北京大学硕士学位论文原创性声明

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勇坪穆
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1 硕士研究生学位论文论文题目 : 颅骨锁骨发育不全患者乳牙牙髓细胞生物学性状研究姓名 : 闫文娟学号 : 院 ( 部 ): 北京大学口腔医学院专业 : 儿童口腔医学导师 : 郑树国教授完成时间 : 二〇一三年五月

2 北京大学硕士学位论文原创性声明

3 北京大学硕士学位论文目录目录摘要... 1 Abstract 第一部分 : 颅骨锁骨发育不全的研究进展... 5 第二部分 : 乳牙牙髓细胞引言正文第一部分 :CCD 患者乳牙牙髓细胞增殖矿化成牙本质分化能力分析 19 材料和方法实验结果讨论第二部分 :CCD 患者乳牙牙髓细胞细胞诱导破骨能力分析材料和方法实验结果讨论全文总结参考文献附录致谢个人简历... 69

4 北京大学硕士学位论文中文摘要中文摘要颅骨锁骨发育不全患者乳牙牙髓细胞生物学性状研究研究生 : 闫文娟导师 : 郑树国教授北京大学口腔医学院儿童口腔医学专业研究目的 : 研究颅骨锁骨发育不全综合征 (Cleidocranial dysplasia,ccd) 患者乳牙牙髓细胞体外培养时的增殖分化矿化能力以及诱导破骨细胞分化能力, 分析 RUNX2 基因突变对乳牙牙髓细胞生物学性状及下游基因蛋白表达的影响方法 : 收集 CCD 患者和正常儿童因治疗需要而拔除的滞留乳牙, 体外培养乳牙牙髓细胞,CCK-8 法绘制细胞生长曲线, 对乳牙牙髓细胞进行矿化诱导培养, 检测碱性磷酸酶活性, 通过 Realtime-PCR 和 Western Blot 从基因水平和蛋白水平检测其矿化能力及成牙本质分化能力乳牙牙髓细胞与 CD14 + 人外周血单个核细胞共培养后通过 TRAP 染色分析其形成抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色阳性细胞的差异, 并通过实时定量聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测破骨相关基因表达的差异结果 : (1) 体外培养 CCD 患者乳牙牙髓细胞, 其增殖能力低于正常儿童 (2)CCD 患者乳牙牙髓细胞体外诱导培养时碱性磷酸酶活性降低 (3)CCD 患者乳牙牙髓细胞的 RUNX2,ALP,DSPP,OPG 基因的表达量弱于正常乳牙牙髓细胞,CCD 患者 DSPP 蛋白表达量低于正常儿童乳牙牙髓细胞 (4)CCD 患者乳牙牙髓细胞及正常儿童乳牙牙髓细胞与 CD14 + 人外周血单个核细胞共培养均可见 TRAP + 细胞, 但 CCD 组 TRAP + 细胞个数明显低于正常组 (5)CCD 患者乳牙牙髓细胞与 CD14 + 人外周血单个核细胞共培养时其破骨细胞相关因子 TRAP CTR 及 CTSK 的表达量相对较低 (6)CCD 患者乳牙牙髓细胞 RANKL 与 OPG 的表达均低于正常乳牙, 且 1

5 北京大学硕士学位论文中文摘要 RANKL 与 OPG 的比值较正常乳牙低结论 : CCD 患者 RUNX2 基因突变后可能造成体外培养的乳牙牙髓细胞增殖能力下降, 矿化能力和早期向成牙本质细胞分化能力降低颅骨锁骨发育不全患者乳牙牙髓细胞体外诱导产生破骨样细胞的能力明显低于正常乳牙, 破骨相关因子表达低于正常乳牙牙髓细胞关键词 :[ 颅骨锁骨发育不全 ],[RUNX2 基因突变 ],[ 牙髓细胞 ],[ 破骨细胞 ] 2

