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1 1064 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2016, 41(10) DOI: /j.issn M 型磷脂酶 A2 受体及其抗体在乙肝病毒相关性膜性肾病中的临床意义 许向青 1,2, 朱雪婧 1,2, 袁曙光 1,2, 姜文玲 1,2, 夏运成 1,2, 刘虹 1,2, 李军 1,2, 孙林 1,2, 彭佑铭 1,2 1,2, 刘伏友 ( 中南大学 1. 湘雅二医院肾内科 ;2. 肾脏病研究所, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究 M 型磷脂酶 A2 受体 (phospholipase A2 receptor,pla2r) 在乙肝病毒相关性膜性肾病 (hepatitis B virus-associated membranous nephropathy,hbv-mn) 患者血液及肾组织中的表达情况, 并探讨肾组织 PLA2R 阳性表达在乙型肝炎相关性肾小球肾炎 (hepatitis B virus associated glomerulone nephritis,hbv-gn) 患者中的临床和病理特点 方法 : 选取经肾活检确诊的 49 例 HBV-MN 患者 检测血清抗 PLA2R 抗体以及肾组织 PLA2R 的表达, 将患者分为肾组织 PLA2R 表达阳性组和阴性组, 比较两组间临床指标 病理改变 血抗 PLA2R 抗体表达水平的差异 结果 :17 例患者存在肾组织 PLA2R 阳性表达, 其中 10 例患者血清抗 PLA2R 抗体阳性 肾组织阳性组较阴性组 24 h 尿蛋白水平升高, 血白蛋白水平下降, 血清 HbsAg 阳性比例更高 (70.5%), 肾组织 HbsAg 表达比例更高 (71%) 结论: 肾组织 PLA2R 以及血清抗 PLA2R 抗体在 HBV-MN 患者中有一定表达, 其表达可能与 HBV-MN 患者血清以及肾组织中 HbsAg 沉积有关 肾组织 PLA2R 阳性患者肾小球慢性损伤可能相对更重 [ 关键词 ] 乙肝病毒相关性膜性肾病 ; 磷脂酶 A2 受体 ;M 型磷脂酶 A2 受体抗体 Role of M-type phospholipase A2 receptor and its antibody in hepatitis B virus-associated membranous nephropathy XU Xiangqing 1,2, ZHU Xuejing 1,2, YUAN Shuguang 1,2, JIANG Wenling 1,2, XIA Yuncheng 1,2, LIU Hong 1,2, LI Jun 1,2, SUN Lin 1,2, PENG Youming 1,2, LIU Fuyou 1,2 (1. Department of Nephrology, Second Xiangya Hospital; 2. Institute of Nephrology, Central South University, Changsha , China) ABSTRACT Objective: To examine levels of M-type phospholipase A2 receptor (PLA2R) and its antibody in the patients with hepatitis B virus-associated membranous nephropathy (HBV-MN), and to explore the correlation of PLA2R with laboratory parameters and pathological characteristics. Methods: A total of 49 adult patients with biopsy-proved HBV-MN were enrolled in this study. 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 许向青, @qq.com 通信作者 (Corresponding author): 朱雪婧, zhuxuejing @163.com; 袁曙光, sgyuan2015@163.com 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( ); 中南大学自由探索计划 (2012QNZT146) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( ) and Free Explore Plan of Central South University, P. R. China (2012QNZT146).

