期霍书英等去精索上神经和精索下神经对大鼠睾丸发育和精子发生的影响 &)4( +5 ')):)'(3 ) 5% +3)4 %5( ) )+&+%5)45)+5&+)+) 5(+4(5 *% +'$,&5)+5& '%4) )4:%5&( )'34('&)4%5&( +) & &)4( +5 '

Size: px

Start display at page:

Download "期霍书英等去精索上神经和精索下神经对大鼠睾丸发育和精子发生的影响 &)4( +5 ')):)'(3 ) 5% +3)4 %5( ) )+&+%5)45)+5&+)+) 5(+4(5 *% +'$,&5)+5& '%4) )4:%5&( )'34('&)4%5&( +) & &)4( +5 '"

雹马佳
7 years ago
Views:

1 畜牧兽医学报去精索上神经 // 和精索下神经 4/ 对大鼠睾丸发育和精子发生的影响霍书英马爱进武现军李玉荣河北农业大学动物科技学院保定 # 中国标准化研究院北京摘要本试验旨在研究睾丸神经是否参与调控睾丸的发育和精子的发生过程大鼠出生后 (+5 %5%'%, 切断睾丸精索上神经 3)4&(4+3)4 %5& )4:) 和精索下神经 )4&(4+3)4 %5& )4:) 然后分别在和时取样分析结果显示睾丸去神经不影响时睾丸质量和睾丸大小 + 但使时的睾丸质量和睾丸尺寸极显著减小附睾尾精子数极显著降低 + 增殖细胞核抗原 4('&)4%5& )' ')%4% 5& ) 免疫组织化学染色显示睾丸去神经不影响时生殖细胞的增殖但却影响时生殖细胞的增殖另外结果显示睾丸去神经明显降低时睾丸羟胆固醇脱氢酶,4(, +5)4('),4( ) %+). 的表达 + 并明显抑制时. 和雄激素结合蛋白 4( ) & & 34(5)& 表达 + 以及黄体生成素受体 5)& & & (4 ( )4))35(4. 和卵泡刺激素受体 ('&')+5& '%5& (4 ( )4))35(4. 表达 + 结果表明支配睾丸的神经和主要影响睾丸下降后以及青春期睾丸曲细精管的发育和精子的发生关键词睾丸去神经细胞增殖曲细精管发育精子发生中图分类号 # 文献标识码文章编号 # %)&' % %$ )' ' //,4/ ' %&) $ % % '#% ),/#%$)'% %&& ).,& & & B &% 4( %%&' (* # # % : *$ (&)$) )) 3)4& ) 5%+ ( 5)5(4):)%' )5 )45 )+ 3)4&(4+3)4 %5& )4:) % 5 )& )4&(4+3)4 %5& )4:) )4)& :(':)& 4) '%5& 5)+5& '%4):)'(3 ) 5% +3)4 %5( ) )+&+ )34)+) 5+5,%+5 +)+& )5(54% +)55 ) % (4%5+( % 5 ) % %', ) % )+( % )4)+ '5+) ( +54%5)5 %55)+5& '%4 ) )4:%5&( %:) ((:&( +& ' ) )5(5)+5&+ %++( 5+& &&% 5',4) )5)+5&+ %++% %)3&&, %'+3)4 ( 5+( + 4('&)4%5& )' ')%4 % 5& ) & ( &+5( ) &+54,+5%& & 34(:)5 %55 )) )4:%5&( % (& ' ) )( 5 )34('&)4%4&( ( )4 )'+( 5(:&( +',& &&5)5 )34('&)4%5&( ( % &5&( 4)+ '5++ ()5 %55)+5&+) )4:%5&( +& &&% 5',)4)%+)5)+5&+,4(, +5)4('),4( ) %+). ( +% +& &&% 5',)4)%+)5)+5&+. % % 4( ) & & 34(5)& '):)'++ ' 5)& & & (4 ( )4))35(4. % ('&')+5& '%5& (4 ( )4))35(4. '):)'+( + )+)4)+ '5++ )+55 %55 )5)+5& '%4 )4:)+ 33',3'%,+% & 3(45% 54(')& + 33(45& +) & 收稿日期 ## 作者简介霍书英 # 女河北灵寿人讲师博士主要从事动物生理学教学和神经内分泌研究通讯作者霍书英 )'#$ %&' (+,& (

