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1 315 基础研究 FAM20C 在体外培养人牙髓细胞中的表达及成牙本质向分化诱导对其表达的影响 易柏成莫泽欢徐琼 摘要 目的研究人牙髓细胞 (hdpc) 体外培养传代过程中 FAM20C 的表达模式, 及对 hdpc 成牙本质向分化诱导后 FAM20C 的表达变化 方法蛋白免疫印迹法 (Western blot) 检测第 1 代至第 7 代 (P1~P7)hDPC 中 FAM20C 蛋白的表达量 ; 结果采用独立样本 t 检验 ; 对 P3 代 hdpc 进行成牙本质分化诱导 7 和 14 d 后, 反转录聚合酶链反应与 Western blot 检测 FAM20C 的 mrna 和蛋白水平变化 牙本质涎磷蛋白 (DSPP) 牙本质基质蛋白 1(DMP1) 表达变化,FAM20C 的 mrna 以及蛋白表达变化采用单因素方差分析 免疫荧光法检测 FAM20C 在 hdpc 中的分布 结果体外培养的 hdpc 中可检测到 FAM20C 表达, 表达量随细胞传代先增加后减少 (t P2 = ,P P2 = 0.001;t P3 = ,P P3< 0.001;t P4 = ,P P4<0.001;t P5 = 7.452,P P5 = 0.002;t P6 = 1.357,P P6 = 0.246;t P7 = 1.099,P P7 = 0.334); 成牙本质向分化诱导 7 和 14 d 后,FAM20C 的 mrna 和蛋白表达量高于未诱导组细胞 (F FAM20C mrna=86.252, P FAM20C mrna,7 d<0.001,p FAM20C mrna,14 d<0.001;f FAM20C 蛋白 = ,P FAM20C 蛋白,7 d = 0.002,P FAM20C 蛋白,14 d<0.001) 免疫荧光结果显示, 成牙本质诱导前 FAM20C 蛋白表达于细胞核, 诱导后主要表达于细胞质, 诱导 14 d FAM20C 在细胞质中表达量高于诱导 7 d 结论 hdpc 中表达 FAM20C, 成牙本质向分化诱导上调其表达水平, 诱导后在细胞质中表达较高, 提示 FAM20C 与 hdpc 的成牙本质分化相关 关键词 牙髓 ; 细胞培养 ; 体外 ; FAM20C; 成牙本质向分化 In vitro expression of family with sequence similarity member 20C in human dental pulp cells and the effect of odontogenic induction on its expression Yi Baicheng,Mo Zehuan,Xu Qiong. Guanghua School of Stomatology,Hospital of Stomatology,Sun Yat sen University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology,Guangzhou ,China Corresponding author:xu Qiong, [email protected] Abstract Objective To investigate the expression pattern of family with sequence similarity member 20C(FAM20C)in human dental pulp cells(hdpcs)during subculture in vitro and the effect of odontogenic differentiation induction on its expression. Methods Western blotting was used to detect the FAM20C expression pattern of hdpcs from P0 to P7. Then the hdpcs were treated with odontogenic medium 7 and 14 days,and the mrna and protein level of FAM20C were analyzed by RT PCR and Western blotting,respectively. The expression of FAM20C protein during subculture was analyzed with t test. The mrna and protein level of FAM20C during odontogenic differentiation were evaluated by One Way ANOVA. Cellular localization and expression feature of FAM20C protein were determined by immunofluorescence in hdpcs during odontogenic differentiation. Results Western blot analysis showed that FAM20C