 β- 受体激动剂类兽药进行有效分离, 且分离效果及峰形均能满足方法要求 Poroshell 10 EC-C18 色谱柱具有较高柱效 较低柱压和较高载样量等特点, 非常适合分析动物源性样品基质中的多药物残留 流动相中添加了 0.1% 甲酸和.5 mmol/l 乙酸铵, 可以有效促进正模式下的离子化效率 通过 S/N 10, 计算得到 18 种 β- 受体激动剂类兽药的定量下限均可达到 0.05 µg/kg, 完全满足动物源性食品中 β- 受体激动剂类兽药的限量检测要求 x 时间 (min) 图 种 β- 受体激动剂类兽药混合标准溶液 (0.1 ng/ml) 的 MRM 叠加图 6495 三重四极杆液质联用系统可充分满足 β- 受体激动剂类兽药残留检测的要求, 如表 1 所示为各兽药的 MRM 参数列表, 其中给出了碎裂电压参考值 6495 的新型预四极杆离子传输聚焦技术 弯曲锥形碰撞池 以及高能电子倍增管检测器设计, 可以大大提高离子的聚焦传输, 产生更有效的离子碎片和更高的离子 / 电子转化率, 从而大大提高了检测灵敏度 稳定性及抗污染能力 采用本文所述方法在浓度范围 ng/ml 内对 18 种 β- 受体激动剂类兽药的线性相关性进行讨论 结果表明, 所有化合物在此浓度范围内具有良好的线性相关性, 相关系数 R 均大于 0.990, 以克伦特罗为例, 如图 所示 响应值 x y = * x R^ = 浓度 (ng/ml) 图. 克伦特罗标准曲线 ( ng/ml) 在猪肝基质提取液中添加 0.05 µg/kg 浓度的混合标准溶液, 连续进样 6 针, 进行方法稳定性讨论 如图 3 所示, 在低浓度添加水平下 18 种 β- 受体激动剂类兽药的峰面积 RSD 在 0.6%-5.8% 之间, 完全满足测试的稳定性要求 x 时间 (min) 图 µg/kg 添加浓度下连续进样 6 针所得 TIC 叠加色谱图 4

5 对于动物源性食品中 β- 受体激动剂类兽药残留的分析, 需要注意的是内脏类样品需要采用蛋白酶酶解后, 通过液液萃取, 再经阳离子交换固相萃取柱 (PCX) 净化后, 才能进行 LC/QQQ 测定 采用同位素内标添加校正可以提高定量的准确度 对于动物肌肉组织或饲料等样本可以不采用酶解处理, 直接溶剂提取后经 SPE 净化后测试 本文所述方法适用于肌肉组织 内脏 尿液和饲料等样品中 β- 受体激动剂类兽药的测试分析 结论 采用 Agilent 190 Infinity 液相色谱系统 /6495 三重四极杆液质联用系统成功实现了对动物源性食品中多种 β- 受体激动剂类禁用兽药残留的高灵敏 快速 稳定的定量分析 本方法以国内发布的检测标准为依据, 方法学各项参数完全满足或高于标准检测要求, 并可应用于各类动物源性样品基质中 β- 受体激动剂类药物的快速检测 参考文献 1. 中华人民共和国农业部公告第 193 号 : 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单. 中华人民共和国农业部公告 35 号 : 动物性食品中兽药最高残留限量 3. 中华人民共和国农业部公告 560 号 : 兽药地方标准废止目录 4. GB/T 动物源性食品中多种 β- 受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法 5. GB/T 动物源性食品中 β- 受体激动剂残留检测方法液相色谱 - 质谱 / 质谱法 6. 农业部 105 号公告 动物源性食品中 β- 受体激动剂残留检测液相色谱 - 串联质谱法 7. 农业部 109 号公告 饲料中 16 种 β- 受体激动剂的测定液相色谱 - 串联质谱法 8. 农业部 1063 号公告 动物尿液中 11 种 β- 受体激动剂的检测液相色谱 - 串联质谱法 9. SN/T 进出口动物源食品中克伦特罗 莱克多巴胺 沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱 - 质谱 / 质谱法 5

6 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_800@agilent.com 在线询价 : 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本文中的信息 说明和技术指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 08 月 06 日, 中国印刷 CHCN

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