2 M 型磷脂酶 A2 受体及其抗体在乙肝病毒相关性膜性肾病中的临床意义许向青, 等 1065 Levels of anti-pla2r antibody in serum and PLA2R in renal tissue were detected. Patients were assigned into two groups: a positive PLA2R group and a negative PLA2R group. Differences in laboratory parameters and pathological characteristics were compared between the two groups. Results: Of 49 patients with HBV-MN, 17 had positive PLA2R expression in renal tissues. In the positive PLA2R group, 10 patients were positive for serum anti-pla2r antibody. Patients with positive PLA2R expression in renal tissues showed higher levels of 24 hour urinary protein [(4.6±3.9) g/d], serum HbsAg (70.5%) and renal HbsAg expression (71%), while lower level of serum albumin [(24.1±7.5) g/l] than those of the negative group. Conclusion: PLA2R is expressed in the renal tissues and serum anti-pla2r antibody can be detected in some HBV-MN patients. Positive PLA2R expression in renal tissue might be related to HbsAg deposition in serum and renal tissues. Patients with positive PLA2R expression in renal tissue have more severe glomerular sclerosis. KEY WORDS hepatitis B virus-associated membranous nephropathy; M-type phospholipase A2 receptor; phospholipase A2 receptor antibody 乙型肝炎相关性肾小球肾炎 (hepatitis B virus associated glomerulonephritis,hbv-gn) 是指由乙型肝 炎病毒 (hepatitis B virus,hbv) 直接或间接诱发肾小 球损伤而引起的肾小球肾炎 其原因有以下几点 : 1)HBV 循环免疫复合物, 即 HBV 的抗原 (HBsAg, HBeAg,HBcAg) 和相应的抗体结合, 随血液沉积于 肾小球或肾小管, 引起肾脏病变 ; 2)HBV 直接感染 肾脏的细胞 ;3) HBV 感染引发免疫功能失调, 造成肾 损伤 [1-3] 膜性肾病 (membranous nephropathy,mn) 是 肾病综合征最主要的病理类型之一, 可分为特发性 膜性肾病 (idiopathic membranous nephropathy,imn) 和 继发性膜性肾病 (secondary membranous nephropathy, SMN) 而 MN 是最常见的 HBV-GN 病理类型, 且临床 症状与病理存在密切关系, 而这种乙肝相关性膜性 病变属于 SMN 中最主要的类型之一 M 型磷脂酶 A2 受体 (phospholipase A2 receptor, PLA2R) 属于 I 型跨膜蛋白, 是 C 型外源性凝集素超家 族 - 甘露糖受体家族中的一员 M 型 PLA2R 被认为是 成人自身免疫性 IMN 中一个主要靶向性的足细胞抗 原 [4] [5-6] 但研究发现 PLA2R 在 IMN 和部分 SMN 中表 达, 而且与病情活动度有所关联 对于肾组织 PLA2R 的表达是否为鉴别 IMN 与 SMN 的可靠指标逐渐成为 研究热点 目前关于肾组织 PLA2R 在 SMN HBV-GN 中 的表达 相关临床特点及其意义, 尚不清楚 本研究将乙肝相关性膜性肾病 (hepatitis B virus- associated membranous nephropathy,hbv-mn) 患者分 为肾组织 PLA2R 表达阳性组和肾组织 PLA2R 表达阴性 组, 比较两组间临床指标 病理指标 血清抗 PLA2R 抗体表达水平之间的差别, 旨在研究 PLA2R 在 HBV- MN 患者肾组织中的表达情况, 并探讨肾组织 PLA2R 阳性表达在 HBV-GN 患者临床以及病理特点, 为肾组织 PLA2R 阳性表达在乙肝相关性肾炎中的意义, 提供理论依据 1 对象与方法 1.1 对象和分组选择 2014 年 1 月至 2015 年 3 月在中南大学湘雅二医院肾内科住院患者中经肾活检明确诊断为 HBV-MN 的患者 49 例, 其中男 35 例, 女 14 例, 中位年龄 38.9 岁 所有患者具有完整的临床资料及肾脏病理活检资料, 且经两位以上的相关肾脏病理专家统一重新阅片确诊, 同时排除其他继发性肾病如自身免疫性疾病 恶性肿瘤等因素 [3], 且近半年无手术史 根据 1995 年 WHO 拟定的肾小球疾病形态学标准, 其诊断标准为 :1) 肾组织切片中见 HBV 抗原 ;2) 血清 HBV 标志物阳性 ;3) 肾组织病理表现为 MN 根据肾组织活检标本 PLA2R 染色的阳性结果分为两组 : 肾组织 PLA2R 阳性组及肾组织 PLA2R 阴性组 1.2 主要试剂抗 PLA2R1 抗体 ( 兔抗人, 间接免疫荧光法 ) 试剂为美国 Sigma 公司产品, 二抗为 ALexa FLuor488 羊抗兔 IgG 抗体试剂系美国生命技术公司产品 ; 血 PLA2R 抗体 ELISA 检测试剂盒系德国欧蒙医学实验诊断股份公司产品

