第 1 期曹碗君等. PTIP 相关蛋白 1 在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位 9 材料与方法 1 组织材料 SPF 级 C57 小鼠, 出生后 1w 2w 4w 8w 12w 18w 及 24w 各 4 只, 购自第四军医大学实验动物中心 2% 苯戊巴比妥以 45 mg/kg 体重腹腔麻醉, 取左

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伎戽冉
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1 第 27 卷第 1 期 2018 年 2 月中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY Vol.27.No.1 February.2018 PTIP 相关蛋白 1 在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位 * ( 第四军医大学基础部组织学与胚胎学教研室, 西安 ) 摘要目的探索 PTIP 相关蛋白 1(PTIP associated protein 1,PA1) 在小鼠睾丸发育过程中的表达定位方法采用 RT- PCR 实时定量 PCR 和免疫组织化学方法, 对 PA1 在小鼠睾丸不同发育阶段的表达及定位进行检测结果 RT-PCR 和实时定量 PCR 结果显示,PA1 mrna 在 1w 2w 4w 8w 12w 18w 和 24w 的小鼠睾丸中均有表达, 且其表达量在 2w 时达到最高峰, 在小鼠性成熟 (8w) 以后,PA1 的表达量趋于平稳 ABC 法免疫组织化学染色显示 PA1 在 1w 2w 4w 和 8w 小鼠睾丸各级生精细胞支持细胞和间质细胞的胞核中均有表达, 免疫荧光双标进一步确定 PA1 表达于支持细胞和间质细胞结论 PA1 可能在维持生精细胞的正常分化及调节睾丸内分泌的平衡中起重要作用关键词 PA1; 睾丸 ; 生精细胞 ; 支持细胞 ; 间质细胞中图分类号 R329.4 文献标识码 A DOI: / j. cnki Expression and localization of PTIP associated protein 1 during mouse testis development Cao Wanjun, Zhao Jie, Qiao Huilian, Ma Binfang, Li Zhen * (Department of Histology and Embryology, The Fourth Military Medical University, Xi an China) Abstract Objective To explore the expression and localization of PTIP associated protein 1 (PA1) during mouse testis development. Methods The expression and localization of PA1 in mouse testis were evaluated at various developmental stages up to 24 weeks after birth using qrt-pcr, immunohistochemistry and immunofluorescent staining. Results PA1 expression in mouse testis was detectable one week after birth, peaked at week 2 and remained stable after 8 weeks. Immunohistochemical staining (ABC method) of 1 to 8 w mice testis showed PA1 mainly expressed in the nucleus of spermatogenic cells at all stages, Sertoli cells and Leydig cells. Immunofluorescent double staining further confirmed PA1 expression in Sertoli cells and Leydig cells. Conclusion The presence of PA1 throughout mouse testis development suggested that PA1 may play a role in the maintenance of spermatocyte differentiation and the regulation of testicular endocrine. Keywords PA1; testis; germ cells; sertoli cells; leydig cells 组蛋白甲基化是指发生在 H3 和 H4 组蛋白 N 端赖氨酸 (lysine) (K) 或者精氨酸残基上的甲基化, 其中 H3K4 的甲基化与基因的激活相关, 由组蛋白甲基转移酶介导催化人类组蛋白 H3K4 甲基转移酶由以下 3 对复合物组成 :SETd1A/SETd1B MLL1/2 和 MLL3/4 [1] PTIP 相关蛋白 1(PTIP associated protein 1,PA1) 首次由 Young-Wook Cho 等在研究 MLL3/4 复合体功能时发现, 因为和 Pax 转录激活结构域相互作用蛋白 (Pax transactivation-domain interacting 收稿日期修回日期基金项目国家自然科学基金( ) 作者简介曹碗君, 男 (1990 年 ), 汉族, 硕士研究生 * 通讯作者 (To whom correspondence should be addressed): lizhenhe@fmmu.edu.cn protein,ptip) 关系密切, 同为 MLL3/4 复合体内重要组成部分而得名 ; 他们通过免疫共沉淀实验证实,PTIP 和 PA1 只存在于 MLL3/4 复合体中 [2] 人类 PA1 蛋白包含 254 个氨基酸, 而小鼠 PA1 则由 253 个氨基酸序列构成, 两者在氨基酸水平有 87% 序列一致 Jing Liang 等采取 Northern blot 方法, 对人心脏脑胎盘肺骨骼肌肝脏和胰腺等器官进行了检测, 发现这些器官中均存在 PA1, 说明 PA1 广泛表达在人体的各个器官 [3] 然而,PA1 在雄性生殖系统中的表达及其功能尚无报道本文采用 PCR 免疫组织化学染色以及荧光双标技术, 检测 PA1 在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位, 为以后进一步深入探究其在雄性生殖系统中的功能及作用机制打下基础