6 北京大学硕士学位论文英文摘要英文摘要 Biological characteristics of deciduous dental pulp cell in patients with cleidocranial dysplasia Specialized Master Degree of Clinical Medicine Candidate:Wenjuan Yan Supervisor:Professor Shuguo Zheng Department of Pediatric Dentistry, Peking University School and hospital of Stomatology Objective: To investigate cell proliferation, differentiation, mineralization and the capable of supporting osteoclast differentiation of cultured deciduous dental pulp cells in vitro derived from patients with cleidocranial dysplasia, and to analyse the effects of RUNX2 gene mutation on biology characteristics and the expression of downstream genes and proteins in dental pulp cells. Methods: Deciduous dental pulp cells were isolated, cultured and identified from patients with CCD and healthy children. The growth curves were drawn by CCK-8 assay. The activity of alkaline phosphatase was examined, and the capacity of odontoblast differentiation and calcium mineralization were detected by Realtime-PCR and Western Blot at gene and protein levels under induced or non-induced condition.co-culture system of DPCs and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was established. The capacity of osteoclastogenesis was compared by counting the number of TRAP + mononuclear/multinuclear cells and detecting the expression of osteoclast-related genes. The expression of osteoclast-related genes was detected by Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR ). Results: (1) In vitro, proliferative capacity of deciduous dental pulp cells in patients with cleidocranial dysplasia was lower than those from healthy children. (2) Alkaline phosphatase activity in deciduous dental pulp cells from patients with cleidocranial dysplasia was lower than those from healthy children under induced and non-induced condition in vitro. 3

7 北京大学硕士学位论文英文摘要 (3) The expression of odontoblast-related genes including RUNX2,ALP,DSPP,OPG and DSPP proteins in deciduous dental pulp cells from patients with cleidocranial dysplasia was lower than those from healthy children. (4) The number of TRAP + cells in co-culture system of deciduous dental pulp cells and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was lower in patients with cleidocranial dysplasia. (5) The expression of osteoclast-related marker genes including TRAP, CTR and CTSK was relatively lower in deciduous dental pulp cells from patients with cleidocranial dysplasia. (6) The expression of RANKL, OPG and ratio of RANKL/ OPG was relatively lower in deciduous dental pulp cells from patients with cleidocranial dysplasia. Conclusion: RUNX2 gene mutation may reduce cell proliferation, differentiation, mineralization and the ability of supporting osteoclast differentiation in deciduous dental pulp cells derived from patients with cleidocranial dysplasia. The capacity of inducing osteoclast-like cells was significantly lower, and the expression of osteoclast-related factors was downregulated. Keywords: [cleidocranial dysplasia], [RUNX2 gene mutation], [dental pulp cells], [osteoclasts] 4

8 第一部分颅骨锁骨发育不全的研究进展颅骨锁骨发育不全 (Cleidocranial dysplasia,ccd,mim ) 是一种罕见的常染色体显性遗传病, 发病率为 1/1,000,000, 具有明显的家族聚集性 [1] 1765 年,Martin 等学者首次报道了锁骨发育缺陷,1898 年 Marie 和 Sainton 将该疾病的表现详加描述并命名为 dysostose cléido-crânienne héréditaire ( 遗传性颅骨锁骨发育不全 ),1997 年 Mundlos Lee 及 Komori 等学者证实 CCD 患者的基因突变位点为位于人 6 号染色体短臂 2 区 1 带 (6p21) 的编码 runt 相关转录因子 2 ( Runt-related transcription factor 2) 的 RUNX2/CBFA1 基因 [2-4] 一临床特征 CCD 是一种广泛的骨骼发育不良疾病, 主要表现为全身多发性的骨骼系统发育畸形和牙齿发育异常 [5], 大约 2 /3 有家族史, 性别间无明显差异患者典型的特征包括 : 囟门闭合延迟颅缝增宽骨缝处出现小的缝间骨 (Wormian bones) 单侧 / 双侧锁骨发育不全 / 完全缺如形成假关节双肩下垂肩关节活动度大身材矮小以及多种牙颌面异常等 [6] 牙齿的异常常见的包括 : 多生牙乳牙滞留恒牙阻生 / 迟萌牙齿发育不全错牙合畸形牙根结构异常等 [7, 8] 据文献报道高达 94% 的 CCD 患者存在牙齿问题, 其中最为常见的牙齿异常表现有 : 第二恒磨牙萌出后口内仍存在乳牙 (80%) 下颌切牙区间隙过大以及额外牙 (70%) [9] 颅骨锁骨发育不全属常染色体显性遗传性疾病, 外显率高但临床表现型多样, 即使在同一家系中表型也可能存在差别, 轻者可仅累及牙齿, 重者可致全身性骨骼受累 [10] [11] Baumert 等学者研究发现 CCD 患者多出现头颅及锁骨的异常, 认为头颅锁骨的正常发育对 RUNX2 结构的完整性要求高, 发生细微的突变就容易出现临床症状有学者报道,CCD 患者骨骼和牙齿的表型显示出一定的相关性, 其额外牙的数目与身材矮小的程度呈正相关 [12] Zhou 等发现大多数典型的颅骨锁骨发育不全患者 RUNX2 基因的突变位点都集中在 Runt 结构域 [8], 而 RUNX2 其它编码区域的突变通常会导致非典型的颅骨锁骨发育不全的发生 [13], 但根据目前多数学者的研究结果还未发现颅骨锁骨发育不全患者其基因型与表型之间有非常明确的相关性 [14] CCD 在临床上发病率较低, 一般通过临床表现和影像学检查综合进行诊断 5