3 1066 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(10) 方法 病理检查患者行肾组织活检穿刺, 其肾组织活检标本行病理检查以及免疫荧光染色, 常规光镜检查包括苏木精 - 伊红染色 (hematoxylin-eosin staining,he), Masson 染色, 过碘酸六胺银染色 (periodic acid-silver metheramine,pasm), 过碘酸雪夫染色 (periodic acid- Schiff stain,pas) 及刚果红染色 5 种染色, 并以乙型肝炎免疫组织化学 ( 免疫组化 ) 染色 (ABC 法 ) 检查肾组织 中的 HbeAg,HbsAg 及 HbcAg 的表达情况 采用间接免疫荧光染色检测肾组织 PLA2R 的表达 ELISA 法检测血清抗 PLA2R 抗体的水平 临床指标的检查实验室检查包括血常规, 肾功能, 血白蛋白, 尿沉渣,24 h 尿蛋白定量, 乙肝 5 项 ( 抗 -HBc, 抗 -HBs,HBsAg, 抗 -HBe,HBeAg),HBV-DNA, 免疫球蛋白与补体 (IgG,IgA,IgM,C3,C4) 及免疫全套 ( 表 1) 行肾脏 B 超检查等 表 1 两组主要临床指标的比较 Table 1 Comparison of clinical manifestation between the 2 groups 组别 n 年龄 / 岁 性别 ( 女 / 男 ) 24 h 尿蛋白 / 血肌酐 / 血清 HbsAg 阳性 / 血白蛋白 /(g/l) (g/d) (μmol/l) 例 PLA2R 阳性组 ±14.3* 5/12 4.6±3.9* 24.1±7.5* 98.1± PLA2R 阴性组 ±13.6 9/23 2.7± ± ± 组别 血清 HbeAg 阳性 / 例 血清乙肝 DNA 滴度阴性例数 血红蛋白 /(g/l) 血清红细胞计数 /L 1 血清 IgG/(g/L) PLA2R 阳性组 ± ± ±4.8 PLA2R 阴性组 ± ± ±3.3 与 PLA2R 阴性组相比,*P< 统计学处理采用 SPSS 22.0 软件进行分析, 各组实验数据计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 计数资料以百分率表示, 两组间单因素分析采用 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 两组患者主要临床指标比较 49 例患者中 17 例肾组织 PLA2R 阳性表达 ( 图 1), 免疫荧光可见沿毛细血管袢呈颗粒样沉积 肾组织 PLA2R 阳性组的平均年龄和 24 h 尿蛋白明显高于 PLA2R 阴性组 (P<0.05), 血白蛋白明显低于 PLA2R 阴性组 (P<0.05, 表 1) 2.2 肾组织乙肝标志物在两组患者中的表达在肾组织 PLA2R 阳性组中 HbsAg 阳性 12 例, 肾组织 HbcAg 阳性 8 例, 肾组织 HbeAg 阳性 4 例 ; 在肾组织 PLA2R 阴性组中肾组织 HbsAg 阳性 17 例, 肾组织 HbcAg 阳性 20 例, 肾组织 HbeAg 阳性 7 例 图 1 肾组织 PLA2R 阳性表达 ( 免疫荧光染色, 200) Figure 1 Positive expression of PLA2R in renal tissues (immunofluorescent staining, 200) PLA2R deposited in the glomerular capillary loops 2.3 两组患者的病理特征在肾组织 PLA2R 阳性组中, 肾小球球性硬化比例以及肾小动脉硬化比例较阴性组高, 但差异无统

4 M 型磷脂酶 A2 受体及其抗体在乙肝病毒相关性膜性肾病中的临床意义许向青, 等 1067 计学意义 (P>0.05); 在肾组织 PLA2R 阴性组中肾小球节段硬化 细胞性新月体形成 系膜细胞增生 肾小管萎缩及肾间质纤维化的比例均较肾组织 PLA2R 阳性组高, 但两组间差异亦无统计学意义 (P>0.05, 表 2) 2.4 两组患者血清抗 PLA2R 抗体阳性情况在 17 例肾组织 PLA2R 阳性组中,10 例患者血清抗 PLA2R 抗体阳性 ; 而在 32 例肾组织 PLA2R 阴性组中, 无 1 例患者血清抗 PLA2R 抗体阳性 表 2 两组患者的病理特征 Table 2 Pathological characteristics in PLA2R positive and PLA2R negative groups 组别 n 肾小球球性硬化 /% 肾小球节段硬化 /% 细胞性新月体形成 /[ 例 (%)] PLA2R 阳性组 ± ±6.87 3(17.65) PLA2R 阴性组 ± ± (31.25) 组别 系膜细胞增生 /[ 例 (%)] 肾小管萎缩 /% 肾间质纤维化 /% 肾小动脉硬化 /[ 例 (%)] PLA2R 