VER:1010 盐析法血液基因组 DNA 提取试剂盒 (GD2516 EZgene TM SQ Blood gdna Kit) 产品组成 成分 GD2516-00 GD2516-01 GD2516-02 GD2516-03 Total Blood Volume 10 ml 50 ml 150 ml 300 ml 4 x Buffer ML* 15 ml 75 ml 225 ml 450 ml Buffer BL 8 ml 40 ml 120 ml 240 ml Proteinase K 520 μl 2 1.3 ml 7.8 ml 15.6 ml Elution Buffer 4 ml 20 ml 60 ml 120 ml RNase A 60 μl 300 μl 1 ml 1.8 ml User Manual 1 1 1 1 贮存条件及产品稳定性 本试剂盒自购买之日起可保存 12 个月 其中蛋白酶 K 贮存在 -20 o C,RNase A 贮存在 4 o C, 其他试剂及用品可保存于室温 (22-25 C) 产品说明 EZgene TM 盐析法血液基因组 DNA 提取试剂盒适用于从各种新鲜 冻存或者抗凝血中纯化 gdna, 同时可用于从白细胞层, 骨髓, 或者细胞株中纯化 gdna 本试剂盒可以在 90 分钟内完成单个或者多个样品的处理, 整个提取过程无需酚氯仿抽提,CsCl 离心等耗时步骤, 操作简单, 纯化到的 DNA 可直接用于后续的 PCR 扩增, 限制性酶切和杂交分析等 本实验仅供科研使用 请勿用于医药 临床治疗 食品及化妆品等用途
实验前需准备的材料 离心机 已灭菌的 1.5 ml 离心管 水浴锅 无水乙醇 异丙醇 不同体积样品 DNA 的收获量 材料来源样品量收获量 人全血 (DNA 收获量会因为白细胞的量而有差别 ) 300 μl 5-15 μg 5 ml 100-300 μg 10 ml 150-600 μg 12 ml 200-700 μg 老鼠血液 300 μl 4 7 μg 细胞株 0.5-1 million cultured cells 10-15 μg 不同体积的样品使用的溶液量 盐析法血液 gdna 提取系统, 可根据试剂样品的量不同, 按照以下标准使用各种缓冲液 : 要点 样品量溶液溶液用量 1 x 1 x Buffer ML 3 x( 可变动 ) 1 x Buffer BL 0.5 x 1 x Proteinase K 0.005 x 1 x RNase A 0.005 x 1 x Isopropanol( 异丙醇 ) 0.5 x 1 x 70% ethanol 1 x 温度较低时,Buffer BL 缓冲液会生成少量沉淀, 使用之前于 37 o C 温浴备 用 Buffer ML 作为一种 4 倍的浓缩液提供, 使用时请用去离子水稀释成单倍后 使用 使用者自备材料 : 微型离心机,14,000 x g 无核酸酶的 1.5 ml 或者 2.0 ml 离心管 65 水浴锅 异丙醇,70% 乙醇 技术支持 :021-54461558 订货电话 :021-54461657
安全信息 Buffer BL 为离液盐, 当与漂白剂作用时会发生化学反应, 勿直接加入漂白剂及酸溶液, 使用时请带上手套并保护眼睛 操作步骤 A. 小量全血 DNA 提取操作步骤 ( 以 300μL 为例 ) 1. 取 300 μl whole blood (or bone marrow) 到一个 1.5mL 或者 2.0mL 离心管中, 加入 900 μl Buffer ML, 颠倒混匀, 室温放置 2 分钟, 期间颠倒混匀几次 提示 :Buffer ML 作为一种 4 倍的浓缩液提供, 使用时请用去离子水稀释成单 倍后使用 2. 室温下,13,000 x g 离心 30 s, 小心吸去上清, 避免吸起沉淀 不必吸干上清, 留下 约 20 μl 液体 如果使用冷冻样品, 沉淀颜色仍然较深, 红细胞仍然可见, 重复步骤 1~2, 直至沉淀显示为白色 提示 : 如果处理一次后红细胞仍然可见, 沉淀颜色较深, 加入 2 倍体积的 Buffer ML, 重悬沉淀, 室温放置 2 分钟, 重复步骤 2, 收集细胞核沉淀 3. 