临床与病理杂志 J Clin athol Res 2017, 37(11) http://lcbl.amegroups.com 2345 doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2017.11.010 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2017.11.010 CHCHD2 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义 杨锋, 夏靖华, 孙盈, 王雪娇, 文苗苗, 李小飞, 张志培 ( 第四军医大学唐都医院胸腔外科, 西安 710038) [ 摘要 ] 目的 : 检测 CHCHD2 在非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,nsclc) 组织和相应正常组织中的表达, 探讨其在 NSCLC 发生发展过程中的可能作用及临床意义 方法 : 收集 209 例 NSCLC 组织, 采用免疫组织化学法检测 NSCLC 及相应正常组织中 CHCHD2 的表达, 分析其在临床病理因素中的差异性 结果 :CHCHD2 主要定位于细胞质中, 癌组织与正常组织中表达阳性率差异有统计学意义 (<0.001) CHCHD2 在鳞癌亚型间表达差异无统计学意义 ( =0.957); 在腺癌亚型间表达差异有统计学意义 ( =0.027); 在腺癌 鳞癌的病理分级间, 表达差异均有统计学意义 ( =0.009, =0.006); 在 TNM 分期的 T 分期和 N 分期中表达差异有统计学意义 ( =0.011, <0.001) 结论:CHCHD2 在 NSCLC 中高表达, 是 NSCLC 组织与相应正常组织表达的差异蛋白, 其高表达可能会促进 NSCLC 的发展 侵袭和转移, 有望成为 NSCLC 不良预后的指标 [ 关键词 ] 非小细胞肺癌 ;CHCHD2; 免疫组织化学 Expression and clinical significance of CHCHD2 in non-small cell lung cancer patients YANG Feng, XIA Jinghua, SUN Ying, WANG Xuejiao, WEN Miaomiao, LI Xiaofei, ZHANG Zhipei (Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi an 710038, China) Abstract Objective: To detect the expression of CHCHD2 in non-small cell lung cancer (NSCLC) and normal tissues, and investigate its role and clinical significance on the process of NSCLC. Methods: The expression of CHCHD2 in NSCLC tissues and paired normal tissues of 209 cases was detected by immunohistochemistry method. The difference of CHCHD2 expression in clinicopathological parameters were analyzed by statistics. Results: ositive staining of CHCHD2 was mainly in cytoplasm. The positive expression rates of the CHCHD2 protein in NSCLC tissues was significantly higher than that in normal tissues (<0.001). In SCCs, no significant difference was found that CHCHD2 expression among different subtypes (=0.957). However, in ADCs there were significant difference of CHCHD2 expression in different subtypes (=0.027). The expression of CHCHD2 was significant difference among groups of pathological grading groups of SSCs and ADCs (=0.009, =0.006). There were significant difference of the CHCHD2 expression among various groups of T and N clinical stages (=0.011, <0.001). Conclusion: CHCHD2 is over-expressed in NSCLC and differentially expressed proteins between 收稿日期 (Date of reception):2017 08 23 通信作者 (Corresponding author): 李小飞,Email: lxfchest@fmmu.edu.cn; 张志培,Email: zzpzyy@fmmu.edu.cn