(5μm) 用于免疫组织化学染色 2 主要试剂 RNA 提取液 Trizol plus, 反转录试剂盒 Prime Script TM RT reagent Kit, Premix Taq 以及 SYBR Primix Ex Taq 均购自日本 Takara 公司柠檬酸盐抗原修复液购自西安科昊生物有限公司兔抗小鼠 PA1 多克隆抗体 (NBP1 89792) 购自美国 NOVUS 公司,

2 第 1 期曹碗君等. PTIP 相关蛋白 1 在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位 9 材料与方法 1 组织材料 SPF 级 C57 小鼠, 出生后 1w 2w 4w 8w 12w 18w 及 24w 各 4 只, 购自第四军医大学实验动物中心 2% 苯戊巴比妥以 45 mg/kg 体重腹腔麻醉, 取左侧睾丸用于提取 RNA 进行 PCR 分析, 右侧睾丸取出后立即置于 4% 多聚甲醛中固定 24h, 石蜡包埋, 切片 (5μm) 用于免疫组织化学染色 2 主要试剂 RNA 提取液 Trizol plus, 反转录试剂盒 Prime Script TM RT reagent Kit, Premix Taq 以及 SYBR Primix Ex Taq 均购自日本 Takara 公司柠檬酸盐抗原修复液购自西安科昊生物有限公司兔抗小鼠 PA1 多克隆抗体 (NBP ) 购自美国 NOVUS 公司, 生物素标记的抗兔 IgG SABC 检测试剂盒 (SP- 9000) 购自北京中杉金桥生物技术有限公司小鼠抗小鼠 Sox-9 单克隆抗体 (SC ) 购自美国 Santa Cruz 公司, 小鼠抗小鼠 AMHR2 单克隆抗体 (ab-64762) 购自 Abcam 公司,Alexa Fluor 594 标记抗兔 IgG,Alexa Fluor 488 标记抗小鼠 IgG 均购自美国 Molecular Probe 公司 3 RT-PCR 新鲜睾丸组织 100mg, 剪碎研磨用 Trizol 法提取总 RNA, 在 20μL 体系中加入 1μg RNA, 用反转录试剂盒, 以 37 15min 85 5s 反应条件合成 cdna 第一链, 以新合成的 cdna 为模板进 PCR, 扩增 PA1 基因,PA1 上游引物为 :5 -TGG CCC AAA CCT AAA CAT TAG-3 ; 下游引物为 :5 -TTA TGG CGC TTC ATG TCT GAG-3, 预计产物大小为 200bp,25μL 的反应体系, 反应条件为 :94 30s,55 30s,72 60s,30 个循环, 最后 72 延伸 10min 为了检测各 RNA 样品完整性和反转录效率之间的差别, 将待测样品中的 β-actin 基因设为内参照 PCR 产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 4 实时定量 PCR 以 cdna 为模板用 SYBR Premix Ex Taq 进行实时荧光定量分析, 反应条件为 95 30s;95 30s, 60 30s,40 个循环具体操作均按 Takara 说明书进行每次扩增均设目的基因组和内参基因组及空白对照组, 通过对每个反应管内荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数 ( 即 CT 值 ), 按指数扩增的规律计算出组织中 PA1 mrna 的相对表达量 5 ABC 法免疫组织化学染色切片常规脱蜡至水后柠檬酸盐缓冲液 (ph 6.0) 微波修复 (100 C 10min),0.3% 甲醇 -H 2 O 2 中室温 1h, 封闭内源性过氧化物酶 ; 加一抗 ( 兔抗 PA1, 1:200)4 孵育过夜, 生物素标记二抗 ( 抗兔 IgG, 1:400) 室温孵育 3h,ABC 复合物 (1:400) 室温孵育 1h, 镜下掌握 DAB 呈色, 随后脱水透明封片用 PBS 代替一抗作为阴性对照 6 免疫荧光双标染色切片常规脱蜡至水后柠檬酸盐缓冲液 (ph 6.0) 微波修复 (100 10min),1%BSA 封闭 1h; 兔抗 PA1(1:200) 与小鼠抗 Sox-9(1:400) 混合一抗, 4 孵育过夜,Alexa Fluor594 标记抗兔 IgG(1:400) 与 Alexa Fluor488 标记抗小鼠 IgG(1:400) 混合二抗室温孵育 3h,50% 甘油封片用一抗稀释液代替一抗作为阴性对照结果 1 PA1 mrna 在小鼠睾丸各个发育阶段的表达对各周龄小鼠睾丸提取的 mrna 进行 RT-PCR 分析, 结果显示在小鼠睾丸发育不同阶段均有 PA1 mrna 的表达, 且条带大小与设计方案一致 ( 图 1) PA1 mrna 在 1w 小鼠睾丸中的表达水平较高, 在 2w 时达到高峰, 随后 (4w) 逐渐降低, 待 8w 后维持在稳定水平 ( 图 2) 图 1 PA1 mrna 在小鼠睾丸各个发育阶段表达的 RT-PCR 检测 Fig. 1 RT-PCR detection for PA1 mrna expression in various developmental stages of mouse testis 图 2 PA1 mrna 在小鼠睾丸不同发育阶段表达变化的实时定量 PCR 检测 Fig. 2 Quantitative analysis of PA1 mrna expression during mouse testis development measured by qrt- PCR