protein level increased at passage 2 3 and decreased at passage 4 5(t P2 = ,P P2 = 0.001;t P3 = ,P P3<0.001;t P4 = ,P P4<0.001;t P5 = 7.452,P P5 = 0.002;t P6 = 1.357,P P6 = 0.246; t P7=1.099,P P7=0.334). FAM20C mrna and protein level were up regulated after the odontogenic induction of 7 days and 14 days,as observed by RT PCR and Western blotting(f FAM20C mrna = ,P FAM20C mrna,7 d< 0.001,P FAM20C mrna,14 d<0.001;f FAM20C protein = ,P FAM20C protein,7 d = 0.002,P FAM20C protein,14 d<0.001). FAM20C was mainly presented in cytoplasm after the odontogenic induction and the cytoplasmic protein level of DOI: /cma.j.issn 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 作者单位 : 广州, 中山大学光华口腔医学院 附属口腔医院, 广东省口腔医学重点实验室通信作者 : 徐琼, 电子邮箱 :[email protected]

2 316 FAM20C was elevated. Conclusions The expression of FAM20C was presented in hdpcs. The expression of FAM20C in hdpcs increased after induction of odontogenic differentiation. FAM20C might play an important role in the odontogenic differentiation of hdpcs. Key words Dental pulp; Cells,cultured; In vitro; FAM20C; Odontogenic differentiation FAM20C 又名牙本质基质蛋白 4 [1] (dentin matrix protein 4,DMP4), 是在进化过程中高度保守的 family with sequence similarity 20(FAM20) 家族中的 [2] [3] 一员 FAM20C 在矿化组织如骨和牙中高表达, [4 5] 其缺失突变可导致 Raine 综合征 ( 又称为硬化性骨发育不良 ), 提示其参与生物矿化调控 FAM20C 可使分泌蛋白的 Ser x Glu/pSer(S x E/pS) 基序磷酸化, 而小整合素结合配体 N 端连接糖蛋白家族 (smallintegrinbinding ligand N linked glycolprotein, [6 7] SIBLING) 是其底物之一 受龋损 外伤 牙体预备和磨耗等外界刺激后, 牙髓 牙本质复合体可形成修复性牙本质, 发挥防御与修复功能 牙髓组织中含有少量的牙髓干细胞, 在此过程中分化为成牙本质细胞, 促进修复性 [8] 牙本质的形成 属于 SIBLING 的牙本质涎磷蛋白 (dentin sialophosphoprotein,dspp) 牙本质基质蛋白 1 (dentin matrix protein 1,DMP1) 是人牙髓细胞 (human dental pulp cell,hdpc) 成牙本质向分化的重要标 [9 10] 志, 在其分化过程中发挥重要作用, 而 FAM20C 是否在 hdpc 中表达, 成牙本质向分化诱导是否对其表达产生影响尚未见报道 本研究探讨 FAM20C 在 hdpc 中的表达模式, 以及成牙本质向分化诱导对其表达的影响, 为研究 FAM20C 是否参与 hdpc 分化过程奠定前期理论基础 材料与方法一 主要试剂和仪器恒温 CO 2 细胞培养箱 (Thermo fisher, 美国 ); 生物安全柜 ( 上海力康生物 ); 细胞培养基 DMEM 胎牛血清 (fetal bovine serum,fbs) 0.25% 胰蛋白酶 青 链霉素双抗 Ⅰ 型胶原酶 (Gibco, 美国 );β 甘油磷酸钠 地塞米松 维生素 C(Sigma, 美国 ); 超微量紫外可见光分光光度计 (Thermo fisher, 美国 ); Trizol Reagant(MRC, 美国 ); 逆转录试剂盒 (Taraka, 日本 );SYBR GreenⅠ, 全自动反转录聚合酶链反应 (RT PCR) 仪 (Roche, 美国 );10X RIPA 蛋白裂解液 3X Loading Buffer(Cell Signaling Technology, 美国 ); 蛋白酶抑制剂混合物 Cocktail(Roche, 美国 );BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ( 