加入 150 μl Buffer BL 和 15 μl Proteinase K, 涡旋, 直至细胞核彻底悬浮 可选 : 需要去除 RNA, 可加入 5 μl RNase A, 混匀 4. 置于 50 温育 20 分钟, 如果此时, 沉淀仍然可见, 将温育时间延长至 15~20 分钟 5. 加入 150 μl 100% 异丙醇, 轻轻颠倒混匀, 沉淀 DNA, 此时将会看见絮状沉淀 6. 室温下,10,000 x g 离心 2 分钟, 此时 DNA 沉淀将会可见 7. 小心弃去上清液, 将离心管倒置于吸水纸上, 吸干残留的液体, 加入 300 μl 70% ethanol 颠倒混匀, 洗涤 DNA 沉淀 室温下,10,000 x g 离心 5 分钟, 此时 DNA 沉淀将 会可见, 小心吸干上清液, 避免吸走沉淀 8. 重复步骤 7 9. 将离心管倒置于吸水纸上, 或者瞬时离心, 用枪头吸干上清液, 空气中放置 10~15 分 钟 Web:www.biomiga.com.cn E-mail:info@biomiga.com.cn
10. 加入 100 μl Elution Buffer 涡旋悬浮沉淀. 11. 65 放置 1 小时溶解 DNA, 某些样品可能需要更长的时间才会溶解 DNA, 比如 1~2 小时 放置很久后, 还是有未溶解的 DNA 沉淀, 可以用枪吸打助溶 12. 将 DNA 保存在 2-8, 长期保存, 置于 -20 ( 如果需要长期保存 DNA, 建议自配 TE 代替 Elution Buffer) B. 中量全血 DNA 提取操作步骤 ( 以 5 ml 为例 ) 1. 取 5 ml whole blood (or bone marrow) 到一个 15 ml 离心管中, 加入 7.5 ml Buffer ML, 颠倒混匀, 室温放置 5 分钟, 期间, 颠倒混匀几次 提示 :Buffer ML 作为一种 4 倍的浓缩液提供, 使用时请用去离子水稀释成单倍后使用 2. 室温下,2000x g 离心 5 分钟, 尽量吸去上清, 避免吸起沉淀, 预留约 350 μl 液体, 如果是使用的冻存样品, 重复步骤 1~2, 直至沉淀呈现白色, 细胞裂解完全 提示 : 如果处理一次后红细胞仍然可见, 沉淀颜色较深, 加入 2 倍体积的 Buffer ML, 重悬细胞沉淀, 室温放置 2 分钟, 重复步骤 2, 收集细胞核沉淀 3. 加入 2.5 ml Buffer BL 和 250 μl Proteinase K, 涡旋, 直至细胞核彻底悬浮 可选 : 如果需要去除 RNA, 加入 25 μl RNase A, 混匀 4. 置于 50 温育 20 分钟, 如果此时, 沉淀仍然可见, 将温育时间延长 15~20 分钟 5. 小心吸取上清至一个新的无核酸酶的 15mL 离心管中, 加入 2.5 ml 100% 异丙醇, 轻轻颠倒 40~50 次混匀, 沉淀 DNA, 此时将会看见絮状沉淀 6. 室温下, 2,000 x g 离心 5 分钟, 此时将会在离心管底部形成 DNA 沉淀 7. 小心弃去上清液, 将离心管倒置于吸水纸上, 吸干残留的液体, 加入 5 ml 70% ethanol 颠倒混匀, 洗涤 DNA 沉淀 室温下,2,000 x g 离心 2 分钟, 此时 DNA 沉淀将会可见, 沉淀贴壁不实, 小心吸干上清液, 避免吸走沉淀 8. 重复步骤 7 9. 将离心管倒置于吸水纸上, 或者瞬时离心, 用枪头吸干上清液, 空气中放置 10~15 分钟 10. 加入 0.5~2 ml Elution Buffer, 涡旋悬浮沉淀 11. 65 放置 1 小时溶解 DNA, 某些样品可能需要更长的时间才会溶解 DNA, 比如 1~2 小时 技术支持 :021-54461558 订货电话 :021-54461657