2346 临床与病理杂志, 2017, 37(11) http://lcbl.amegroups.com Keywords NSCLC tissues and normal tissues. CHCHD2 over-expressed in NSCLC, might promote the development, invasion and metastasis of NSCLC, which is expected to be a prognostic indicator for NSCLC. non-small lung cancer; CHCHD2; immunohistochemistry 肺癌是导致恶性肿瘤患者死亡的首要因素 [1] 非小细胞肺癌约占肺癌总数的 85%, 其 5 年总生存率约 15% [2] 因此探寻非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,nsclc) 原癌基因及肿瘤抑制基因的分子表达谱, 有望确立治疗 NSCLC 新的靶标分子 [3] CHCHD2(Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 2) 位于人类 7p11.2 染色体区, 含 4 个外显子, 由 456 个碱基对编码 151 个氨基酸, 它是含有 CHCH 结构域蛋白家族的成员之一 CHCHD2 含有 N 端线粒体定位序列和 C 端 CHCH 保守结构域, 共同存在时具有促进成纤维细胞迁移的功能 [4] CHCHD2 在人类细胞中的功能还不完全清楚, 有报道称 CHCHD2 在人类细胞具有促进翻译的作用 [5], 在成纤维细胞系 NIH3T3 中过表达 CHCHD2 具有促进细胞迁移和改变细胞黏附的作用 [4] 也有研究发现肝细胞肝癌中 CHCHD2 有高表达现象 [6], 而在 NSCLC 中 CHCHD2 与表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,egfr) 有共扩增现象 [7] 但是 CHCHD2 的表达在 NSCLC 发生发展中的作用尚不明确 因此, 本文检测 CHCHD2 在 NSCLC 组织及相应正常组织中的表达, 探讨 CHCHD2 与 NSCLC 临床特征的关系, 为明确 NSCLC 发生发展及其分子机制提供依据, 同时为 NSCLC 的预防 治疗提供参考 1 材料与方法 1.1 标本来源收集 2006 年 3 月至 2011 年 12 月第四军医大学唐都医院胸腔外科手术切除的 NSCLC 组织及正常组织 209 例, 其中正常组织为取自癌旁 5 cm 以上且病理检查为正常形态的肺组织 所有患者术前均未接受化疗 放疗及其他抗癌治疗 男 157 例, 女 52 例, 年龄 30~81( 中位 62) 岁 ; 根据 WHO 组织学分类 分级, 将本研究 209 例 NSCLC 分为腺癌 83 例, 其中高分化 9 例, 中分化 53 例, 低分化 21 例, 鳞癌 126 例其中高分化 7 例, 中分化 83 例, 低分化 36 例 ; 根据国际抗癌联盟 (The Union for International Cancer Control,UICC) 肺癌 TNM 分期标准, 分为 T1~T4 期分别为 17,145,46,1 例,N0~N3 期分 别为 99,57,52,1 例 本研究已通过第四军医大 学唐都医院伦理委员会批准, 所有入组患者或其 家属均已签署知情同意书 1.2 试剂 EnVision TM 两步法免疫组织化学试剂盒购自西 安基因公司 DAKO 产品 CHCHD2 蛋白抗体为药明 康德 ABGENT 商品化兔源性抗体 1.3 免疫组织化学法及结果判断 组织经 10% 中性甲醛溶液固定, 常规脱水 透明 包埋后,4 μm 切片 二甲苯脱蜡, 梯度乙 醇水化 ;3 mol/l 尿素消化 ; 柠檬酸缓冲液微波修 复, 冷却至室温 ;3% H 2 O 2 溶液阻断内源性过氧化 物酶 ;10% 山羊血清封闭 ; 加一抗 4 孵育过夜 ; 37 复温 ; 加二抗,37 恒温反应 ( 除血清封闭 外, 其余各步均需用 BS 漂洗 3 min 3 次 );DAB 显 色 苏木精复染,1% 盐酸乙醇分化, 水洗返蓝, 梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光 镜下观察 每张切片于高倍镜 (EnVision 400) 下随 机取 5 个不同视野, 观察计数阳性率和阳性强度 用已知阳性表达的组织作为阳性对照, 以 BS 代替 一抗作为空白对照 所有切片均经 2 位有经验的病理医师采用双盲 法阅片, 用阳性细胞染色强度和阳性细胞在癌细胞 中的比例来判定染色结果 1) 染色强度评分 : 无显 色为 0 分, 浅黄色或黄色为 1 分, 棕黄色为 2 分, 棕 褐色为 3 分 2) 染色细胞的阳性比例评分 : 5% 为 0 分,6%~25% 为 1 分,26%~50% 为 2 分,51%~75% 为 3 分,>75% 为 4 分 染色强度评分与染色细胞的阳性 比例评分相乘, 积分 0 分为阴性 ( ),1~4 分为弱阳性 (+),5~8 分为阳性 (++),9~12 分为强阳性 (+++) 1.4 统计学处理 采用 SSS 17.0 对免疫组织化学结果数据进行 统计学分析 :CHCHD2 在 NSCLC 组织和正常组织 中表达的差异性用 Wilcoxon(W) 检验 ; 在两个独立 样本间表达差异性用 Mann-Whitney U 秩和检验 ; 在多个独立样本间的表达差异性用 Kruskal-Wallis H 秩和检验