上海碧云天 ); 封闭用脱脂奶粉 (BD, 美国 ); 兔抗人 FAM20C 多克隆抗体 兔抗人 DMP1 多克隆抗体 (Abcam, 英国 ); 鼠抗人 DSPP 多克 隆抗体 (Santa Cruz, 美国 );GAPDH 抗体 ( 杭州贤至 生物 ); 电转印系统 (Bio Rad, 美国 );PVDF 膜 (Roche, 美国 ); 化学发光预混液 (Millipore, 美国 ); 化学发光成像分析系统 (GE Healthcare, 美国 ); DAPI(Thermo fisher, 美国 ); 羊抗兔荧光二抗 Alexa Flour 594(Invitrogen, 美国 ); 全自动倒置荧光显微镜 (Zeiss, 德国 ) 等 二 方法 1. 人牙髓细胞的体外分离培养 : 于 2015 年 2 月 至 10 月收集因阻生或正畸治疗在中山大学光华口腔 医学院 附属口腔医院口腔颌面外科门诊拔除的第三 磨牙或前磨牙, 牙体完整无龋损, 患者年龄 12~25 岁, [11] 均已知情同意 参考 Gronthos 等的方法, 于生物 安全柜中将牙用含 2% 双抗 ( 链霉素 青霉素 ) 的磷 酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗消毒后无菌条件下劈开并取 出牙髓组织, 剪去尖端 2 mm, 剪碎成 1 mm 3 小块, 加 入的 Ⅰ 型胶原酶 (3 mg/ml)37 消化 20 min, 含 20% FBS 的原代培养基终止消化 1000 r/min 离心 5 min ( 离心半径 10 cm), 弃上清, 将组织块平铺于 25 cm 2 培养瓶中, 加入 3 ml 原代培养基 置于 37 恒温培 养箱中培养 细胞贴壁后每隔 3 d 换液 待细胞汇 合率达 70% ~ 80% 时, 胰酶消化传代,10% FBS 传代 培养基继续培养 2. 人牙髓细胞的成牙本质向分化诱导 : 取状态 良好的第 3 代 (P3)hDPC, 以 个细胞 / 孔的密度 接种于六孔板中, 细胞生长至 70% ~ 80% 汇合时换 矿化诱导液 (10 mmol/l β 甘油磷酸钠 50 mg/l 维 生素 C 0.1 μmol/l 地塞米松 DMEM 低糖培养基 10% FBS) 分别培养 7 和 14 d, 每 2 ~ 3 d 换液 1 次 对照组加入传代培养基, 每 2 ~ 3 d 换液 1 次 3. 茜素红染色 : 取分别经成牙本质向分化诱导 d 的 hdpc, 弃原液并用 PBS 漂洗 3 次,4% 多 聚甲醛固定 30 min,1% 茜素红溶液染色 5 min, 双蒸 水漂洗至漂洗液无色, 于倒置显微镜下观察矿化结 节形成情况 4. 反转录聚合酶链反应 :hdpc 经过成牙本质 向分化诱导 0 7 和 14 d 后, 使用 Trizol 法提取细胞总

3 317 中华口腔医学研究杂志 电子版 2016 年 10 月第 10 卷第 5 期 Chin J Stomatol Res Electronic Edition October 2016 Vol.10 No.5 RNA 超微量紫外 可见光分光光度计测定 RNA 纯 hdpc 成 牙 本 质 向 分 化 过 程 中 的 表 达 变 化 时 对 逆转录为 cdna 模板 引物序列见表 1 采用 SYBR 和蛋白表达量进行方差齐性检验 数据符合方差分 度以及浓度 取 1 μg RNA 按 Takara 试剂盒说明书 Green染料法进行检测 反应程序 95 预变性5 min 95 变性 10 s 65 退火 20 s 72 延伸 30 s 反应 循环数为 40 内参为 GAPDH 基因 每样本设置 3 个 复孔 采用 2 Ct 表1 法计算结果 析条件 进行单因素方差分析 One Way ANOVA 组间两两比较采用 Bonferroni 检验 多个实验组与对 照组比较则采用 Dunnett 检验 实验重复 3 次 以 P 0.05 认为差异有统计学意义 结 反转录聚合酶链反应引物序列 基因 引物序列 FAM20C F ACCCTTTCTCCTTCCTGGGG GAPDH FAM20C 在每个矿化时间点 0 7 和 14 d 的 mrna R TCCTCCAAAACCACGTAGGC F GGCATGGACTGTGGTCATGAG R TGCACCACCAACTGCTTAGC 5. Western blot 检测 取体外传代培养第 1 ~ 7 代 以及成牙本质向分化诱导前后的 P3 代 hdpc RIPA 裂解液+蛋白酶抑制剂混合物 Cocktail 提取总蛋白 果 一 人牙髓细胞体外培养传代过程中 FAM20C 的表达情况 Western blot 结果显示见图 1 随着 hdpc 传代 P1 ~ P7 FAM20C 的蛋白表达量呈现增加后减少的 趋势 P2 ~ P5 与 P1 相比 FAM20C 的蛋白表达升高 P 0.05 到 P6 以后明显下降 与 P1 差异无统计 学意义 P 0.05 表 2 高速离心后取上清 BCA 法检测蛋白浓度 加入 3X Loading Buffer 99 金属浴变性 10 min 取 30 μg/孔 上样至 8% SDS PAGE 胶进行电泳 电泳条件 80 V 30 min 120 V 1 h 200 ma 湿法转膜 1 h 5%脱脂牛奶 室温下封闭 1 h 5% BSA 稀释一抗 FAM20C DSPP DMP GAPDH 冷 库中摇床孵育过夜 TBST 漂洗后加入相应二抗 室温孵育 1 h 使用预混化学发光液显影 Image J 软件分析条带灰度值 以 GAPDH 蛋白为内 参计算目的蛋白相对表达量 实验重复 3 次 6. 