目录引言 1 第一章文献综述 2 1 鸡精子发生公鸡生殖系统鸡精原干细胞的研究进展 6 2 精原干细胞移植的研究进展精原干细胞的分离和纯化精原干细胞的低温冷冻保存精原干细胞移植精原干细胞移植的应用前景 10 第二章

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鸭沛衡
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1 硕士学位论文 (2009 届 ) 白消安对公鸡睾丸发育及精原干细胞移植效率的影响 The effects of busulfan on the development of the testes and spermagonial stem cells transplantation 研究生姓名陈云波指导教师姓名曹广力 ( 副教授 ) 专业名称研究方向论文提交日期遗传学动物分子遗传学和基因工程 2009 年 5 月

2 目录引言 1 第一章文献综述 2 1 鸡精子发生公鸡生殖系统鸡精原干细胞的研究进展 6 2 精原干细胞移植的研究进展精原干细胞的分离和纯化精原干细胞的低温冷冻保存精原干细胞移植精原干细胞移植的应用前景 10 第二章材料和方法 12 1 实验材料实验动物主要试剂主要仪器重要溶液配制 13 2 实验方法石蜡组织切片精子常规检查精原干细胞移植 19 第三章白消安对公鸡睾丸发育的影响 20 1 材料和方法实验动物分组及处理方法实验结果死亡情况及毒性反应 21

3 2.2 鸡睾丸重和体重测定睾丸组织光镜观察生精上皮高度和曲细精管直径 37 3 讨论白消安处理公鸡死亡情况分析白消安处理对公鸡睾丸重和体重的影响睾丸光镜观察和组织学分析 41 第四章白消安对精原干细胞移植效率的影响 43 1 材料与方法实验材料实验方法统计方法 45 2 结果精液常规检测精液 PCR 46 3 讨论白消安对精原干细胞的移植效率的影响精原干细胞移植的优化 47 结论 48 参考文献 49 攻读学位期间发表的论文 54 致谢 55

4 中文摘要中文摘要精原干细胞具有自我复制和分化成精子的能力, 是动物体内唯一能进行遗传信息传递的干细胞因此, 精原干细胞既是干细胞生物学的重要研究对象, 又是研究精子发生制作转基因动物和研究基因功能的重要资源 Brister 等人于 1994 年创立的精原干细胞移植技术, 以及 Nagano 等人于 2001 年和 Hamra 等人于 2002 年分别用不同的载体遗传修饰精原干细胞成功地产生了转基因小鼠或大鼠等研究为揭示精子发生过程和制作转基因动物提供了新的方法可惜的是这种技术一直没有应用到禽类在本研究中我们首先使用不同剂量的白消安诱导青春期和性成熟公鸡, 检测白消安处理后鸡睾丸形态变化曲细精管的组织学变化, 通过所得数据分析白消安对青春期和性成熟公鸡睾丸发育的影响, 确定受体所需剂量和诱导时间, 进行精原干细胞 ( 标记有 EGFP) 移植, 在移植后 7 周所采集到的精液中, 检测出表达 EGFP 我们选取了 15 周龄的青春期公鸡和 24 周龄的性成熟公鸡按 30 mg/kg 40 mg/kg 50 mg/kg 60 mg/kg 和 0 mg/kg 进行腹腔注射 15 周龄公鸡, 按 50 mg/kg 60 mg/kg 和 0 mg/kg 进行腹腔注射 24 周龄公鸡注射时于 37 水浴中保持恒温, 防止注射液凝固分白消安诱导 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d 60 d 共七个梯度处死公鸡, 去除睾丸, 称量公鸡体重及其睾丸的重量, 将睾丸石蜡包埋实验中青春期公鸡注射白消安后睾丸发育不同程度受阻,30 mg/kg 实验组在注射白消安后睾丸质量与对照组同步上升, 说明该剂量白消安对青春期公鸡的精原干细胞作用很小 40 mg/kg 实验组睾丸质量在白消安处理 20 和 25 天时与对照组有显著差异, 说明该剂量效用要高于 30 mg/kg, 但是在白消安处理 30 和 60 天时睾丸质量与对照组无显著差异本实验中 50 mg/kg 和 60 mg/kg 白消安对青春期公鸡睾丸发育作用非常显著, 致使公鸡在白消安处理 60 天后睾丸仍未能恢复至正常大小但 60 mg/kg 剂量明显快于 50 mg/kg,60 mg/kg 剂量的白消安处理 10 天时就已经起作用, 而 50 mg/kg 在处理 15 天时才影响了公鸡的睾丸发育表现出明显的剂量效应成熟期公鸡注射注射不同剂量白消安后睾丸也不同程度受阻, 实验组在注射白消安后 30 d 内睾丸质量持续下降, 与对照组差异显著, 在注射白消安 60 后睾丸 I