9 [15], 多数学者认为患者存在囟门关闭晚或不全, 锁骨发育不全, 多生牙或者阻生牙就可诊断为 CCD [16] 但需和某些骨骼异常的类似疾病进行鉴别诊断, 如 Crane-Heise 综合征致密性成骨不全 Yunis Varon 综合征等 [17] 当个体的 CCD 特征不典型并且出现发育迟缓时, 可以对其进行染色体组型分析, 以判断 RUNX2 [2, 基因是否存在染色体缺失或重排 16] 二病因学者们针对 CCD 发生的机制进行了大量的研究, 发现 runt 相关转录因子 2 (Runt-related transcription factor 2) 基因, 即 RUNX2 基因是 CCD 的致病基因 [2], RUNX2 基因杂合突变或部分缺失产生的单倍剂量不足效应是 CCD 的病因 [18] 约 60%-70% 临床诊断为 CCD 的患者可以在其 RUNX2 基因编码区检测到突变 [19], 迄今为止, 通过 CCD 患者基因检测已发现了近 100 个 RUNX2 基因的突变位点, 遍布整个基因序列, 包括染色体易位缺失突变插入突变无义突变错义突变移码突变等 [20], 这些突变可造成 RUNX2 基因的 DNA 结合片段或者 C 末端反式激活区域出现终止翻译的编码, 从而导致 CCD 的发生 [21] 但还有一些临床上诊断为 CCD 的患者并未检测到 RUNX2 突变, 这可能表明 CCD 与遗传的异质性有关, 例如与 RUNX2 有关或调控 RUNX2 的基因发生突变, 或者是一些其他未识别出的机制 [22] 近来也有研究发现,CCD 可能是由比传统的单倍剂量不足模型更少的 RUNX2 功能丧失所导致的 [23], 有些患者可能存在 RUNX2 基因的显微缺失 [24] Matheny 等学者提出,RUNX2 基因出现的减效等位基因突变也可导致 CCD 的发生 [25] 三 RUNX2 基因 1. 结构 : RUNX2 基因编码转录因子 RUNX2, 是成骨细胞特异性的转录因子 [26] RUNX2 属于 RUNT 家族成员, 含有一个进化保守的与果蝇的分节基因 runt 高度同源的功能域 [27] 1999 年, 人类基因组组织将编码具有 Runt 结构域蛋白的基因通称为 RUNXX Runt 结构域具有与其靶基因启动子区的成骨细胞特异性顺式作用元件相结合的能力, 并能够与广泛表达的伴侣蛋白 Cbfβ 形成杂二聚体, 从而决定了 RUNX2 与 DNA 的结合能力 [28] RUNX2 有 3 种异构体, 具有不同的 N 端序列,RUNX2Ⅰ 型以 MR IPVD 为起始氨基酸序列,RUNX2Ⅱ 型以 MASNS L 6