CHCHD2 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义 杨锋 等 2347 2 结果 2.1 CHCHD2 在 NSCLC 和 相 应 正 常 组 织 中 的 表 达和定位 CHCHD2在腺癌中表达的阳性率为 97.6%(81/83) 在相应正常组织中表达的阳性率 为14.5%(12/83) 差异有统计学意义( < 0.001) CHCHD2在鳞癌中表达的阳性率为92.1%(116/126) 在相应正常组织中表达的阳性率为8.7%(11/126) 差异有统计学意义(<0.001 表1) CHCHD2 主要表达于细胞质中 一些也表达于细胞核 中(图1-2) 表1 CHCHD2在癌织和相应正常组织中表达的差异性 Table 1 Difference of CHCHD2 expression in tumor tissues and corresponding normal tissues 组别 CHCHD2表达 + ++ +++ 总计 腺癌 2 26 36 7 71 + 0 1 10 1 12 鳞癌 10 52 47 6 115 + 0 2 6 3 11 A B C D E F Z 8.113 <0.001 9.524 <0.001 图1 CHCHD2在NSCLC中的表达(EnVision 100) Figure 1 Expression of CHCHD2 in NSCLC (EnVision, 100) (A)CHCHD2 在腺癌中高表达 (B)CHCHD2在腺癌中低表达 (C)CHCHD2 在腺癌中不表达 (D)CHCHD2在鳞癌中高表 达 (E)CHCHD2在鳞癌中低表达 (F)CHCHD2在鳞癌中不表达 (A) High expression of CHCHD2 in ADC; (B) Low expression of CHCHD2 in ADC; (C) Negative expression of CHCHD2 in ADC; (D) High expression of CHCHD2 in SCC; (E) Low expression of CHCHD2 in SCC; (F) Negative expression of CHCHD2 in SCC.
临床与病理杂志, 2017, 37(11) http://lcbl.amegroups.com 2348 A B C D E F G H I 图2 CHCHD2在腺癌和鳞癌亚型中的表达(EnVision 100) Figure 2 CHCHD2 expression in subtypes of ADC and SCC (EnVision, 100) (A)CHCHD2在非角化型鳞癌中表达 (B)CHCHD2在角化型鳞癌中表达 (C)CHCHD2在基底样型鳞癌中表达 (D)CHCHD2在伏壁型腺癌中的表达 (E)CHCHD2在腺泡型腺癌中的表达 (F)CHCHD2在乳头型腺癌中的表达 (G)CHCHD2在微乳头型腺癌中的表达 (H) CHCHD2在实体型腺癌中的表达 (I) CHCHD2在气道播散型腺癌中的表达 (A) CHCHD2 expression in non-keratinizing SCC; (B) CHCHD2 expression in keratinizing SCC; (C) CHCHD2 expression in basaloid SCC; (D) CHCHD2 expression in lepidic predominant ADC; (E) CHCHD2 expression in acinar predominant ADC; (F) CHCHD2 expression in apillary predominant ADC; (G) CHCHD2 expression in micropapillary predominant ADC; (H) CHCHD2 expression in solid predominant ADC; (I) CHCHD2 expression in spread through air spaces predominant ADC. 2.2 CHCHD2 在 WHO 肺 癌 组 织 学 分 类 中 表 达 的 差异性 根据2015版WHO肺癌组织学分类将126例 鳞癌组织分为角化型26.2%(33/126) 非角化型 55.5%(70/126)和基底样型18.3%(23/126)等3个 类型 按癌细胞的生长方式将肺腺癌分为伏壁 型10.8%(9/83) 腺泡型32.5%(27/83) 乳头型 13.2%(11/83) 微乳头型10.8%(9/83) 实体型 20.5%(17/83)和气道播散型12.0%(10/83)等6个亚 型(图2) 在鳞癌的组织学亚型组间 CHCHD2表 达差异无统计学意义( = 0.957) 在腺癌的组织学 分类亚型组间 CHCHD2表达差异无统计学意义 ( = 0.025 表2) 2.3 CHCHD2 在鳞癌和腺癌不同病理分级间表达 的差异性 在鳞癌高 中 低分化的不同组中CHCHD2 强阳性表达率分别为14.7%(1/7) 43.4%(36/83) 69.4%(25/36) 差异有统计学意义( = 0.009) 在 腺癌的高 中 低分化组中CHCHD2强阳性表达 率分别为22.2% 64.2% 85.7% 差异有统计学意 义( = 0.006 表3)