5 中文摘要质量仍未能回到正常水平试验过程中 60 mg/kg 实验组睾丸质量低于 50 mg/kg 实验组, 但差异不显著, 未表现出剂量效应白消安处理青春期和成熟期公鸡对其体重也产生了很大的影响从处理青春期公鸡 15 天开始一直至 60 天,50 mg/kg 和 60 mg/kg 实验组的公鸡体重显著低于 30 mg/kg 40 mg/kg 实验组及对照组 60 mg/kg 白消安处理性成熟公鸡 10 天时公鸡体重就显著低于 50 mg/kg 实验组和对照组, 一直持续到白消安处理 60 天为了进一步验证白消安对睾丸发育的影响, 我们又对睾丸石蜡切片进行了组织学分析发现白消安诱导性成熟和青春期公鸡后,50 mg/kg 白消安处理 15 d 和 60 mg/kg 白消安处理 10 d 时曲细精管细胞开始脱落, 管腔中精子数量开始减少 ; 之后曲精细管细胞不断脱落, 管壁不断溶解, 中空的曲细精管不断增加 ; 在 50 mg/kg 白消安处理 30 d 和 60 mg/kg 白消安处理 25 d 时多数曲细精管表现为中空, 只剩下 1 层细胞, 只有少数曲细精管有多层细胞, 为外源精原干细胞提供了一定数量的巢 (niche);60 mg/kg 白消安处理 30 d 时视野中曲细精管已经都严重萎缩, 只剩下 1 层支持细胞实验过程中 60 mg/kg 白消安对睾丸发育的影响要明显快于并强于其它剂量, 表现了公鸡睾丸对高剂量白消安的敏感性 50 mg/kg 白消安处理性成熟公鸡 60 天时, 曲精细管细胞从 30 天时的 1-2 层细胞恢复至 2-4 细胞, 说明 50 mg/kg 白消安在处理天时进行了精原干细胞恢复, 该时间段可能是性成熟公鸡精原干细胞移植的最佳时间 60 mg/kg 白消安处理 60 天时曲精细管细胞曲精细管细胞仍是支持细胞, 说明该剂量和时间不适合精原干细胞移植 60 mg/kg 白消安处理青春期公鸡 60 天时, 曲精细管仍只有一层支持细胞, 且部分支持细胞脱落, 说明该剂量和时间不适合精原干细胞移植 50 mg/kg 白消安处理青春期公鸡 60 天时, 曲精细管也只有一层支持细胞, 未发生精子发生重建, 说明该剂量和时间也不适合精原干细胞移植为了确定上述分析, 我们进行了精原干细胞移植实验白消安 (50 mg/kg) 诱导青春期和成熟期 30 天的公鸡作为受体, 供体细胞来自转 EGFP 的 16~19d 鸡胚胎细胞, 移植后 7 周所采集到的精液中, 来自成熟鸡受体的精液中检测出表达 EGFP 我们的研究表明白消安对公鸡睾丸发育和精原干细胞移植效率的影响非常大高剂量的白消安能够有效的去除内源精原干细胞, 为外源精原干细胞定居提 II

6 中文摘要供龛位, 但并非是去除的内源精原干细胞越多, 为外源精原干细胞定居提供龛位越多, 移植的效率就越高还要注意到诱导后的睾丸微环境还具备不具备重建精子发生的能力关键词 : 公鸡, 睾丸, 精原干细胞, 白消安, 移植作者 : 陈云波指导老师 : 曹广力副教授张易祥副教授 III