为起始氨基酸序列,RUNX2Ⅲ 型以 MLHSPH 为起始氨基酸序列 Ⅱ 型表达于所有物种的成骨细胞中,Ⅲ 型表达于小鼠和大鼠而并非人的成骨细胞中 [29] Ⅰ 型主要在成骨细胞早期增殖过程中起作用, 而 Ⅱ 型在成骨阶段的后期对成骨细胞的成熟起重要作用 [30] 不同的异构体由两种不同的转录启动子 P1 和 P2 调控 [31] 在 RUNX2 蛋白结构除 runt 结构域外还含有 3

10 为起始氨基酸序列,RUNX2Ⅲ 型以 MLHSPH 为起始氨基酸序列 Ⅱ 型表达于所有物种的成骨细胞中,Ⅲ 型表达于小鼠和大鼠而并非人的成骨细胞中 [29] Ⅰ 型主要在成骨细胞早期增殖过程中起作用, 而 Ⅱ 型在成骨阶段的后期对成骨细胞的成熟起重要作用 [30] 不同的异构体由两种不同的转录启动子 P1 和 P2 调控 [31] 在 RUNX2 蛋白结构除 runt 结构域外还含有 3 个转录激活域 (Activation domain, AD) 1 个转录抑制区域 (Repression domain,rd) 1 个核定位信号 (Nuclear localization signal,nls) [32] 3 个转录活化结构域分别为 1AD1 结构域, 由位于 N- 端的 19 个氨基酸组成 ;2Q/A(AD2) 结构域, 由位于 runt 结构域 N 端的 20 个谷氨酰胺和丙氨酸重复组成,Albrecht [33] 发现其与 RUNX2 在细胞核内的定位相关 ;3PST 活性结构域 (Proline/serine/threonine (PST)-rich domain)ad3, 位于 C- 末端, 富含脯氨酸丝氨酸苏氨酸, 该区域的突变可以导致 RUNX2 蛋白的反式激活能力降低或缺失 [33] 转录抑制区由 PST 序列区域的 C 末端的一半与尾部的 5 个高度保守氨基酸 VWRPY 组成 [8] 核定位信号(NLS) 位于 RHD 和 PST 结构域之间, 该结构域为一含有 38 个氨基酸的片段, 是使 RUNX2 作为转录因子发挥作用的重要结构, 该结构域的点突变可导致 RUNX2 入核功能异常, [34, 影响其对下游靶基因调控 35] RUNX2 结构域 2. 功能 : 作为成骨细胞的转录因子,RUNX2 参与调控成骨细胞的分化骨组织的形成以及肥大软骨细胞的成熟, 对机体正常的膜内成骨和软骨内成骨过程都起到至关重要的作用 [36], 同时 RUNX2 在牙齿的组织分化和形态发生中也起着非常重要的作用 RUNX2 特异性地调控与骨骼和牙齿发育密切相关的基因 [37], 包括骨钙素 (Osteocalcin,OCN) Ⅰ 型胶原 (Type I collagen,col I) 骨桥蛋白(Osteopontin, OPN) 骨涎蛋白(Bone sialoprotein, BSP) 胶原酶 3(Collagenase 3) 碱性 7