CHCHD2 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义杨锋, 等 2349 2.4 CHCHD2 在 NSCLC 的 TNM 分期中表达的差异性根据肿瘤的大小和特征分为 T1~T4 期, 在 T 分期中 CHCHD2 表达的阳性及强阳性率分别为 T1 期 29.4%(5/17),T2 期 53.1%(77/145),T3~T4 期 72.3%(34/47,T4 分期中的 1 例强阳性标本归入 T3 中 ),CHCHD2 表达在 T 分期中差异有统计学意义 (=0.011); 根据区域淋巴结转移情况分为 N0~N3 期,CHCHD2 表达的强阳性率在 N 分期中分别为 N0 期 41.4%(41/99),N1 期 56.1%(32/57),N2~N3 期 81.1%(43/53,N3 分期中的 1 例强阳性标本归入 N2 中 ),CHCHD2 表达在 N 分期中差异具有统计学意义 (<0.001, 表 4) 在本组标本中无远处转移组织, 故未对 M 分期中 CHCHD2 表达情况进行分析 表 2 CHCHD2 在鳞癌和腺癌 WHO 组织学分类中表达的差异性 Table 2 Difference of CHCHD2 expression in the new WHO classification of squamous cell carcinoma and adenocarcinomas CHCHD2 表达组织学分类亚型 n + ++ +++ 鳞癌 126 0.087 0.957 角化型鳞癌 33 4 12 15 2 非角化型鳞癌 70 5 32 27 6 基底样型 23 1 10 11 1 腺癌 83 12.608 0.027 伏壁型腺癌 9 0 5 4 0 腺泡型腺癌 27 1 8 17 1 乳头型腺癌 11 0 2 5 4 微乳头型腺癌 9 0 2 4 3 实体性腺癌 17 1 8 8 0 气道播散型腺癌 10 0 2 8 0 χ 2 表 3 鳞癌和腺癌不同病理分级间 CHCHD2 表达的差异性 Table 3 Difference of CHCHD2 expression in different grade of SCC and ADC CHCHD2 表达病理分级 n + ++ +++ χ 2 鳞癌 126 9.446 0.009 高分化 7 0 6 1 0 中分化 83 7 40 33 3 低分化 36 3 8 19 6 腺癌 83 10.081 0.006 高分化 9 0 7 2 0 中分化 53 2 17 29 5 低分化 21 0 3 15 3
2350 临床与病理杂志, 2017, 37(11) http://lcbl.amegroups.com 表 4 CHCHD2 在 NSCLC 的 TNM 分期中表达的差异性 Table 4 Difference of CHCHD2 expression in TNM stage of NSCLC CHCHD2 表达 TNM 分期 n + ++ +++ χ 2 T 分期 209 11.188 0.011 T1 17 1 11 4 1 T2 145 9 59 67 10 T3 46 2 11 28 5 T4 1 0 0 0 1 N 分期 209 24.350 <0.001 N0 99 9 49 39 2 N1 57 1 24 25 7 N2 52 2 8 34 8 N3 1 0 0 1 0 3 讨论 非小细胞肺癌的发生发展与多种因素相关, 发病过程极为复杂, 目前仍无特异 有效的靶点 作为可靠的预后指标 [8-9], 因此 NSCLC 的发生发 展原因及其机制或预后因子的研究仍有待加强 CHCHD2 是一个从酵母到人类多个物种间都很保 守的蛋白, 在人类和鼠类中 CHCHD2 有 87% 的氨 基酸保守序列 [10] CHCHD2 具有 C 端的 CHCH 结构 域, 此结构域的功能尚未明确, 具有此结构域的 一些其他蛋白行使不同的功能 [11-12] 已有一些关于 CHCHD2 的研究, 但 CHCHD2 的功能尚未明确 本文旨在检测 CHCHD2 在 NSCLC 中的表达, 探讨 CHCHD2 表达与 NSCLC 临床特征的关系, 为寻找 CHCHD2 在 NSCLC 发生发展中的作用提供依据 [11-12] 有研究证实许多含有 CHCH 结构域的蛋白 定位于线粒体内膜或膜间隙 本研究发现 CHCHD2 在 NSCLC 组织中主要表达于细胞质中, 因此, CHCHD2 可能定位于胞质中的线粒体, 是线粒体蛋 白 CHCHD2 在鳞癌和腺癌中表达的阳性率均显著 高于相应正常组织表达的阳性率 有关转录组基因 [13-14] 分析报道 :CHCHD2 基因在癌组织中表达高于 相应正常组织 综上提示 CHCHD2 在 NSCLC 中高 表达, 是肺癌组织和正常组织的差异蛋白 进一步的组织学亚型分类是个体化诊断和治 疗的需要 [15] 本研究中 CHCHD2 在鳞癌亚型中表 达差异无统计学意义, 在腺癌组织学分类亚型中 差异统计学意义 有研究显示微乳头型 实体型 