7 英文摘要 The effects of busulfan on the development of the testes and spermagonial stem cells transplantation Abstract Spermatogonial stem cells(sscs), the only stem cells that are capable of transmitting genetic information to subsequent generations in adult animals,have abilities to self-renew and differentiate into spermatozoa. Therefore, SSCs are not only the study object of stem cell biology, but also the valuable resource of in vitro spermatogenesis, gene analysis andfunctional genomics. Brister et al (1994) established the SSC transplantation technique, and Nagano et al (2001) and Hamra et al (2002) successfully in vitro manipulated SSCs by using different vectors and produced transgenic mice and rat after transplantation back into recipient testes respectively. These studies provided a new method for delineating spermatogenesis and making transgenic animals. However, unfortunately this technology has been applied to no birds. In this study, we use different doses of busulfan to induct adolescence and sexual rooster, then checked the change of convoluted seminiferous tubule in histology and testes in form.according to these,we choose the optimal dosage and induction time to prepare recipient and transplant SSCs(marked with EGFP) in the testis of recipient. Some sperm marked with EGFP is checked out in seven weeks after transplantation. We used 30 mg 40 mg 50 mg and 70 mg busulfan kg-1 body weight on 15 weeks old adolescence rooster and 50 mg and 70 mg busulfan kg-1 body weight on 24 weeks old sexual rooster.injected busulfan in 37, solution water remains constant, prevent injection coagulation. Rooster are killed when it is 5 d,10 d,15 d,20 d,25 d,30 d,60 d after treated with busulfan,and weigh the weight of the testis and rooster.in the end all the testicle are embedded in paraffin. In this experiment, the development of the testes in adolescence rooster is effected in different degree after treated with busulfan. The weitht of the testis from the adolescence rooster treated with 30 mg busulfan kg-1 body weight rises synchronously IV

8 英文摘要 with control group.this shows this dose of busulfan is small to eliminate endogenetic SSCs of the adolescence rooste. When it is 20 d and 25 d after treated with 40 mg busulfan kg-1 body weight, the weitht of the testis from the adolescence rooster is significant different with control group.this dose of busulfan is more severe than 30 mg busulfan kg-1 body weight to eliminate endogenetic SSCs.But there is no difference between the experimental group treatedwith this dose and control group 30 d and 60 d after being treated. In this experiment, there are significant effect to the development of testis after treated with 50 mg and 70 mg busulfan kg-1 body weight. The size of the testis can not return to normal levels until 60 d after it is treated with busulfan.but the time busulfan begins to take effect is 10 d after being treated with 70 mg busulfan kg-1 body weigh and the time busulfan begins to take effect is 15 d after being treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh. This shows there is a significant dose dependent effect. The development of the testes in sexual rooster is effected in different degree after treated with busulfan too. In 30 d after the experimental group is treated with busulfan, the weight of testis has been a steady decrease, it is significant different with control group. The size of the testis can not return to normal levels until 60 d after it is treated with busulfan.in this experiment, the weight of the testis treated with 70 mg busulfan kg-1 body weigh is smaller than the testis treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh, but it is not significant. This does not show there is a significant dose dependent effect. The effect to the body weigh is very large after the sexual rooster and the adolescence rooster are treated with busulfan. From 15 d to 60 d after the adolescence rooster is treated with 50 mg and 70 mg busulfan kg-1 body weigh, the weight of rooster is significant lower than the adolescence rooster treated with 30 mg, 40 mg busulfan kg-1 body weigh and control group. From 10 d to 60 d after the sexual rooster is treated with 70 mg busulfan kg-1 body weigh is significant lower than the sexual rooster treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh and control group. In order to verify the effects of busulfan on the development of testicular, we also conducted histology analysis in paraffin sections. We find the cells in the convoluted seminiferous tubules begin in the fall 15 d after the sexual rooster treated and the adolescence rooster are treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh and 10 d after they are treated with 70 mg busulfan kg-1 body weigh, the sperm in the convoluted seminiferous tubules begins to decrease. The cells constantly shed; the hollow V