11 磷酸酶 (Alkaline phosphatase,alp) 成釉蛋白 (Ameloblastin,AMBN) 转化生长因子 -β(transforming growth factor beta,tgf-β) 的 Ⅰ 型受体蛋白和核因子 κb 受体活化因子配基 (Receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand,rankl) 等 [38] 2.1. RUNX2 与骨组织的形成骨组织的形成主要有膜内成骨和软骨内成骨两种方式, 在这一过程中成骨细胞发挥着关键作用 RUNX2 通过与 OSE2 结合而发挥作用, 而几乎所有主要的成骨细胞相关基因的启动子区均存在这一序列, 因此 RUNX2 对这些基因的表达均有一定的调控作用 [39] 在胚胎的早期发育过程中, 间充质干细胞可表达 RUNX2, RUNX2 是间充质干细胞向成骨细胞系分化的主要调节因子 [40] 在间充质细胞中异位表达 RUNX2, 可使成骨细胞特异性基因 OCN ALP 胶原酶 3 BSP OPN 和 Ⅰ 型胶原等的表达上调 [37, 41] [38] Enomoto 等研究证实 RUNX2 基因纯合突变小鼠成骨细胞的发育出现障碍, 骨组织中没有骨化中心形成, 膜内成骨和软骨内成骨过程均停滞, 破骨细胞的分 [40] 化成熟也受到抑制 ;Otto 等发现 RUNX2 基因杂合突变小鼠的骨骼可出现与人类 CCD 患者相似的临床表型, 胚胎锁骨和鼻骨发育不良, 顶骨顶骨之间的骨和上枕骨骨化延迟, 成年小鼠锁骨明显发育不良, 但严重程度从锁骨双侧仅出现微小的骨化中心至锁骨基本形成但厚度不够不等, 这点与人类的表现也很相似研究显示 RUNX2 缺陷小鼠的颅盖来源细胞不能分化为成骨细胞, 但这些细胞可以分化为脂肪细胞, 并且在骨形成蛋白 -2 (Bone morphogenetic protein-2, BMP-2) 存在时还可分化为软骨细胞 [42] 另外, 采用反义寡核苷酸将 RUNT 功能域阻断后, 原代培养的大鼠成骨细胞的分化过程被阻断 [43] 在转基因鼠中, 用 Ⅰ 型胶原启动子使成骨细胞 RUNX2 持续过表达, 转基因鼠发生严重的骨发育不良伴多发性骨折 [44] 在非成骨细胞中 (C3H10T1/2 及皮肤成纤维细胞 ) 强制性表达 RUNX2 后, 可使成骨细胞特异性的基因表达 [37, 45] 在成骨细胞的分化过程中, 许多信号通路参与调控 RUNX2 的表达 [44, 46] 在调控成骨细胞分化的多个信号通路中,RUNX2 基因都发挥着重要的枢纽作用 [47] 8

12 RUNX2 基因有关的信号通路 RUNX2 基因与牙齿的发育 RUNX2 对牙齿发育至关重要牙齿发育包括牙胚的发生和分化, 牙体组织的形成以及牙齿的萌出近年来的研究发现, 除牙胚的发生阶段外,RUNX2 基因在牙齿发育的各个阶段都发挥着重要作用首先,RUNX2 在牙胚细胞的分化过程中发挥着重要作用牙齿发育是上皮细胞与神经嵴源性间充质细胞相互作用的结果牙胚由蕾状期向帽状期发育的过程中,RUNX2 调控成釉器组织和形态的分化 [48] 动物实验研究发现,RUNX2 基因纯合突变小鼠牙胚的发育停留在帽状期或钟状期早期, 表明 RUNX2 基因是牙胚由帽状期向钟状期过渡所必需的 [49] RUNX2 在牙齿发育过程中的表达具有明显的时间和空间特异性,RUNX2 基因突变对小鼠磨牙发育影响较切牙更严重, 下颌磨牙较上颌磨牙更严重釉结标记基因, 包括 p21 fgf-4 edar 和 bmp- 4 在 RUNX2 -/- 小鼠下颌磨牙中的表达明显下调, 但在上颌磨牙中却表达正常, 可见在颌骨的不同区域,RUNX2 下游的靶基因存在差异, 这种区域特异性表达可能是由于上下颌始基来源于不同的神经嵴细胞造成的 [50] 其次,RUNX2 对牙体组织的形成发挥着重要作用研究发现, 成釉蛋白 (AMBN) 釉蛋白(AM) 牙本质涎磷蛋白(DSPP) 牙本质基质蛋白 1(DMP1) 9