2 期霍书英等去精索上神经和精索下神经对大鼠睾丸发育和精子发生的影响 &)4( +5 ')):)'(3 ) 5% +3)4 %5( ) )+&+%5)45)+5&+)+) 5(+4(5 *% +'$,&5)+5& '%4) )4:%5&( )'34('&)4%5&( +) & &)4( +5 ')):)'(3 ) 5+3)4 %5( ) )+&+ 内分泌调节早已被公认为睾丸功能的主要调节机制但研究发现存在于睾丸被膜间质及血管系统中丰富的神经纤维对睾丸活动也具有非常重要的生理调节功能支配睾丸的精索上神经 3)4&(4 +3)4 %5& )4:) 起源于肠系膜和肾丛沿睾丸动脉进入睾丸而精索下神经 )4&(4+3)4 %5& )4:) 起源于盆神经丛和肠系膜下神经丛通过睾丸后悬韧带进入睾丸下极研究发现切断睾丸双侧不仅大鼠在应急状态时睾酮分泌增加受到抑制而且还伴随睾丸. 受体数目的下降电刺激血液睾酮浓度增加而且精索静脉去甲肾上腺素输出也增加而电刺激对睾酮分泌和睾丸血流没有明显的 # 影响切除也不会影响精子的发生若双切睾丸的和不仅导致生殖细胞和间质细胞凋亡而且使血清睾酮浓度降低. 水平升高可见精索神经对睾丸生理功能具有很重要的调控作用但大多数研究的是精索神经对成年期睾丸功能的影响至于出生后在睾丸发育过程中和发挥怎样的调控作用国内外文献研究报道的很少睾丸间质细胞和支持细胞的分化增殖发生在出生后左右睾丸下降发生在左右本试验从大鼠出生后切断睾丸的和研究睾丸神经是否参与调控发育期睾丸细胞的分化增殖曲细精管的发育以及精子的发生过程材料和方法 - 动物分组及动物模型的建立动物分组出生的 B&+5%4 雄性大鼠只随机分为组组只左侧睾丸切除和右侧假手术对照组只空白对照动物模型建立将大鼠固定用戊巴比妥钠 B 腹腔注射麻醉解剖显微镜下分离与左精索动脉伴行的切掉一段神经纤维暴露左侧睾丸后悬韧带切断同法分离右侧和但不予切断作为假手术对照空白对照组不做任何处理与手术组大鼠同条件分笼饲养 - 标本采集及试验项目标本采集分别于大鼠和时麻醉处死取出睾丸称重测量睾丸长径后将每侧睾丸切分为两部分一部分快速放入液氮冷冻一部分放入 = 多聚甲醛室温下固定石蜡包埋用相对睾丸质量睾丸净质量体质量和相对睾丸尺寸睾丸长径体质量来评价去神经对睾丸质量和睾丸大小的影响精子计数剥离出一侧附睾尾将其剪碎用生理盐水稀释悬液精子精子计数的方法与红细胞计数方法一致计数室每小方格的体积精子数目 E 个中方格中的精子数?? 稀释倍数? 个睾丸形态学分析包埋好的睾丸组织块厚连续切片苏木精伊红染色显微镜下观察曲细精管的形态和大小去神经对细胞增殖的影响脱蜡水化灭活内源性过氧化物酶后用微波加热进行抗原修复用 = 的羊血清封闭非特异性抗原然后加入稀释的增殖细胞核抗原鼠源单克隆抗体 & % '4& 5 ( &+ 孵育过夜用代替一抗作为阴性对照二抗使用生物素标记的羊抗鼠 // -, ) % 4% &+( 室温孵育三抗使用辣根过氧化物酶标记的链酶亲合素. -, )% 4% &+( 室温孵育用的 & % '4& 显色 & 苏木精复染显微镜下观察并拍片检测去神经对睾丸. 5, 和 *+ 表达的影响液氮研磨组织粉末加入 4& (' 提取总用 '& ( 合成第一条链特异性引物用于取的反转录产物加至反应体系中反应条件 & 然后进入个循环每个循环包括变性 + 不同退火温度退火 +# 延伸 + 循环后 # 延伸 & + 作为内参引物序列和退火温度见表