9 英文摘要 convoluted seminiferous tubules continue to increase. There is only a layer of cells 30 d after it is treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh and 25 d after it is treated with 70 mg busulfan kg-1 body weight in the vast majority tubules, and provides a certain number of niches for the exogenous SSCs. The convoluted seminiferous tubules are gradually shrunk; there is only a layer of cells 30 d after it is treated with 70 mg busulfan kg-1 body weigh. In this experiment, the effect on the development of testicular is significantly faster and stronger than other doses. 50 mg/kg. The cells in the convoluted seminiferous tubules increase from 1-2 layers to 2-4 layers 60 d after the sexual rooster is treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh. This shows the ability of spermatogenesis comes back. This time may be the best for SSCs transplantation. There is only a layer of sertoli cells in the tubules 60 d after being treated with 50 mg busulfan kg-1 body weight. This shows it is not the optimal time and dose for SSCs transplantation. There is only a layer of sertoli cells in the tubules 60 d after the adolescence rooster being treated with 50 mg busulfan kg-1 body weigh. The ability of spermatogenesis does not come back.this shows it is not the optimal time and dose for SSCs transplantation too. In order to determine the above analysis, we transplant SSCs(marked with EGFP) from 16~19 d old PGCs into the testis of recipients treated with 50 mg busulfan kg-1 body weight when it is 30 d after these the sexual and the adolescence rooster are treated. Some sperm marked with EGFP is checked out in seven weeks after transplantation. Our research shows that the effect of busulfan on the development of testicular and the efficiency of SSCs transplantation. High dose of busulfancan can effectively eliminate endogenous SSCs, and provides a certain number of niches for the exogenous SSCs. But it is wrong that the more the endogenous SSCs eliminate, the higher the efficiency of SSCs transplant. We should turn our eyes to the testicles microenvironment after induction, and we should know does the ability of spermatogenesis come back. Keywords: rooster, testes, spermatogonial stem cells, busulfan,transplantation Written by:yunbo Chen Supervised by:guanli Cao Yixian Zhan VI

10 引言引言精原干细胞 (spermatogonial stem cells, SSCs) 是由原始生殖细胞 (Primordial Germ Cells,PGCs) 发育分化产生的 [1], 是精子发生的启动者和维持者, 在曲细精管的基膜上能象其他成体干细胞一样自我增殖定向分化自从 1994 年 Brinster 等首次将可育小鼠的精原干细胞注射到不育小鼠的曲细精管使受体鼠产生了具有受精能力的精子并产出了正常后代之后 [1,2], 精原干细胞移植已成为干细胞研究领域的一大热点目前多采用白消安去除内源精原干细胞制备移植受体, 当白消安作用于睾丸时, 优先作用的是精原干细胞, 从而有效降低内源精原干细胞数量并对睾丸发育产生影响国内外对白消安去除动物精原干细胞的研究主要集中于啮齿类特别是鼠类 [3], 白消安对鸡精原干细胞影响方面的研究尚未见报道, 但制作生产重组蛋白和具有抗病特性的转基因鸡一直是许多研究者关注的热点所以, 用白消安作烷化剂诱导鸡, 研究白消安对鸡睾丸发育及移植效率的影响, 对能否成功制作转基因鸡有重要的意义有文献资料表明, 哺乳动物供体精原干细胞在受体睾丸内能否有效存活迁移定居增殖依赖于供体精原干细胞和内源精原干细胞的竞争这两类细胞的相对数量外源细胞进入输精管基底区的数量 ; 睾丸内源精原干细胞数量越少, 移植成功率越大 [4] 禽类是否如此尚需证明本实验用不同剂量白消安处理青春期和性成熟公鸡, 检测白消安处理后鸡体重睾丸重的变化及睾丸的组织学变化, 分析不同剂量的白消安对不同时期公鸡睾丸发育的影响并通过移植确定其对精原干细胞移植效率的影响为转基因受体鸡的制备提供重要的技术支持 1