阳性组 11(64.70) 20.59± ± (70.6) PLA2R 阴性组 22(68.75) 23.40± ± (50.0) 3 讨论在本研究中,49 例 HBV-MN 患者中 17 例肾组织 PLA2R 阳性表达, 可见肾组织 PLA2R 并非完全是 IMN 的生物标志物, 在 HBV-MN 中也有较大比例的表达 本次研究在 HBV-GN 患者中, 挑选出 SMN 病理改变的患者, 观察其肾组织 PLA2R 表达阳性或者阴性患者在各项指标之间的差异, 探讨 PLA2R 在 HBV-MN 中的意义 肾组织 PLA2R 阳性患者较肾组织 PLA2R 阴性患者年龄偏高 24 h 尿蛋白定量更高 血白蛋白更低 血清乙肝 DNA 滴度比例更高 在性别比例上, 总比例男性明显偏高, 而在两组之间男女比例差别不明显 值得特别注意的是, 在肾组织 PLA2R 阳性患者中, 血清 HbsAg 阳性比例明显较阴性组升高, 而与之对应的, 在肾组织中同样以 HbsAg 阳性为主 HBV 病毒属于肝脱氧核糖核酸病毒科 而在 HBV 大 中和小 3 种表面蛋白中, 小表面蛋白即 HbsAg, 其分子质量最小 [7] 故推测, 因 HbsAg 比 HbeAg,HbcAg 分子质量小, 所以更容易通过肾小球基底膜的滤过屏障, 沉积于肾小球基底膜侧, 引起乙肝相关性肾炎的膜性病变, 并引起肾组织 PLA2R 特异性靶抗原暴露, 诱发肾组织 PLA2R 阳性 由于这一系列的病理改变, 肾组织 PLA2R 阳性患者的肾小球滤过屏障破坏较肾组织 PLA2R 阴性患者更为严重, 进而引起临床指标上尿蛋白丢失更多, 血白蛋白水平下降更多 在肾脏病理改变方面, 虽然 PLA2R 阳性组与 PLA2R 阴性组之间差异无统计学意义, 但肾组织 PLA2R 阳性患者较阴性患者肾小球球性硬化比例以及 肾小动脉硬化比例要稍高, 蛋白尿水平同样是肾组 织 PLA2R 阳性患者高于阴性患者, 提示肾组织 PLA2R 阳性患者肾小球慢性损伤的严重程度可能更重, 但 并不能完全排除肾组织 PLA2R 阳性患者平均年龄更大 的影响 在肾组织 PLA2R 阴性患者中, 肾小球节段硬 化比例 肾小管萎缩及肾间质纤维化比例均较阳性 患者要高, 这与临床血肌酐水平并不完全一致, 是 否 HBV-MN 患者肾组织 PLA2R 阴性患者肾脏肾小管肾 间质慢性病理改变更重, 暂无统计学方面的依据 ; 其患者预后是否受肾组织 PLA2R 阳性或者阴性的影 响, 亦需要进一步随访的依据 [5] Qin 等首次发现了在 70% 的 IMN 患者中存在血 清抗 PLA2R 抗体, 但并未在 SMN 患者血液中发现, 因此他们认为血清抗 PLA2R 抗体可用于鉴别 IMN 与 [6] SMN 但近年来研究发现 : 狼疮性肾炎 肿瘤相 关性 MN 以及 HBV-MN 患者血清中, 均偶有血清抗 PLA2R 抗体阳性发现 [8-10] 本研究结果显示 : 在肾组 织 PLA2R 阴性患者中未发现血清抗 PLA2R 抗体阳性, 而在 17 例肾组织 PLA2R 阳性患者中, 有 10 例血清抗 PLA2R 抗体阳性 血清抗 PLA2R 抗体可能随着疾病发 展以及治疗发生变化 [11-13], 而肾组织中的 PLA2R 相对 稳定, 这可能是一部分患者肾组织中 PLA2R 表达阳性 而血清抗体水平阴性的原因 [14-15] 有研究报道 : 在 SMN(HBV-MN 丙型肝炎 病毒 狼疮性肾炎以及恶性肿瘤的 MN) 患者中血清 抗 PLA2R 抗体以及肾组织中均有一定比例的阳性率 在本次研究中,PLA2R 在 HBV-MN 患者血清及肾组织 中的表达均相对既往报道偏高, 其原因一方面与此 次研究专门针对 HBV-MN 患者, 且为单中心小样本量

5 1068 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(10) 研究有关 ; 另一方面, 由于发病机制尚不明确, 因此不排除 HBV-GN 合并 IMN 的可能 综上所述, 肾组织 PLA2R 以及血清抗 PLA2R 抗体不仅表达于 IMN, 在 HBV-MN 患者中也有一定表达, 其表达可能与 HBV-MN 患者血清以及肾组织中 HbsAg 沉积有关 肾组织 PLA2R 阳性患者肾小球损伤相对更重 慢性化倾向更高 参考文献 [1] Ayodele OE, Salako BL, Kadiri S, et al. Hepatitis B virus infection: implications in chronic kidney disease, dialysis and transplantation[ J]. Afr J Med Med Sci, 2006, 35(2): [2] Deng CL, Song XW, Liang HJ, et al. Chronic hepatitis B serum promotes apoptotic damage in human renal tubular cells[ J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(11): [3] Gupta A, Quigg RJ. Glomerular diseases associated with hepatitis B and C[ J]. Adv Chronic Kidney Dis, 2015, 22(5): [4] Hanasaki K. Mammalian phospholipase A2: phospholipase A2 receptor[ J]. Biol Pharm Bull, 2004, 27(8): [5] Qin