13 ALP OCN 和 BSP 基因的启动子区均含有 RUNX2 结合位点 RUNX2 通过调节上述基因的表达调控牙体组织的形成动物实验研究进一步证实了 RUNX2 在牙釉质和牙本质形成中的重要作用, 研究发现,RUNX2 -/- 小鼠切牙的釉质完全缺失, 很少有成牙本质细胞的分化和牙本质基质的形成 [50] RUNX2 在牙乳头和牙囊细胞中均有表达, 参与了成牙本质细胞和牙周组织中成骨细胞的分化 [51] RUNX2 基因纯合突变小鼠切牙发育停滞在钟状期, 成牙本质细胞异常, 釉质没有形成 [49] RUNX2 在成牙骨质细胞牙骨质细胞牙周膜细胞成骨细胞和骨细胞中也都有表达 [52] RUNX2 调控牙本质形成, 成牙本质细胞和成骨细胞在细胞生物学上类同, 都表达 Ⅰ 型胶原 ALP OCN 和 BSP 等矿化相关蛋白上述基因的启动子区均存在 RUNX2 的结合位点, 均受 RUNX2 的调控 [53] 牙本质涎磷蛋白 ((Dentin sialophosphoprotein,dspp)) 和牙本质基质蛋白 -1(Dentin matrix protein, DMP1) 是牙本质细胞外基质中最主要的非胶原蛋白成分,DSPP 在牙本质的细胞外基质形成和矿化中有重要作用, 鼠 DSPP 基因的调控元件中发现多个 RUNX2 的结合位点在牙齿发育各个阶段中, 未分化成熟的成牙本质细胞以及牙乳头细胞中均有 RUNX2 的表达, 说明它在成牙本质细胞的分化中发挥作用 [54] Lukinmaa [55] 等研究了 CCD 患者的乳恒牙的结构, 发现乳牙的生理性牙本质结构基本正常, 当受到龋磨耗和根吸收的刺激时, 可形成异常的病理性牙本质, 乳牙根仅有轻度的吸收, 乳牙的根髓中有时可见到牙本质结节和上皮细胞团块也有学者报道 CCD 患者的乳牙牙本质小管排列紊乱 [56] 冠和牙根畸形在恒牙中很常见, 据分析可能与萌出压力有关, 而乳牙和第一恒磨牙萌出时周围仅有少量骨组织, 压力小, 所以畸形较少见 [57] Xuan [58] [59] 及 Wang 等研究了 CCD 患者乳牙牙齿结构发现 CCD 乳牙牙釉质的钙磷含量均较正常乳牙降低, 但牙本质各元素的含量无显著降低 2. 3.RUNX2 与牙齿的萌出牙齿的萌出包括两个阶段, 牙槽骨的吸收形成必要的萌出通道以及牙齿向牙合方的垂直移动牙齿的萌出是一个复杂而且受到严密调控的过程, 在这一过程中既有牙槽骨牙胚的组织学改变, 也有牙囊细胞成骨细胞破骨细胞等细胞学的改变, 并且有多种细胞因子参与在牙齿萌出前,RUNX2 持续表达于牙齿 10