11 第一章文献综述第一章文献综述 1 鸡精子发生精子发生是指由原始生殖细胞发育到精原细胞, 再发育到精子成熟并排出体外这一完整过程, 现一般分为原始生殖细胞精原细胞增殖期初级精母细胞生长期成熟分裂期和精子形成期 5 个发育阶段 [5] 公鸡的精子发生主要经过 4 个时期, 即精原细胞初级精母细胞次级精母细胞精子细胞刚孵出的小公鸡, 在睾丸的精细管管壁上便可见到精原细胞,5 周龄时精细管发育, 精原细胞开始增殖生长 6 周龄时出现次级精母细胞大约 10 周龄时, 初级精母细胞经减数分裂产生次级精母细胞,12 周龄时, 次级精母细胞进行有丝分裂形成精细胞, 最后, 精细胞变形, 成为精子一般在 20 周龄时, 睾丸精细管内就有成熟精子存在 1.1 公鸡生殖系统公鸡的生殖系统由睾丸睾丸旁导管系统输精管和交媾器等组成, 缺哺乳动物特有的副性腺和精索等结构睾丸睾丸的结构鸡的睾丸由短的睾丸系膜悬吊于腹腔体中线背系膜两侧的肠体腔背侧左右睾丸的凹面朝向体中线, 长轴相互平行, 但与体中轴比较, 睾丸的前端略向右倾斜呈豆形, 有左右对称的两个睾丸, 通常左侧的睾丸比右侧略大其体表投影位置 : 约在最后两个椎肋上部, 并突向后方鸡背部与肾前部相邻, 前接胸腹膈和肺后缘接触髂总静脉外靠腹气囊内接主动脉后腔静脉和肾上腺腹腔动脉在左睾丸与后腔静脉间通过左睾丸的腹面接腺胃和部分肌胃, 但彼此间被左腹气囊的前内侧膨大囊所隔开右睾丸腹面与十二指肠小肠末端肓肠和肝脏相邻禽类的睾丸位于腹腔内, 周围被内脏 2

12 第一章文献综述器官所包围, 因此它的温度接近于体内深部的体温, 约 43 0 C, 但由于腹气囊紧挨睾丸, 呼吸过程中, 由于气囊内的气体交换, 会使睾丸温度比体温低 C, 而有利于精子的发生但也有人认为睾丸温度与身体深部温度本差无几, 还有人认为由于夜间禽类活动性较低, 体温下降, 有利于精子生成睾丸实质主要由睾丸间质和曲细精管两部分组成间质中富含血管淋巴管, 以及肥大细胞巨噬细胞淋巴细胞等结缔组织细胞间质中还有一种成群分布的间质细胞, 称为 Leydig 细胞曲细精管是由支持细胞 (Serto1i 细胞 ) 和处于不同发育阶段的生精细胞共同组成的生精上皮所围成, 其外包有基膜和管周类肌细胞 (peritubular myoid cell), 又称管周收缩细胞曲细精管的内壁由一种特殊的复层上皮组成, 称为生精上皮上皮细胞有两种 : 生精细胞和支持细胞曲细精管上皮的外面有一薄层基膜基膜的外围是胶原纤维和具有平滑肌特征的一至数层扁平细胞, 即类肌细胞类肌细胞有收缩功能, 以助曲细精管内精子及液体的排出支持细胞最早于 1865 年由意大利生理学家 Enricol Sertoli 发现和描述, 因此又称其为 Sertoli 细胞 Sertoli 细胞的底部紧贴在基膜上, 顶端伸向管腔, 侧面和表面有各级生精细胞嵌入核呈卵圆形或不规则形, 染色质细而均匀, 核仁明显细胞质中除一般细胞器外, 还含有微丝和微管支持细胞具有为生精细胞提供营养吞噬凋亡的生精细胞和精子形成过程中的遗弃物分泌雄激素结合蛋白 (adrogen binding prorein,abp) 和抑制素 (inhibin) 等功能因此,Sertoli 细胞为精子发生提供了相对稳定的环境营养以及由基膜向管腔转位等诸方面的支持支持细胞之间在近基膜底部存在着紧密连接, 将曲细精管分为近基膜室 (basal compartment) 和近腔室 (adluminal compartment) 两部分, 形成功能性血睾屏障 (blood testis barrier,btb) 血睾屏障能阻止生长因子营养物质和某些蛋白质激素由间质进入曲细精管, 维持了曲细精管内的生精微环境此外, 多数类肌细胞间也存在着紧密连接, 因而类肌细胞层与基膜一起构成了渗透性屏障, 对某些分子进行过滤, 协助维持有效的血睾屏障 [6] 血睾屏障的建立不仅使曲细精管的近腔室形成了不同于血液和淋巴液的特殊微环境, 而且还与曲细精管液的产生密切相关 [7] 生精细胞镶嵌在支持细胞之间, 从曲细精管的基膜向管腔作多层排列, 依次为精原干细胞 (spermatogonial stem cells) 精原细胞 (spermatogonia) 初级精母细胞(primary spermatocyte) 次级精母细胞(secondary spermatogocyte) 圆形精子细胞(round spermatid) 和长形形精子细胞 (elongated 3