W, Beck LH Jr, Zeng C, et al. Anti-phospholipase A2 receptor antibody in membranous nephropathy[ J]. J Am Soc Nephrol, 2011, 22(6): [6] Xie Q, Li Y, Xue J, et al. Renal phospholipase A2 receptor in hepatitis B virus-associated membranous nephropathy[ J]. Am J Nephrol, 2015, 41(4/5): [7] Liu X, Chen JM, Lou JL, et al. Correlation between hepatitis B virus DNA levels and diagnostic tests for HBsAg, HBeAg, and PreS1-Ag in chronic hepatitis B[ J]. Genet Mol Res, 2016, 15(2). doi: / gmr [8] Gunnarsson I, Schlumberger W, Rönnelid J. Antibodies to M-type phospholipase A2 receptor (PLA2R) and membranous lupus nephritis[ J]. Am J Kidney Dis, 2012, 59(4): [9] Xavier-Júnior JC, Silva Vdos S, Viero RM. Membranous nephropathy PLA2R+ associated with Chagas disease[ J]. Autops Case Rep, 2015, 5(3): [10] Lönnbro-Widgren J, Ebefors K, Mölne J, et al. Glomerular IgG subclasses in idiopathic and malignancy-associated membranous nephropathy[ J]. Clin Kidney J, 2015, 8(4): [11] Koziol M, Sikora A, Koziol-Montewka M, et al. Preliminary results of research on a new marker of idiopathic membranous nephropathy: anti-pla2r[ J]. Pol Merkur Lekarski, 2014, 36(213): [12] Ronco P, Debiec H. Pathophysiological advances in membranous nephropathy: time for a shift in patient's care[ J]. Lancet, 2015, 385(9981): [13] Wei SY, Wang YX, Li JS, et al. Serum Anti-PLA2R antibody predicts treatment outcome in idiopathic membranous nephropathy[ J]. Am J Nephrol, 2016, 43(2): [14] Hofstra JM, Wetzels JF. Phospholipase A2 receptor antibodies in membranous nephropathy: unresolved issues[ J]. J Am Soc Nephrol, 2014, 25(6): [15] 管音, 李航, 段琳, 等. 血清抗 PLA2R 抗体和肾小球 IgG4 联合检测在膜性肾病诊断中的应用 [ J]. 中华肾脏病杂志, 2015, 31(3): GUAN YIN, LI Hang, DUAN Lin, et al. Serum anti-phospolipase A2 receptor antibodies and glomerular IgG4 in the diagnosis of membranous nephropathy[ J]. Chinese Journal of Nephrology, 2015, 31(3): ( 本文编辑陈丽文 ) 本文引用 : 许向青, 朱雪婧, 袁曙光, 姜文玲, 夏运成, 刘虹, 李军, 孙林, 彭佑铭, 刘伏友. M 型磷脂酶 A2 受体及其抗体在乙肝病毒相关性膜性肾病中的临床意义 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 2016, 41(10): DOI: /j.issn Cite this article as: XU Xiangqing, ZHU Xuejing, YUAN Shuguang, JIANG Wenling, XIA Yuncheng, LIU Hong, LI Jun, SUN Lin, PENG Youming, LIU Fuyou. Role of M-type phospholipase A2 receptor and its antibody in hepatitis B virus-associated membranous nephropathy[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2016, 41(10): DOI: /j.issn

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