14 周围的牙囊和牙周膜中, 而单核细胞可进入牙囊并融合形成破骨细胞 [51] RUNX2 影响牙齿的萌出和替换牙齿的萌出和替换是一个破骨 - 成骨相互作用的过程破骨 / 破牙细胞来源于血液单核细胞, 在牙根和骨吸收过程中发挥着重要作用 [60] RUNX2 可能影响破骨细胞的分化有学者发现 RUNX2 杂合突变小鼠牙齿萌出的时间晚于正常者 0.53 至 0.63 天, 牙齿萌出通路上成熟的破骨细胞分布减少 [61] RANKL/RANK/OPG 这一通路在破骨细胞的分化和形成中起到重要的调节作用局部微环境中 RANKL 和 OPG 表达的相对水平是决定破骨细胞形成及活性的关键, 从而决定局部骨组织的吸收或增生 [62] RANKL 的启动子上有 RUNX2 的结合位点因此,RUNX2 可直接调节 RANKL 的表达 [63] 在人和小鼠的 OPG 基因启动子存在多个 RUNX2 的结合位点,RUNX2 可以通过调控 OPG 启动子活性, 抑制 OPG 的表达, 促进破骨细胞的分化和激活 [64] 2009 年 [65] Lossdorfer 等报道了 CCD 患者的牙周膜细胞与单核细胞共培养破骨细胞生成减少, 牙周膜细胞 OPG 的表达量与正常者相近, 但是 RANKL 的表达量显著下降,OPG 与 RANKL 的比例升高, 破骨细胞生成减少, 骨吸收被抑制 2000 年 [64] Thirunavukkarasu 等将小鼠颅骨成骨细胞与正常脾细胞共培养, 发现 RUNX2 纯合突变小鼠的成骨细胞诱导破骨细胞分化的能力较野生型降低明显 2013 年 [66] Dorotheou 等发现 CCD 患者牙囊细胞的 RANK, OPG,CSF-1 表达量升高, RANKL 表达量降低但 CCD 患者牙髓细胞中 RANKL,OPG 的表达情况未见相关研究研究发现 CCD 患者乳牙的数目和形态均没有发现异常, 但几乎所有患者都有恒牙萌出障碍, 其中第一恒磨牙都可以自行萌出, 但萌出时间平均延迟 3 年 [67] 7 至 9 岁儿童中恒牙列的发育程度比同龄正常儿童大约晚 1 年,18 至 23 岁患者恒牙列发育较正常晚 4 年这种现象可能与牙槽骨和乳牙的吸收障碍有关 [56] 综上所述,RUNX2 在骨骼和牙齿的发育过程中发挥着至关重要的作用, 因此,RUNX2 基因的异常势必会影响骨骼和牙齿的正常发育 RUNX2 基因的杂合突变导致 CCD 患者出现典型的全身骨骼发育障碍和牙齿问题但 RUNX2 基因突变导致 CCD 发生的具体分子机制及其对人类牙齿发育和萌出的影响有待进一步研究 11

15 第二部分乳牙牙髓细胞一牙髓的结构及功能牙髓是位于牙髓腔内的疏松结缔组织, 包含有细胞纤维神经血管淋巴管和其他细胞外基质牙髓中的细胞成分主要有成纤维细胞成牙本质细胞未分化的间充质细胞和组织细胞树突状细胞 T 淋巴细胞, 细胞间质包括纤维基质血管淋巴管和神经等牙髓组织的功能是形成牙本质, 具有营养感觉防御的能力牙髓在发育期起到主要作用, 且在整个生命过程中形成继发性牙本质并且对各种刺激做出有限的反应如形成修复性牙本质二牙髓细胞的干细胞特性自 20 世纪 60 年代, 国外学者开始对牙髓组织进行体外培养, 作为中胚层来源的细胞, 体外培养的牙髓细胞在形态学上呈梭形或不规则形, 与成纤维细胞相似, 被命名为牙髓成纤维细胞 (Pulp fibroblasts) 牙髓组织中含有具有多向分化潜能的干细胞, 称为牙髓干细胞 (Dental pulp stem cells, DPSCs), 具有高度增殖和自我更新能力, 可以分化成多种细胞系, 是成体干细胞的一种, 属于多能干细胞 [68] [69] Gornthos 等通过与已确认的骨髓基质干细胞的对比研究, 第一次报道了从成体牙髓组织中体外培养出集落状生长的体外可诱导分化形成牙本质样结构的细胞, 提出了牙髓干细胞的概念基因芯片技术研究发现, 人 DPSCs 和骨髓间充质干细胞 (Bone mesenchymal stem cells, BMSCs) 在细胞外基质生长因子和转录因子等将近 4400 个基因表达水平上一致 [70] [71] 2003 年 Miura 等首次发现并报道了从人的脱落乳牙中分离到的一种具有多分化潜能的干细胞并将该干细胞命名为乳牙牙髓干细胞 (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED), 这类细胞同样具有高度增殖能力, 一定的多向分化潜能和自我更新能力等生物学特性 SHED 可以向成牙本质细胞成骨细胞脂肪细胞神经细胞等方向分化 [72] 1. 体外诱导条件下 SHED 可以向成牙本质细胞方向分化与 DPSC 不同的是 SHED 在裸鼠体内移植后不能形成牙本质牙髓复合体结构, 只形成类牙本质 [71] 成牙本质细胞是一种高度特异性的细胞, 排列在牙髓腔周边, 是牙髓中有重要功能的细胞成牙本质细胞来源于神经嵴, 按其分化可分为两类 [73] : 在牙齿发育的钟状期晚期, 牙乳头细胞在内釉上皮的诱导下分 12