13 第一章文献综述 spermatid) 精原干细胞紧贴基膜, 散在或成群分布, 数量少, 呈圆形, 直径 14-15μm, 细胞质少, 核大, 圆形或卵圆形, 核内有散在的异染色质精原细胞位于基膜上, 呈圆形或立方形, 进行有丝分裂, 增加细胞数量初级精母细胞的体积比精原细胞大, 细胞核内 DNA 复制后, 一个初级精母细胞进行第一次减数分裂, 产生两个次级精母细胞次级精母细胞接近管腔, 体积较小经历一个简短的分裂间期 ( 或不经历间期 ) 进入减数第二次分裂, 产生两个圆形精子细胞圆形精子细胞位于支持细胞顶端或聚集于支持细胞顶部的周围, 细胞体积小, 细胞质少, 核圆形圆形精子细胞经过变态, 形成长形精子细胞, 进一步成熟为精子并被释放到曲细精管的管腔中睾丸外依附有附睾 (epididymis) 附睾可分为头(caput) 体 (corpus) 尾 (cauda) 三部分睾丸中曲细精管在睾丸网汇合成几条输出小管, 经睾丸后缘上部, 穿入附睾头部, 延续为附睾管附睾头部主要由睾丸的输出小管组成, 其余部分由附睾管组成附睾是精子运输储存以及进一步成熟的场所禽类睾丸的动脉及其分支较哺乳动物简单睾丸动脉与肾前动脉以一总干起自腹主动脉或直接起自腹主动脉睾丸动脉极度短, 在睾丸内于精细管之间分支形成许多动脉袢静脉血汇入浅层静脉, 再汇集于极短的睾丸静脉, 最后汇入后腔静脉支配睾丸的神经有交感神经和副交感神经睾丸的功能睾丸有生精作用和内分泌作用两大功能睾丸是雄性动物精子发生的器官, 曲细精管是精子发生的场所位于曲细精管基膜的生精干细胞一方面不断地自我复制, 另一方面, 一部分干细胞分化为 A 型精原细胞, 精原细胞经过一系列复杂的分裂活动和精子形成过程最终形成精子另外, 分布于睾丸间质中的 Leydig 细胞能合成和分泌雄性激素, 即睾酮 (testosterone,t), 以及一些非甾体类激素和生长因子, 如 Inhibin 等 [8] 这些激素和因子除了对睾丸内精子发生本身的调节外, 还参与了全身性调节, 如睾酮能调节雄性动物青春期第二性征的形成睾丸有年龄变化, 这主要表现在曲细精管的变化青春期前的幼龄动物的睾丸尚未发育完全, 曲细精管较细, 为实心的管子, 没有管腔, 只有支持细胞和精原细胞构成的生精上皮青春期曲细精管的管径变粗, 出现管腔, 精原细胞开始分裂增殖和分化, 出现各种生精细胞老年期曲细精管萎缩, 但仍有少量精子形成睾丸旁导管系统 4