免疫荧光细胞化学法检测 于激光共聚焦皿 中以约 个/皿的密度接种矿化诱导前及诱导 注 与 P1 比较 P2 ~ P5 升高 ap 0.05 P6 ~ P7 与 P1 相比差 基 PBS 漂洗 3 次 4%多聚甲醛室温下固定 20 min 图 d 后的 hdpc 48 h 细胞完全贴壁后弃原培养 PBS 漂洗 3 次 0.2% Triton 透化 10 min 5% BSA 室温 下 封 闭 1 h 加 入 FAM20C 抗 体 5% BSA 稀 释 1 异无统计学意义 bp 0.05 体外培养人牙髓细胞传代过程中 FAM20C 蛋白表达水 平变化 表 2 人牙髓细胞传代过程中 FAM20C 蛋白表达变化 200 覆盖皿底 阴性对照组加入 PBS 4 湿盒中孵 细胞传代 蛋白平均灰度值 t值 稀释 避光孵育 1 h PBS 洗 3 次后 DAPI P1 P P 育过夜 PBS 漂洗后加入羊抗兔荧光二抗 5% BSA 甲醇稀释 1 10 染色 5 min 漂洗 抗荧光衰减剂封 片 倒置荧光显微镜下观察 三 统计学处理方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件进行统计分析 研究 FAM20C 蛋白在传代过程中的表达模式时 数据采 用独立样本 t 检验 P2 ~ P7 每代 FAM20C 的蛋白表 达 量 分 别 与 P1 代 进 行 比 较 在 研 究 FAM20C 在 P4 P5 P6 P7 P值 二 成牙本质分化诱导对 FAM20C 表达的影响 对第 3 代 hdpc 进行成牙本质分化诱导 为验证

4 318 中华口腔医学研究杂志 电子版 2016 年 10 月第 10 卷第 5 期 Chin J Stomatol Res Electronic Edition October 2016 Vol.10 No.5 诱导效果 分别于 0 7 和 14 d 收集蛋白样本 Western 为观察成牙本质分化诱导对 FAM20C 表达的影 blot 检 测 成 牙 本 质 向 分 化 关 键 标 志 蛋 白 DSPP 响 于 0 7 和 14 d 分别检测 FAM20C 的 mrna 和蛋白 结果显示 成牙本质向分化标志蛋白表达增加 FDSPP = mrna 水 平 升 高 诱 导 14 d 者 高 于 诱 导 7 d P DMP1 的表达 茜素红染色检测钙结节形成情况 表达水平 结果显示成牙本质向分化诱导后FAM20C PDSPP 7 d = PDSPP 14 d FDMP1 = FAM20C 的蛋白变化趋势与 mrna 一致 诱导 7 d 后 FAM20C 蛋白表达升高 诱导 14 d 组 FAM20C PDMP1 7 d PDMP1 14 d 矿化结节明显增多 提示对 hdpc 行成牙本质向分化向诱导成功 图 2 表达量高于诱导 7 d 组 P 0.05 图 3 及表 3 ~ 4 A B C 注 图 2A 为 Western blot 检测成牙本质向分化诱导前后 DSPP DMP1 蛋白表达变化 图 2B 为相对灰度分析结果 矿化诱导 0 7 和 14 d 后 DSPP DMP1 蛋白量表达增多 ap 0.05 图 2C 为矿化诱导 0 7 和 14 d 茜素红染色结果 可见矿化诱导后矿化结节 增多且颗粒增大 100 图2 第 3 代人牙髓细胞成牙本质向分化诱导及鉴定 B A C 注 图 3A 为 RT PCR 检测成牙本质向分化诱导 0 7 和 14 d 后 FAM20C mrna 水平表达变化 可见诱导后 FAM20C mrna 水平升 高 ap 0.05 图 3B 为 Western blot 检测观察矿化诱导对 FAM20C 蛋白表达水平的影响 图 3C 为相对灰度分析结果 趋势与 mrna 一致 ap 0.05 图 3 人牙髓细胞成牙本质向分化诱导前后 FAM20C 的 mrna 和蛋白表达变化

5 319 表 3 人牙髓细胞成牙本质分化过程中 FAM20C 基因表达变化 诱时时间 (d) 基因相对表达量 F 值 P 值 表 4 人牙髓细胞成牙本质分化过程中 FAM20C 蛋白表达变化 诱时时间 (d) 蛋白平均灰度值 F 值 P 值 三 FAM20C 在人牙髓细胞成牙本质向分化诱导前后的细胞定位情况为研究 FAM20C 蛋白在 hdpc 中表达情况, 采用免疫荧光细胞化学法分析 FAM20C 在 hdpc 成牙本质向分化诱导前后中的表达 由图 4 可见, 在未诱导细胞中,FAM20C 仅在细胞核中表达 矿化诱导 7 d 后, 细胞质中可见 FAM20C 表达, 矿化诱导 14 d 后,FAM20C 主要表达于细胞质中, 且矿化诱导后 FAM20C 表达增高, 诱导 14 d 组 FAM20C 表达量高于诱导 7 d 组 讨论蛋白质的磷酸化修饰 (Phosphorylation) 是重要的翻译后修饰方式之一, 哺乳动物细胞中约有 1/3 的蛋白质发生磷酸化, 提示此种作用参与多种生理病 [12] 理过程, 特别是在细胞信号转导中发挥重要作用 