3 畜牧兽医学报卷表引物序列 ( %$%$&% % % 基因引物序列产物大小 3 退火温度参考文献 /) ) 4& )4+)* ) ) 4( 5+& ) )%'& 5) 3)4%5 4) ))4) ). 5,, *+ + / // // / / / / / / // // // // / // / / /// / / / / // / // / / / / //// / # # 正向引物反向引物 (4%4 ):)4+) 统计分析所有试验均重复次以上数据均用平均值标准差 )% +) 表示数据差异显著性采用软件分析 + 则差异显著产物电泳条带的光密度值用软件 ' 3 %' % )4+(5%4) 分析 /. 作为内参目标基因的相对灰度值用与内参的比值来表示结果 - 睾丸去神经对, 和, 睾丸质量和睾丸大小的影响由图可以看出睾丸去神经不影响时睾丸的质量和大小但使时的睾丸质量和睾丸大小极显著降低 + 去神经组相对睾丸质量与对照组相比降低了倍而相对睾丸大小 D 降低了倍结果表明和对睾丸下降后发育为成熟睾丸具有非常重要的影响 - 去神经对, 睾丸曲细精管和附睾尾精子数的影响睾丸去神经导致时睾丸曲细精管发育异常曲细精管形状不规则生精上皮排列无序很少有成熟的精子细胞在异常的曲细精管中存在大部分曲细精管空泡化图 % 另外睾丸去神经也严重影响了附睾尾精子数量统计结果显示去神经组附睾尾精子数? 与空白对照组? # 相比极显著降低 + 图结果表明睾丸去神经严重影响了睾丸下降后曲细精管的正常发育和精子的发生 -. 去神经对睾丸生殖细胞增殖的影响睾丸去神经不影响时曲细精管生精上皮生殖细胞的增殖但明显影响了时生殖细胞的正常增殖图时假手术对照组阳性生殖细胞在生精上皮上呈规则的同心圆状排列而去神经组睾丸阳性生殖细胞凌乱排列而且空泡化的曲细精管上皮没有阳性生殖细胞表达说明睾丸去神经严重影响了时睾丸正常的生精过程 - 去神经对睾丸. / )* * 和表达的影响结果图显示睾丸去神经显著影响了时. 表达 + 极显著降低了时睾丸. *+ 表达 + 显著降低了 5, 和, 在睾丸的表达 + 说明睾丸和调控睾丸发育过程中. *+5, 和, 表达

4 # 期霍书英等$去精索上神经 -#和精索下神经 -#对大鼠睾丸发育和精子发生的影响 #4( $ % $%# /g-d空白对照组% F.\d假手术对照组% -h -d - 和 - 切除组代表差异极显著. V;T ; U X U +Q W T /g-f.\h= Q $ $% $% $ /g-d = = Q%F.\d;+Q = Q%-h -d= QT ;W +X UW ;- -$ = 图 # 大鼠 P-% 和 P-% 时的 =[+$ GL, 和 GG+b G+F 组相对睾丸质量和相对睾丸直径 E#* M /D M / D ) :=[+%GL, /DG G+b G+ N5 /P-% /DP-% 5 #出生后 '% 时 F.\ 和 -h - 组睾丸曲细精管横切片的 F 染色图W#出生后 '% 时 /g-' F.\ 和 -h -( 组平均每克附睾尾精子数 * 和 Z 图为假手术对照组睾丸. 和 / 图为 -h - 组睾丸 / 和 Z 图为. 和 * 图的局部放大#标尺代表 '%%+& $ % $%#&/g-d空白对照组% F.\d假手术对照组% -h -d - 和 - 切除组代表差异极显著 #+ U W UF.\-h -= Q]Z'% T ;FdW#P;+W UQ + = ; Q D+ U/g-F.\-h -= Q]Z'% Q *Z F.\ ]Z'% $./ -h - ]Z'% /Z +Q U U +.*# $ * i '%%+$ $% $% $ /g-d %F.\d;+Q %-h -dw +X UW ; = - 图出生后 %D 时 L3 染色结果与每克附睾尾精子数 E* N :L3/D /N) : ) 5 /P-% 5

5 #4) 畜牧兽医学报 )# 卷. 图和 / 图分别来自 ]Z#' 和 ]Z'% 时假手术对照组睾丸* 图和 Z 图为 ]Z#' 和 ]Z'% 时 -h - 切神经组睾丸标尺代表 '%%+&F.\d假手术对照组% -h -d - 和 - 切除组./ F.\ ]Z#']Z'%*Z -h - ]Z#']Z'% $ * i '%%+$ F.\d ;+Q %-h -dw +X UW ;- = 图 FGL, 和 GG+b G+ 切神经组出生后 %D 和 %D 睾丸曲细精管 P=+, 阳性生殖细胞免疫组化图 EF))N/ X / :P=+, K D ) / ) / : N N N : GL, /DG G+b G+ N5 /P-% /DP-% - i( '$% $%' $% $%&/g-d空白对照组% F.\d假手术对照组% -h -d - 和 - 切除组 - i( 'Q = Q%$% $%' $% $% $ /g-d = Q%F.\d;+Q = Q%-h -= QdW +X UW ;- = 图 $GG+b G+$ GL, 和 =[+F 组睾丸 P-% 和 P-% 时 F KLG-#$:;$$&B 和 &B )*+,的表达 E$345 / M :F KLG-#%:;$%&B /D&B )*+, / G G+b G+%GL, /D=[+ N5 /P-% /DP-%