14 第一章文献综述禽类缺少哺乳动物那样明显的头体尾之分的附睾而是由位于睾丸背内侧缘全长的与其紧密相连的长纺锤形的膨大物睾丸旁导管系统它是由睾丸网睾丸输出小管附睾小管和附睾管共同组成, 其最前端埋入肾上腺被囊内, 精细管的末端一段伸直, 称直细管, 其上无生精细胞分布, 它最后汇聚于睾丸网睾丸网呈网状腔隙, 埋在与导管系统紧接的睾丸背内侧缘的纤维结缔组织内, 向前后两端延伸睾丸网发出约 70 圈的睾丸输出小管, 其起始部管腔较大, 有许多高的纵行粘膜皱襞, 被覆单层柱状上皮或假复层柱状上皮, 其中大部分上皮细胞具有纤毛随后管径变小, 数量减至 50 圈左右, 经附睾小管, 最后开口于附睾管与哺乳动物比较, 禽类附睾管短, 向后与长而纡曲的输精管相接, 附睾管衬以不具有纤毛而有分泌功能的假复层柱状上皮输出小管和附睾管不仅是精子进入输精管的通道, 其中睾丸网和附睾管还具有分泌酸性磷酸酶糖蛋白和脂类的特性输精管输精管是睾丸的一对排出管, 呈极端旋卷状的导管未解剖时长约 10 厘米, 输精管前接附睾管, 沿肾脏内侧腹面与同侧的输尿管在同一结缔组织鞘内后行, 到肾脏后端时, 输精管越过输尿管腹面, 沿着其外缘进入腹腔后部, 输精管在骨盆腔伸直一短距离后, 形成一略为膨大的圆锥形体 ( 约 3.5 毫米, 由结缔组织和平滑肌增多所致 ) 最后形成输精管乳头, 突出于泄殖腔腹外侧壁的输尿管口的腹内侧输精管粘膜形成纵行皱褶衬以柱状上皮, 无腺体分布, 肌层较发达, 但纵肌和环肌的层次不明显, 末端处环肌特别发达, 形成括约肌, 强大的射精力量可能与此有关输精管有丰富的肾上腺能神经分布, 输精管是精子的主要贮存器官, 其上皮能分泌较多的酸性磷酸酶经电子显微镜观察, 精子可被输精管上皮所吸收交媾器公鸡虽无真正的阴茎, 但有一套完整的交媾器, 位于泄殖腔后端腹区, 性静止期, 它隐慝在泄殖腔内, 由四部分组成 : 输精管乳头脉管体阴茎和淋巴襞输精管末端通过泄殖腔, 形成圆锥形突起, 位于输尿管开口的腹侧, 其基部与输尿管开口间相距约 5 8 毫米性成熟的公鸡, 在性静止时, 输精管乳头长约 2.5 毫米, 直径约 2 3 毫米, 开口朝向后内侧脉管体有一对, 长约 7 毫米, 宽约 1 毫米, 呈扁平的纺缍形体, 色红, 外侧面 5

15 第一章文献综述略为突出, 内侧面较平坦, 相当于其它器官的门部它位于泄殖道和肛道腹外侧壁阴茎后缩肌和阴茎前缩肌之间的输精管外侧脉管体血液由阴部内动脉供应脉管体外包结缔组织膜, 被膜发出许多小梁分支, 其间分布着丰富的毛细血管索小梁和毛细血管索之间是宽度不一的淋巴间隙脉管体内的淋巴间隙与阴茎及淋巴襞内的丰富淋巴丛相通连性兴奋时, 淋巴液或类似淋巴样液体从脉管体滤出, 通过淋巴窦, 大量进入阴茎和淋巴襞, 由于淋巴的压力急剧增高, 迫使阴茎勃起阴茎位于肛道腹中线, 向外接近输精管乳头, 由正中阴茎体 ( 白体 ) 和一对外侧阴茎体 ( 圆襞 ) 组成性兴奋时, 正中阴茎体直径约毫米, 外侧阴茎体的体积变化较大, 其前后径约毫米, 内外径约毫米刚孵出的雄性幼雏, 可根据肛道腹侧膨大的阴茎结构, 以鉴别其性别阴茎前缩肌止于泄殖道壁的淋巴襞略外侧, 阴茎后缩肌止于正中阴茎体淋巴襞分别夹在外侧阴茎体与输精管乳头之间, 体积约为毫米 3, 性兴奋时, 淋巴襞勃起, 阴茎内丰富的淋巴管与脉管体及淋巴襞内的淋巴管道相互通连起来 1.2 鸡精原干细胞的研究进展精原干细胞的概念精原干细胞是体内唯一的能在细胞水平进行识别并研究其增殖分化及其调控的成体干细胞, 是指位于精曲小管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定, 又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞 [7] 其前体是原始生殖细胞 (Primordial germ cells,pgcs), 在雄性,PGCS 演化为精原细胞的前体性原细胞, 性原细胞再发育为精原千细胞精原干细胞的增殖和分化 SSCs 相对数量较少, 仅占生殖细胞的 0.02~0.03% 睾丸中大部分的精原细胞并不是干细胞, 而是处在分化期的生殖细胞, 它们已经进行精子形成过程并发生 [9] 了一系列的有丝分裂 Hofmann 等人认为真正意义上的 SSCs 是指 As 型精原干细胞, 其更新可产生两个精原干细胞或者是分裂产生两个通过胞质桥相连的 Apr 型精原细胞 [10],Apr 型精原细胞进一步分裂形成个细胞的 Aal(the aligned spermatogonia) 型精原细胞 Aal 成为第一代分化的 A1 型精原细胞 A1 型精原细胞随后进行连续六次的细胞分裂依次产生 A2 A3 A4 等中间型和 B 型精原细胞,B 型精原细胞最后一次分裂产生精母细胞 [11] SSCs 一方面能够自己更新产生新的干 6