放置很久后, 还是有未溶解的 DNA 沉淀, 可以用枪吸打助溶 12. 将 DNA 保存在 2-8, 长期保存, 置于 -20 ( 如果需要长期保存 DNA, 建议自配 TE 代替 Elution Buffer) C. 大量全血 DNA 提取操作步骤 ( 以 10mL 为例 ) 使用者自备材料 : 15mL 离心机 无核酸酶的 15mL 离心管 65 水浴锅 异丙醇,70% 乙醇请用去离子水将 Buffer ML 按照 1:4 进行稀释后使用. 1. 裂解血液细胞得到细胞核方法一 : 离心富集有核细胞进行核酸提取 : 将 10 ml 血样 2,000 xg 离心 15-20 分钟后抽弃血浆, 抽取中间白膜层细胞加入到 15 ml 离心管中, 加入 10 ml Buffer ML, 漩涡混匀 10 秒,2,000 xg 离心 5 分钟, 倒弃上清 再加入 10mL Buffer ML, 漩涡混匀 10 秒,8000 rpm 离心 2 分钟, 倒弃上清 方法二 : 两个 15 ml 离心管分别加入 5 ml 全血和 10 ml Buffer ML, 颠倒混匀 5 次,2,000 xg 离心 5 分钟, 倒弃上清, 再向其中加入 5 ml Buffer ML, 漩涡混匀 10 秒, 混合到一支离心管里,2,000 xg 离心 5 分钟, 倒弃上清 : 进行下游操作 ( 其余体积的全血可按比例进行操作 ) 提示 :Buffer ML 作为一种 4 倍的浓缩液提供, 使用时请用去离子水稀释成单倍后使用 如果是使用的冻存样品, 重复步骤 1, 直至沉淀呈现白色, 细胞裂解完全 2. 加入 6 ml Buffer BL 和 500 μl Proteinase K, 涡旋, 直至细胞核彻底悬浮 可选 : 如果需要去除 RNA, 加入 60 μl RNase A, 混匀 3. 置于 50 温育 20 分钟, 如果此时, 沉淀仍然可见, 将温育时间延长至 15~20 分钟 4. 小心吸取上清至一个新的无核酸酶的 50mL 离心管中, 加入 6 ml 100% 异丙醇, 轻轻颠倒 40~50 次混匀, 沉淀 DNA, 此时将会看见絮状沉淀 5. 室温下, 2,000 x g 离心 5 分钟, 此时将会在离心管底部形成 DNA 沉淀 Web:www.biomiga.com.cn E-mail:info@biomiga.com.cn
6. 小心弃去上清液, 将离心管倒置于吸水纸上, 吸干残留的液体, 加入 12 ml 70% ethanol 颠倒混匀, 洗涤 DNA 沉淀 室温下,2,000 x g 离心 5 分钟, 此时 DNA 沉淀将会可见, 沉淀贴壁不实, 小心吸干上清液, 避免吸走沉淀 7. 重复步骤 6 8. 将离心管倒置于吸水纸上, 或者瞬时离心, 用枪头吸干上清液, 空气中放置 10~15 分 钟 9. 加入 1~4 ml Elution Buffer, 涡旋悬浮沉淀 10. 65 放置 1 小时溶解 DNA, 某些样品可能需要更长的时间才会溶解 DNA, 比如 1~2 小 时 放置很久后, 还是有未溶解的 DNA 沉淀, 可以用枪吸打助溶 11. 将 DNA 保存在 2-8, 长期保存, 置于 -20 ( 如果需要长期保存 DNA, 建议自配 TE 代替 Elution Buffer) 测定 DNA 得率和纯度 所获基因组 DNA 通过分光光度计测定收获量, 用去离子水 Tris-HCl 缓冲液或者洗脱液做空白对照 DNA 浓度计算如下 : DNA 浓度 = 50 μg/ml OD260 { 稀释倍数 } DNA 纯度测定采用 260 nm 和 280 nm 测定光吸值的方法, 若 A260/A280 比值在 1.7-1.9, 表明纯度在 85%-90% 250 μl 全血中可以提取 4 μg-12 μg DNA, 具体量会因样品来源, 动物年龄, 保存方法而有所不同 技术支持 :021-54461558 订货电话 :021-54461657