10 第 27 卷中国组织化学与细胞化学杂志 2 PA1 蛋白在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的定位及间质细胞外 PA1 还表达于初级精母细胞圆形精为进一步了解 PA1 在不同发育阶段小鼠睾丸组子细胞的胞核此外在精子头部也有表达图 2 织中的定位我们利用免疫组织化学法染色观察了免疫荧光双标检测显示红色荧光信号标记的 PA1 PA1 在不同周龄小鼠睾丸的表达

间质细胞支持细胞圆形精子细胞精子比例尺 50 μm Fig. 3 Immunohistochemical detection of PA1 expression in various developmental stages of mouse testes. matogonia; : primary spermatocyte.

3 10 第 27 卷中国组织化学与细胞化学杂志 2 PA1 蛋白在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的定位及间质细胞外 PA1 还表达于初级精母细胞圆形精为进一步了解 PA1 在不同发育阶段小鼠睾丸组子细胞的胞核此外在精子头部也有表达图 2 织中的定位我们利用免疫组织化学法染色观察了免疫荧光双标检测显示红色荧光信号标记的 PA1 PA1 在不同周龄小鼠睾丸的表达 PA1 在 1w 2w 与绿色荧光信号标记的支持细胞标志物 Sox-9 以及 4w 8w 小鼠生精小管中的精原细胞和支持细胞以及间质细胞标志物 AMHR2 共存进一步证实 PA1 在间质细胞中均有表达主要表达于细胞核中在 4w 支持细胞和间质细胞中有表达图 4 和 8w 小鼠睾丸组织内除了精原细胞支持细胞以图 3 小鼠不同发育阶段睾丸组织 PA1 表达的免疫组织化学染色间质细胞支持细胞圆形精子细胞精子比例尺 50 μm Fig. 3 Immunohistochemical detection of PA1 expression in various developmental stages of mouse testes. matogonia; : primary spermatocyte. : round spermatid; 精原细胞 : Leydig cell; : 初级精母细胞 : Sertoli cell; : sper- : sperm; scale bar: 50 μm 图 4 PA1 在 8w 小鼠睾丸间质细胞和支持细胞中表达免疫荧光双标检测比例尺 20 μm Fig. 4 Double immunofluorescence staining detection of PA1 expression (red) in Sertoli cells (top, cell marker Sox-9 in green) and Leydig cells (bottom, cell marker AMHR2 in green) in 8w mouse testis. Scale bar, 20 μm