16 第一章文献综述细胞以维持自身数量的恒定, 一方面能够在自身基因或外来信号的调节下增殖分化为个阶段的生殖细胞甚至精子由 As 型细胞到 Apr 细胞的分化是精原细胞分化中比较关键的一步, 此后形成的细胞均由细胞间桥相连, 目前尚不清楚细胞间桥是否与这些细胞分化的不可逆有 [12] [13] 关在正常的生精环境中, 小鼠和中国仓鼠的生精上皮中只发现了 4 个 8 个 16 个及 32 个细胞链的 Aal 型细胞, 这些细胞间桥保存完整但是, 在注射白消安得到的突变型的小鼠, 其生精小管的基膜上有 3 个 5 个及 11 个 Aal 型细胞 [14], 可见出现这样情况是由于细胞间桥的断裂, 目前不清楚的是从 Apr 及 Aal 上排出的单个细胞与真正的 As 型细胞有何不同 2 精原干细胞移植的研究进展 2.1 精原干细胞的分离和纯化供体的选择与其它干细胞一样, 精原干细胞的数量非常少据统计, 睾丸中每 5000 个细胞中大约只有 1 个精原干细胞 [5] 随着动物日龄的增加, 精原干细胞逐渐分化成各级生精细胞, 其绝对数目以及占生殖细胞的比例都会下降, 给分离纯化造成更大困难而且, 不管是精原干细胞还是体细胞环境都会随着年龄的增长而老化 [15] 因此, 通常选用日龄较小且性未成熟动物的睾丸组织进行分离据报道, 一般小鼠选用出生后 7-8 天 ; 大鼠选用 9-10 天 [16] ; 兔选用 1 个月以内 ; 而狗和牛则选用 3 个月左右为宜 [17,18] 在实际应用中还可以选用含精原干细胞比例较高的动物模型, 如啮齿动物中有维生素 A 缺乏或患隐睾症的小鼠等也可以采用人工制备的隐睾小鼠作为供体动物睾丸细胞移植已经完成了供体为小鼠 [19], 大鼠 [20], 仓鼠 [21], 兔 [22], 猫和狗 [23], 牛 [24], 猪和马 [25,26], 山羊 [27], 猴 [28] [29], 和人的研究分离和纯化精原干细胞的分离和纯化是精原干细胞移植中非常重要的步骤, 其主要依据是曲细精管内各种细胞的比重大小贴壁速度及表面标记的不同目前可用的精原干细胞的分离方法主要有单位重力沉降法牛血清白蛋白梯度 percoll 密度梯度离心法和磁选细胞分类法最近的研究表明, 采用多参数筛选方法用荧光激活分类分析从小鼠隐睾中可得到高于对照组 166 倍的高纯度的精原干细胞 [30] 但这些方法都非常复杂, 所获细胞纯度和数量也有限, 所以目前用的较多的方法仍然是酶消化法和根据细胞贴壁速度的不同进行纯化, 其结果可得到超过 50% 的 A 7

免疫系统

免疫系统茵梓 yinzi@zju.edu.cn 男性生殖系统组成生殖腺 : 睾丸生殖管道 : 附睾输精管射精管附属腺前列腺精囊尿道球腺生殖器 : 阴囊阴茎男性生殖系统组成及功能生殖腺 : 睾丸产生精子分泌雄激素生殖管道 : 精子成熟贮存和运输附睾输精管射精管附属腺 : 分泌精浆前列腺精囊腺尿道球腺生殖器 : 阴囊阴茎睾丸 testis 被膜 : 鞘膜脏层

目录 引言 1 第一章文献综述 2 1 鸡精子发生 公鸡生殖系统 鸡精原干细胞的研究进展 6 2 精原干细胞移植的研究进展 精原干细胞的分离和纯化 精原干细胞的低温冷冻保存 精原干细胞移植 精原干细胞移植的应用前景 10 第二章

目录引言 1 第一章文献综述 2 1 鸡精子发生公鸡生殖系统鸡精原干细胞的研究进展 6 2 精原干细胞移植的研究进展精原干细胞的分离和纯化精原干细胞的低温冷冻保存精原干细胞移植精原干细胞移植的应用前景 10 第二章