16 化成为成牙本质细胞, 从而形成原发性继发性和反应性牙本质 ; 当牙齿萌出后受到外界因素的刺激, 局部的成牙本质细胞凋亡或坏死, 使牙髓组织中的未分化的间充质细胞成纤维细胞进一步分化成为牙本质样细胞, 形成修复性牙本质 [74] 成牙本质细胞同成骨细胞一样表达某些矿化基质蛋白如碱性磷酸酶 (ALP) 牙本质基质蛋白 1(DMP 1) I 型胶原蛋白 (collagen I) 骨结合素(ON) 骨桥蛋白(OPN) 骨唾液酸糖蛋白 (BSP) 骨钙素(OC) 纤维连接蛋白(Fibronectin) 等 [75] SHED 表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白 (Dentin sialophosphoprotein,dspp) [76] DSPP 是牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白的基因复合体, 属于牙本质特异性基质非胶原蛋白尽管 DSPP 基因在成牙骨质细胞中也有表达, 但是其表达量明显低于在成牙本质细胞中的表达量, 是牙本质中含量的 1/400, 其表达水平太低而不能被免疫组织化学染色所识别 [77] 随着研究的进展, 有学者发现除牙齿外,DSPP 还可在骨内耳组织以及鼻软骨组织中表达, 但在其他组织中表达量远低于牙组织 [78] 目前对于诱导牙髓干细胞分化为成牙本质样细胞尚无特异的灵敏的鉴别手段, 因此 DSPP 仍被认为是牙本质或成牙本质细胞相对特异性的标志性蛋白碱性磷酸酶 (ALP) 是骨和牙齿等矿化组织形成代谢和再生过程中的的重要物质, 在成骨细胞和成牙本质细胞中高表达, 通过调控磷酸盐的转运, 参与骨和牙本质的形成, 与细胞分化状态关系密切, 细胞分化程度越高, 分泌矿化基质的能力越强, 则 ALP 活性越高, 被认为是 DPSCs 向成牙本质细胞分化和牙本质形成的早期标志 [79] 来源于 SHED 的细胞表现出低水平持续增长的 ALP 活性, 却不分化, 提示 SHED 的内在分化趋势可能是朝向成牙本质细胞的 [80] ALP 被认为是评价 DPSCs 向成牙本质细胞分化状况的一个重要参数矿化诱导液是研究体外培养中细胞矿化常用的一种培养液, 用于骨和牙本质等矿化组织的诱导形成, 目前最常用的矿化液是含一定比例的地塞米松抗坏血酸 β 甘油磷酸钠的培养液 [81], 其中抗坏血酸是合成胶原和骨形成的必需物质, 地塞米松不仅能促进成骨细胞分化成熟, 诱导成骨, 还具有调节成骨样细胞产生胰岛素样生长因子和促进胶原合成, 刺激碱性磷酸酶活性的作用 β 甘油磷酸钠是碱性磷酸酶的底物, 为矿化提供必需的磷离子 [82] 2. 体外诱导条件下 SHED 可以向成骨细胞方向分化 13

牙的发育

第二章牙的发育 Chapter 2 Development of Teeth Designed and produced by Dr. Wang Li 1 概述牙及其支持组织是从上下颌突和额鼻突的外胚层及外胚间叶细胞发育而来牙齿发育是一长期复杂的生物学过程牙齿发育是一个连续的过程, 包括牙胚的发生牙体组织形成和牙齿的萌出 Designed and produced by Dr. Wang

北京大学硕士学位论文 原创性声明

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