蛋白质磷酸化是指在蛋白激酶 (Protein kinase) 催化下, 将 ATP( 或 GTP) 的磷酸基团转移到相应的底物蛋白氨基酸残基 ( 如丝氨酸 酪氨酸 ) 上的过程 1972 年发现一种能使分泌蛋白磷酸化的蛋白激酶, 被命名为 Golgi enriched fraction casein kinase(gef [13] CK), 简称 G CK, 富含于细胞高尔基体中 随后的研究证实 G CK 即为 FAM20C [6 7] FAM20C 在肺 [2] 肝 肾等多种组织中表达, 在矿化组织如骨和牙中 [3] 表达较高 同时, 在小鼠的成釉细胞 成牙本质细胞 牙周成纤维细胞中也可检测到 FAM20C 的表 [14 15] 达 目前,FAM20C 是否在 hdpc 中表达尚无报道 本实验采用 Western blot 检测体外培养的 hdpc 中 FAM20C 的表达, 结果显示 FAM20C 的表达量随传代次数先增加 (P1 ~ P3),P5 后 FAM20C 表达下降, 可能与细胞传代次数增加后发生老化有关 FAM20C 属于 FAM20 家族, 该家族共有 3 个成 员, 分别为 FAM20A FAM20B 和 FAM20C [2] 虽然 FAM20A 的底物尚不清楚, 但其突变可导致釉质发 [16] [17] 育不全和釉 肾综合征, 提示其与釉质发育和 矿化有关 ;FAM20B 激酶则能磷酸化位于糖胺多糖 侧链和糖蛋白核心之间的四糖连接区域中的木糖, 参与糖蛋白的生物合成 [18] ;FAM20C 由 584 个氨基 酸组成,N 端 1 22 氨基酸为信号肽,C 端存在激酶结 构域和 1 个整合素结合三肽 RGD(Arg Gly Asp) [1 2] 其突变可导致 Raine 综合征, 患者表现为骨和牙发 [4 5] [6] [7] 育缺陷 2012 年 Tagliabracci 等和 Ishikawa 等 发现,FAM20C 可使多种分泌蛋白的 S x E/pS 基序 磷酸化, 与生物矿化密切相关的分泌性钙结合磷酸蛋 白 (secretory calcium binding phosphoprotein,scpp) 家族是 FAM20C 的底物 [6 7,19] 小整合素结合配体 N 端连接糖蛋白 SIBLING 属于 SCPP 家族, 包括 DSPP DMP1 骨桥蛋白 (osteopontin,opn) 骨涎蛋白 (bone sialoprotein,bsp) 细胞外基质磷酸糖蛋白 (matrix extracellular phosphoglycoprotein,mepe) [20], 其中 DSPP 和 DMP1 为 hdpc 成牙本质向分化的标志 [21 22], 在此过程中发挥重要作用 [9 10],DMP1 的磷酸化水平 与矿化晶体大小 方向有关, 提示其磷酸化修饰可能 影响其功能 [9] 一些研究探讨了 FAM20C 在矿化组 [1] 织发育中的功能,Hao 等发现鼠多潜能间充质细胞 系 (C3H10T1/2) 未分化成釉细胞系 (HAT 7) 前成骨 细胞系 (MC3T3 E1) 中过表达 FAM20C 可上调 DSPP DMP1, 沉默 FAM20C 后 DSPP DMP1 表达下降 ; [23 24] Wang 等发现神经嵴来源的间充质细胞 ( 形成牙 及牙槽骨 ) 中条件性敲除 FAM20C 后小鼠出现严重 的牙齿及牙槽骨发育缺陷, 成牙本质细胞中 DSPP 以及 DMP1 表达下降, 且此种缺陷与 DMP1 缺失小 鼠表型相似 [25] 进一步研究显示, 过表达 DMP1 不 能挽救 FAM20C 敲除小鼠模型中的骨和牙发育缺 陷, 可能是 FAM20C 缺失导致 DMP1 磷酸化失败而 [26] [27] 不能发挥其功能 Yang 等提取了 FAM20C KO 小鼠与野生型小鼠的骨非胶原蛋白, 质谱分析结果 显示 DMP1 部分 S x E/pS 基序中的磷酸化丝氨酸位 点 (pser) 发生了磷酸化丢失 这些研究显示, FAM20C 可能参与 DSPP DMP1 的调控, 但在 hdpc 成牙本质向分化动态过程中的调控作用仍未阐 明 本实验采用 RT PCR 和 Western blot 检测 hdpc 成牙本质分化诱导前后 FAM20C 的表达变化规律, 结果显示在矿化诱导后 FAM20C 的表达量增加, 与 DSPP DMP1 的表达变化相一致, 提示 FAM20C 可能

6 320 中华口腔医学研究杂志 电子版 2016 年 10 月第 10 卷第 5 期 Chin J Stomatol Res Electronic Edition October 2016 Vol.10 No.5 A B C D 注 图 4A 为阴性对照组 未加入特异性抗体时 荧光二抗对成牙本质向分化诱导 0 d hdpc 无非特异性染色 图 4B ~ 4D 分别为 实验组成牙本质向分化诱导 0 7 和 14 d 红色荧光为 FAM20C 抗体特异性染色 蓝色荧光为细胞核染料 DAPI 特异性染色 图4 免疫荧光法检测成牙本质向分化诱导对 FAM20C 细胞定位及蛋白水平的影响 200 参与了 hdpc 分化的调控 既往对 FAM20C 的细胞 达 诱导后可见 FAM20C 表达于细胞质中 且胞质 究采用细胞免疫荧光法检测到 FAM20C 表达于诱导 增加 提示 FAM20C 可能在此分化过程中由胞核转 内定位研究显示其主要表达于高尔基体中 本研 6 7 前后的 hdpc 未诱导时 FAM20C 仅在细胞核中表 FAM20C 的表达水平随成牙本质向诱导时间延长而 移至胞质 从而发挥其磷酸化激酶的调控作用