生长模式腺癌表现出不良的预后 [16-17], 乳头型腺癌也表现出更短的生存期 [17] 本研究发现这些类型的腺癌中 CHCHD2 强阳性表达率较高, 分别为 77.8%, 47.1% 和 81.8% 综上结果提示 CHCHD2 更可能高表达于具有不良预后的腺癌亚型, CHCHD2 的表达可能与肿瘤的高恶性状态相关 随后本研究分析 CHCHD2 在鳞癌 腺癌病理分级中表达的差异性 在高分化 中分化和低分化的鳞癌组织中,CHCHD2 强阳性的表达率分别为 14.7%,43.4% 和 69.4%, 即 CHCHD2 在鳞癌中的表达强度与细胞分化程度呈负相关 ; 在高分化 中分化和低分化的腺癌组织中,CHCHD2 阳性和强阳性的表达率分别为 22.2%, 64.2% 和 85.7%, 即 CHCHD2 在腺癌中的表达强度与细胞分化程度呈负相关 ; 提示 CHCHD2 高表达可能促进 NSCLC 细胞增殖与分化 在临床 TNM 分期间,CHCHD2 表达的强度随临床 TNM 分期的增高而增强, 表明 CHCHD2 表达高低可能与 NSCLC 的大小 淋巴结转移程度有关, 进一步提示 CHCHD2 高表达可能会促进 NSCLC 的发展 侵袭与转移 CHCHD2 能增强细胞迁移活性 [18], 过表达 CHCHD2 能促进成纤维细胞 NIH3T3 的迁移, 而敲除内源性 CHCHD2 会降低其迁移活性 [4], 结合我们的临床结果, 提示 CHCHD2 高表达可能会促进 NSCLC 发展 侵袭和转移, 因此,CHCHD2 有望成为 NSCLC 不良预后的靶标 综上所述,CHCHD2 在 NSCLC 中高表达, 是癌组织和正常组织的差异蛋白 CHCHD2 可能是
CHCHD2 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义杨锋, 等 2351 线粒体蛋白, 在 NSCLC 发生发展中起促进作用, 与 NSCLC 的不良预后相关, 有望成为 NSCLC 不良预后的靶标 但 CHCHD2 在 NSCLC 中的作用机制尚不清楚, 需进一步研究 参考文献 1. Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics[ J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1): 10-29. 2. Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer[ J]. N Engl J Med, 2008, 359(13): 1367-1380. 3. Kabbout M, Garcia MM, Fujimoto J, et al. ETS2 mediated tumor suppressive function and MET oncogene inhibition in human nonsmall cell lung cancer[ J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(13): 3383-3395. 4. Seo M, Lee WH, Suk K. Identification of novel cell migrationpromoting genes by a functional genetic screen[ J]. FASEB J, 2010, 24(2): 464-478. 5. Nayak RR, Kearns M, Spielman RS, et al. Coexpression network based on natural variation in human gene expression reveals geneinteractions and functions[ J]. Genome Res, 2009, 19(11): 1953-1962. 6. Song R, Yang B, Gao X, et al. Cyclic adenosine monophosphate response element binding protein transcriptionally regulates CHCHD2 associated with the molecular pathogenesis of hepatocellular carcinoma[ J]. Mol Med Rep, 2015, 11(6): 4053-4062. 7. Wei Y, Vellanki RN, Coyaud E, et al. CHCHD2 Is coamplified with EGFR in NSCLC and regulates mitochondrial function and cell migration[ J]. Mol Cancer Res, 2015, 13(7):1119-1129. 8. Yoon SH. Immunotherapy for non-small cell lung cancer[ J]. Tuberc Respir Dis (Seoul), 2014, 77(3): 111-115. 9. rintz C. Targeted therapy in lung cancer: survival, quality of life improved for some patients[ J]. Cancer, 2014, 120(17): 2625-2626. 