6 期霍书英等去精索上神经和精索下神经对大鼠睾丸发育和精子发生的影响. 讨论大鼠出生后睾丸去神经显著影响了睾丸曲细精管的正常发育和精子的发生以及. *+5, 和, 的正常表达说明在整个睾丸发育过程中支配睾丸的和发挥着非常重要的作用尤其是睾丸下降后和参与调控睾丸曲细精管发育精子发生的作用更为明显非常令人惊奇的是出生后睾丸去神经不影响时睾丸质量和睾丸大小但使时睾丸质量和睾丸大小极显著降低说明睾丸下降前睾丸神经并非睾丸发育的关键调控因素尤其是去神经后睾丸依然能完成下降过程说明这一时期睾丸的发育以及睾丸下降过程雄激素降钙素基因相关肽 / 睾丸 ),& 细胞胰岛素样因子等发挥重要的作用睾丸下降后没有睾丸神经的支配曲细精管发育异常空泡化生精上皮生殖细胞排列紊乱很少有成熟的精子细胞存在说明睾丸神经在睾丸发育成熟的这一时期发挥了至关重要的调控作用失去神经支配睾丸的脉管系统很难通过改变血流来调节睾丸温度以适应外界环境的变化另外睾丸神经对睾丸发育具有长期慢性 # 的营养作用有人报道双切成年大鼠睾丸精索神经对睾丸质量精子发生和血液睾酮浓度没有显著的影响进一步说明睾丸神经对发育期睾丸的发育和精子发生的调控作用比成年期更重要切神经后导致附睾尾精子数急剧降低说明曲细精管精子的发生过程发生异常我们通过免疫染色发现切神经后影响了睾丸生精上皮精原细胞和初级精母细胞向精子细胞的发育从而影响了附睾尾成熟精子的数量虽然出生后睾丸去神经不影响时睾丸质量和睾丸大小但结果显示已显著影响了睾丸. 表达大鼠间质细胞的分化增殖发生在左右而. 酶的表达是间质细胞分化的一个重要标志所以睾丸去神经已显著影响了睾丸间质细胞的分化从而必然会影响到成年期睾丸功能性间质细胞的数量而我们时睾丸的结果也证明了这一点切神经组睾丸. 表达极显著降低说明睾丸切神经严重影响了成年期睾丸的间质细胞睾酮分泌功能另外时切神经组睾丸 *+5, 和, 的表达也显著降低. 和. 通过与睾丸上其相应受体结合分别调节间质细胞类固醇激素的合成和精子的发生过 # 程对于维持曲细精管中高浓度的雄激素水平和精子发生具有重要作用睾丸去神经严重影响了成年期睾丸 *+5, 和, 的正常表达从而影响了. 和. 以及雄激素对睾丸正常发育和精子发生的调控从而导致成年期睾丸曲细精管发育异常和精子发生障碍结论睾丸神经通过影响雄激素生成关键酶的合成以及一些内分泌激素受体的表达参与调控睾丸下降后以及青春期曲细精管的发育和精子的发生过程但睾丸神经与内分泌激素之间的相互作用机制还有待进一步的研究参考文献 - $ ( 3( ) 5+% &+54& 5&( (5 )+3)4 %5& )4:)+% 5 ) )4:)+(5 ) :%+))4) + #% -... )5%' ( (% & )4 & % 3)35&)4 & ( 54& 5&( +(5 ) + 3)4&(4% 5 )& )4&(4+3)4 %5& )4:)+5(5 )& )4:%5&( (5 )5)+5&+& 5 )4%5 $ $.., 3(3,+)5(,% ) &:%+)5(, % & &&55 )5)+ 5& '%4 ) &%+54%5&( 4)+3( +)(5 ) %5 4)4%5 *, $ $ )))5( % )5 && )54)%5 ) 5 ( 5)+5& '%4'(('( % 5)+5(+5)4( )34( 5&( & 4%5+ - #.. )5%' $)5(&'%5)4%') )4:%5&( (5 )& % 5 4)4%55)+5&+( 5)+5& '%4 ( %(54(3& 4))35(4+ % & :&54(% 4( ) 34( 5&( #% / # $ $ )))5+(. %4) %'& )% (4%4) %'& )( 5)+5& '%4'(('( % 3'%+ %5)+5(+5)4( ) ( ) 54%5&( +& % %)+5 ) 5& )4%5+ - # #.B.// B $$ )5%' ) ))5+(5)+5& '%4) )4:%5&( ( +3)4 %5( ) )+&+&