4 第 1 期曹碗君等. PTIP 相关蛋白 1 在小鼠睾丸发育过程中的表达及定位 11 讨论哺乳动物生精细胞的分化是一个复杂的过程, 从精原细胞开始分化到精子的形成涉及许多复杂的分子机制, 其中包括 DNA 损伤修复及重组, 组蛋白的甲基化磷酸化修饰以及染色质的浓缩 [4] 研究发现,PTIP 敲除小鼠由于组蛋白 H3K4 甲基转移酶活性减弱, 小鼠睾丸发生萎缩, 各级生精细胞发育停滞 [5], 提示 H3K4 甲基化与生精细胞的生长分化有关 PA1 和 PTIP 同为 MLL3/4 复合体的核心组件, 同时 PA1 也被认为参与完成组蛋白 H3K4 甲基转移功能 [2], 因此我们对 PA1 在睾丸发育中的表达及定位进行研究, 为进一步探究其在生精细胞生长分化中的功能及作用打下基础小鼠出生 2w 后睾丸中精原细胞开始分化, 此时小鼠体内的雄激素分泌水平亦达到高峰,5w 时睾丸开始产生成熟精子,8w 时达到性成熟 [6] 我们通过 RT-PCR 和定量 PCR 检测到 PA1 mrna 在小鼠睾丸各个发育阶段均有表达, 在 2w 时表达最高, 随后降低,8w 后维持在一个稳定水平, 表明 PA1 可能通过调节雄激素的分泌, 参与生精细胞的生长和分化已知睾丸间质细胞是产生雄激素的场所, 免疫组织化学染色显示 PA1 在小鼠各个发育阶段的间质细胞中均有表达, 进一步说明 PA1 参与调节间质细胞分泌雄激素间质细胞分泌雄激素还受支持细胞的调节, 本研究发现 PA1 在睾丸各个发育阶段支持细胞中均有表达支持细胞可通过雄激素受体 (androgen receptor, AR) 影响自身内部的抗苗勒管激素 (anti-müllerian hormone, AMH) 分泌, 从而间接调节间质细胞分泌雄激素 [7], 而 PA1 可以竞争性抑制 AR 的转录活性 [8] 因此我们推测 PA1 在支持细胞中可能通过竞争性抑制 AR 的转录活性间接调节间质细胞分泌雄激素, 从而维持生精小管内外雄激素的平衡, 保证生精细胞的正常分化另有研究发现, 支持细胞可通过分泌骨形成蛋白 -2(bone morphogenetic protein 2, BMP2) 对精原细胞的分化进行调控 [10], Rossella Puslisi 等人在体外培养的小鼠睾丸碎片中添加 BMP2 后发现精原细胞增殖能力显著提高, 表明 BMP2 对精原细胞的增殖有积极作用 [11] ; 此外在 PA1 敲除的胚胎中 BMP2 的表达显著降低 [9] 这些研究说明 PA1 可能作为上游分子参与 BMP2 对生精细胞的增殖分化的调控因此我们推测 PA1 在支持细胞中的表达还可能通过调节 BMP2 的分泌, 从而间接影响精原细胞的分化我们通过免疫组织化学染色观察到 PA1 在小鼠睾丸各个发育阶段生精细胞均有表达, 提示 PA1 作为 MLL3/4 复合体的构成元件参与调节组蛋白 H3K4 甲基化, 从而调节精原细胞向精子分化睾丸中生精细胞对电离辐射刺激相当敏感 [12],5Gy 的 γ 射线全身照射后 3 天, 小鼠生精细胞死亡殆尽 [13] 电离辐射可导致细胞 DNA 损伤,Gong 等人发现 293T 细胞中 PA1 的缺失会导致细胞对电离辐射敏感性增强, 表明 PA1 在调节细胞 DNA 损伤后的修复中亦发挥着重要作用 [14] 因此 PA1 在睾丸中的表达可能还参与细胞 DNA 的损伤修复同时,Takeshita 等的研究发现 PA1 表达升高的乳腺癌患者预后较好, 表明 PA1 还可能和肿瘤的预后相关 [15] 然而 PA1 和生殖系统肿瘤的关系还有待进一步研究综上所述, PA1 在睾丸各个发育阶段的广泛表达提示 PA1 可能通过调节间质细胞分泌雄激素, 在支持细胞作用下维持生精小管中雄激素的平衡, 另外通过 BMP2 调节生精细胞的生殖和分化, 具体机制还有待进一步研究参考文献 [1] Mohan M, Herz HM, Smith ER, et al. The COMPASS family of H3K4 methylases in Drosophila. Mol Cell Biol, 2011, 31(21): [2] Cho YW, Hong T, Hong S, et al. PTIP associates with MLL3- and MLL4-containing histone h3 lysine 4 methyltransferase complex. J Biol Chem, 2007, 282(28): [3] Liang J, Zhang H, Zhang Y, et al. GAS, a new glutamate-rich protein, interacts differentially with SRCs and is involved in oestrogen receptor function. Embo Rep, 2009, 10(1): [4] Sasaki H, Matsui Y. Epigenetic events in mammalian germcell development: Reprogramming and beyond. Nat Rev Genet, 2008, 9(2): [5] Schwab KR, Smith GD, Dressler GR. Arrested spermatogenesis and evidence for DNA damage in PTIP mutant testes. Dev Biol, 2013, 373(1): [6] Hai Y, Hou J, Liu Y, et al. The roles and regulation of Sertoli cells in fate determinations of spermatogonial stem cells and spermatogenesis. Semin Cell Dev Biol, 2014, 29:

5 中国组织化学与细胞化学杂志 12 第 27 卷 [7] Chang C, Chen YT, Yeh SD, et al. Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(18): [8] Zhang Z, Sun Y, Cho YW, et al. PA1 protein, a new competitive decelerator acting at more than one step to impede glucocorticoid receptor-mediated transactivation. J Biol Chem, 2013, 288(1): [9] Kumar A, Lualdi M, Loncarek J, et al. Loss of function of mouse Pax-Interacting Protein 1-associated glutamate rich protein 1a (Pagr1a) leads to reduced Bmp2 expression and defects in chorion and amnion development. Dev Dynam, 2014, 243(7): [10] Puglisi R, Montanari M, Chiarella P, et al. Regulatory role of BMP2 and BMP7 in spermatogonia and Sertoli cell proliferation in the immature mouse. Eur J Endocrinol, 2004, 151(4): [11] Itman C, Wong C, Whiley PAF, et al. TGFβ superfamily signalling regulators are differentially expressed in the developing and adult mouse testis. Spermatogenesis, 2011, 1(1): [12] Hou W, Zhao J, Li Z, et al. Effects of electromagnetic pulse irradiation on the mouse blood-testicle barrier. Urology, 2012, 80(1): [13] Khan S, Adhikari JS, Rizvi MA, et al. Radioprotective potential of melatonin against ⁶⁰Co γ-ray-induced testicular injury in male C57BL/6 mice. J Biomed Sci, 2015, 22: 61. [14] Gong Z, Cho YW, Kim JE, et al. Accumulation of pax2 transactivation domain interaction protein (PTIP) at sites of DNA breaks via RNF8-dependent pathway is required for cell survival after DNA damage. J Biol Chem, 2009, 284(11): [15] Takeshita T, Yamamoto-Ibusuki M, Yamamoto Y, et al. PTIP Associated protein 1, PA1, is an independent prognostic factor for lymph node negative breast cancer. PLoS One, 2013, 8(11): e80552.

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吉林农业大学学报２０１６３８１８７９１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｈｔｔｐｘｕｅｂａｏｊｌａｕｅｄｕｃｎＥｍａｉｌｊｌｎｄｘｂｖｉｐｓｉｎａｃｏｍ神经生长因子ｍｒｎａ在鹅等级前卵泡中的表达刘璐璐隋玉健朱海洋武惠岩杨辉孙永峰吉林农业大学动物科学技术学院长春１３０１１８