7 321 综上所述,FAM20C 可表达于 hdpc, 且在其成牙本质向分化过程中表达量增加, 提示 FAM20C 及其介导的磷酸化修饰作用可能参与调控 hdpc 分化, 具体调控机制有待进一步研究 参考文献 [1] Hao J,Narayanan K,Muni T,et al. Dentin matrix protein 4,a novel secretory calcium binding protein that modulates odonto blast differentiation[j]. J Biol Chem,2007,282(21): [2] Nalbant D,Youn H,Nalbant SI,et al. FAM20:an evolutionarily conserved family of secreted proteins expressed in hematopoietic cells[j]. BMC Genomics,2005(6):11. [3] Wang X,Hao J,Xie Y,et al. Expression of FAM20C in the osteogenesis and odontogenesis of mouse [J]. J Histochem Cytochem,2010,58(11): [4] Simpson MA,Hsu R,Keir LS,et al. Mutations in FAM20C are associated with lethal osteosclerotic bone dysplasia (Raine syndrome),highlighting a crucial molecule in bone development [J]. Am J Hum Genet,2007,81(5): [5] Fradin M, Stoetzel C, Muller J, et al. Osteosclerotic bone dysplasia in siblings with a Fam20C mutation[j]. Clin Genet, 2011,80(2): [6] Tagliabracci VS,Engel JL,Wen J,et al. Secreted kinase phos phorylates extracellular proteins that regulate biomineralization [J]. Science,2012,336(6085): [7] Ishikawa HO,Xu A,Ogura E,et al. The Raine syndrome protein FAM20C is a Golgi kinase that phosphorylates bio mineralization proteins[j]. PLoS One,2012,7(8):e [8] Sloan AJ,Smith AJ. Stem cells and the dental pulp:potential roles in dentine regeneration and repair[j]. Oral Dis,2007,13 (2): [9] Qin C,Baba O,Butler WT. Post translational modifications of sibling proteins and their roles in osteogenesis and dentinogenesis [J]. Crit Rev Oral Biol Med,2004,15(3): [10] Almushayt A,Narayanan K,Zaki AE,et al. Dentin matrix protein 1 induces cytodifferentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts[j]. Gene Ther,2006,13(7): [11] Gronthos S,Mankani M,Brahim J,et al. Postnatal human dental pulp stem cells(dpscs)in vitro and in vivo[j]. Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(25): [12] Sefton BM,Shenolikar S. Overview of protein phosphorylation [J]. Curr Protoc Protein Sci,2001(Chapter 13):Unit13.1. [13] Bingham EW,Farrell HJ,Basch JJ. Phosphorylation of casein. Role of the golgiapparatus[j]. J Biol Chem,1972,247(24): [14] Wang SK, Samann AC, Hu JC, et al. FAM20C functions intracellularly within both ameloblasts and odontoblasts in vivo [J]. J Bone Miner Res,2013,28(12): [15] Liu P,Zhang H,Liu C,et al. Inactivation of Fam20C in cells expressing type I collagen causes periodontal disease in mice[j]. PLoS One,2014,9(12):e [16] O'Sullivan J,Bitu CC,Daly SB,et al. Whole Exome sequencing identifies FAM20A mutations as a cause of amelogenesisimperfec ta and gingival hyperplasia syndrome [J]. Am J Hum Genet, 2011,88(5): [17] Wang SK,Aref P,Hu Y,et al. FAM20A mutations can cause enamel renal syndrome(ers)[j]. PLoS Genet,2013,9(2): e [18] Koike T,Izumikawa T,Tamura J,et al. FAM20B is a kinase that phosphorylates xylose in the glycosaminoglycan protein linkage region[j]. Biochem J,2009,421(2): [19] Tagliabracci VS,Wiley SE,Guo X,et al. A Single Kinase Generates the Majority of the Secreted Phosphoproteome [J]. Cell,2015,161(7): [20] Fisher LW,Torchia DA,Fohr B,et al. Flexible structures of SIBLING proteins, bone sialoprotein, and osteopontin [J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,280(2): [21] Fisher LW,Fedarko NS. Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLING family of proteins [J]. Connect Tissue Res,2003(44 Suppl 1): [22] Narayanan K,Srinivas R,Ramachandran A,et al. Differentia tion of embryonic mesenchymal cells to odontoblast like cells by overexpression of dentin matrix protein 1[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(8): [23] Wang X,Wang S,Lu Y,et al. FAM20C plays an essential role in the formation of murine teeth[j]. J Biol Chem,2012,287(43): [24] Wang X,Wang J,Liu Y,et al. The specific role of FAM20C in dentinogenesis[j]. J Dent Res,2015,94(2): [25] Feng JQ,Ward LM,Liu S,et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism[j]. Nat Genet,2006,38(11): [26] Wang X,Wang J,Yuan B,et al. Overexpression of Dmp1 fails to rescue the bone and dentin defects in Fam20C knockout mice [J]. Connect Tissue Res,2014,55(4): [27] Yang X,Yan W,Tian Y,et al. Family with sequence similarity member 20C is the primary but not the only kinase for the small integrin binding ligand N linked glycoproteins in bone [J]. FASEB J,2016,30(1): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 王嫚 ) 易柏成, 莫泽欢, 徐琼. FAM20C 在体外培养人牙髓细胞中的表达及成牙本质向分化诱导对其表达的影响 [J/CD]. 中华口 腔医学研究杂志 : 电子版,2016,10(5):