7 畜牧兽医学报卷 5 )34% ) %'),4%5 #% ## / / / / -. / B)5%' 3(3 5(+&+& %') )4 )'+& ),5)+5& '%4) )4:% 5&( % # 4 % # / / /B / / )5%' )34&:%'( 5)+5& '%4& )4:%5&( & )+ %3(35(+&+ ( ),& )'+:&% %+3%+))3) ) 5+& %'& (:)'+ 4 :&:%'3%5 %, 4):)%') * * #. $ / )'&('(,( ),& )'+& 5 )5)+ 5&+,' /$ / )5%' +)%4 (4%5+5) ),& )'+) 5&&%5&( &+(%'5&( % '& )% )+3)&& ):)'(3 ) 5 +# ## $$ $ $ $. -$ $ )5%' )):)'(3 ) 5(4%5 ),& )'34( ) &5(4+' ()++) 5&%'&+' 5)& &+& (4 ( ) - # # / / )5%' ( & ))5+(% %5( & %( 5)+5)+ % +3)4 ( 5+( %') &) - +. $)5+(34(3,'3%4%) ( 5 ) %')4) 34( 5&:)+,+5) #...-. )5%' $)5 (5%4('& +( 5 ) % %)3&&, &+& 4%5+ %', +&+()3&&, %'&( ) &%' %4)4+(4% 5&( &% 5 )) +)), )+ / $ /$ $ $ )5%' $+54( ) 4))35(4%'3 % ) ))&&),) % )+% 4( ) &(+, 5 )+&+& 5 ) ( +)'),& )' -/ # / $ $ $ )5%' $+54( ) 4))35(4) 34)++&( & 4)'%5&( 5(5 )) 34)++&( (' 5)& & & (4 ( )4))35(4%,5( 4( ) ), )+& 4%5(:%4&% ('&')+ */, ### $$ B )5%'$)5+( ( ) (43 ( ) )5& 34(5)& # #( 34& (4&%' ('& '%4 4(5 & 5 ) ( +)(:%4,,/ ' B / $ - )5 %' )% 4( ) & & 34(5)& ) )&+) 34)++)& ( +)5)+5&+ -.. )5%' (++&')& :(':) ) 5(3 & %+)&. # ) 34)++&( & ),,3( &%& 4%534& %4,%+54(,5)+ *, $ $ $. )5 %'.(4 ( %' ( 54('( ) % ' ):)'(3 ) 5 4& 5)+5&+ )+) 5 ) % ' ( 5 4(5 & :&54(4)* &4)+(5 & + '& '&)%5(4% % 4( ) - ### / $ $ $ - $ $ / 4( ) 4))35(4 % %'&5( & ) )4)'%5) 3)35&)& ) 4( +(5 ) ) &5() (4%' )4:) 4& 5)+5& '%4)+) 5& )&5 % (4&( & ( % (54(3&, # $$ '((+ 33',5(5 )5)+5&+% &5+4(')& '(%') % )% 54% +3(45( (4 ( )+ ( +( % /( )+B )+ ))+5&+(' ) (4 %) & 4)++## $ $ )+5& '%4& )4:%5&( &+ ))++%4,(45 )4)+3( +)(3'%+ %5)+5(+5)4( ) '):)'+5(% 5)+54)++ *,. B$ $ / ( &+5( ) &%''(%'& %5&( (34('&)4%5& )' ')%4% 5& ) %+%5(('5(+5, )'34('&)4%5&( & 4() 5% 34& %5)5)+5)+ # $. / B /$ $ )5%' )))5( 4( & ' 5)& & & (4 ( )54)%5 ) 5( % '54%5 ),& )'+ % # # $.$ B $ / /)5%' ('&')+5& '%5& (4 ( )&+4)* &4)(4 5 )& &5&%'3 %+)(+3)4 %5( ) & 4)+5(4%5&( & % '5 4%5+('(& ( %(54(3 & + 334)++&( / ## 编辑朱绯

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人

期 霍书英等 去精索上神经 和精索下神经 对大鼠睾丸发育和精子发生的影响 &)4( +5 ')):)'(3 ) 5% +3)4 %5( ) )+&+%5)45)+5&+)+) 5(+4(5 *% +'$,&5)+5& '%4) )4:%5&( )'34('&)4%5&( +) & &)4( +5 '

期霍书英等去精索上神经和精索下神经对大鼠睾丸发育和精子发生的影响 &)4( +5 ')):)'(3 ) 5% +3)4 %5( ) )+&+%5)45)+5&+)+) 5(+4(5 *% +'$,&5)+5& '%4) )4:%5&( )'34('&)4%5&( +) & &)4( +5 '