10. Liu Y, Clegg HV, Leslie L, et al. CHCHD2 inhibits apoptosis by interacting with Bcl-Xl to regulate Bax activation[ J]. Cell Death Differ, 2015, 22(6): 1035-1046. 11. Arnesano F, Balatri E, Banci L, et al. Folding studies of Cox17 reveal an important interplay of cysteine oxidation and copper binding[ J]. Structure, 2005, 13(5): 713-722. 12. Nobrega M, Bandeira SC, Beers J, et al. Characterization of COX19, a widely distributed gene required for expression of mitochondrialcytochrome oxidase[ J]. J Biol Chem, 2002, 277(43): 40206-40211. 13. Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2007[ J]. CA Cancer J Clin, 2007, 57(1): 43-66. 14. Zhuang X, Herbert JM, Lodhia, et al. Identification of novel vascular targets in lung cancer[ J]. Br J Cancer, 2015, 112(3): 485-494. 15. Wang W, Yan XL, Li WM, et al. Clinicopathologic features and prognostic implications of Gankyrin protein expression in non-small cell lung cancer[ J]. athol Res ract, 2015, 211(12): 939-947. 16. Russell A, Wainer Z, Wright GM, et al. Dose lung adenocarcinoma subtype predict patient survival?: A clinico clinicopathologic study basedon the new International Association for the study of lung cancer/ American Thoracic Society/European Respiratory Society intenational multidisciplinary lung adenocarcinomaclassification[ J]. J Thorac Oncol, 2011, 6(9): 1496-1504. 17. Warth A, Muley T, Meister M, et al. The novel histologic International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification system of lung a denocarcinoma is a stage-independent predictor of survival[ J]. J Clin Oncol, 2012, 30(13): 1438-1446. 18. Shaywitz AJ, Greenberg ME. CREB: a stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellularsignals[ J]. Annu Rev Biochem, 1999, 68: 821-861. 本文引用 : 杨锋, 夏靖华, 孙盈, 王雪娇, 文苗苗, 李小飞, 张志培. CHCHD2 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义 [ J]. 临床与病理杂志, 2017, 37(11): 2345-2351. doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2017.11.010 Cite this article as: YANG Feng, XIA Jinghua, SUN Ying, WANG Xuejiao, WEN Miaomiao, LI Xiaofei, ZHANG Zhipei. Expression and clinical significance of CHCHD2 in non-small cell lung cancer patients[ J]. Journal of Clinical and athological Research, 2017, 37(11): 2345-2351. doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2017.11.010