2 综述 牙髓干细 (stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED) [2], 来自儿童脱落乳牙的牙髓 ; (3) 根尖乳头干细胞 (stem cell from the apical papilla, SCAP)

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1 :57 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(12): DOI: /cjcb 应用牙源干细胞进行组织损伤修复的研究进展 邓琴南 1,2 张彬 2,3 高君宇 3 韩发彬 2,3* ( 1 Dr. Samuel QN. Deng Dental Clinic, San Francisco, CA94123, USA; 2 聊城市人民医院 / 泰山医学院聊城临床学院, 山东省口腔颌面医学生物学重点实验室, 聊城 ; 3 聊城市人民医院 / 泰山医学院聊城临床学院, 干细胞与再生医学重点实验室, 聊城 ) 摘要牙源干细胞是由人类牙齿及其周围相关组织中分离出的间充质干细胞 自 2000 年从牙髓组织中发现和分离出牙髓干细胞以来, 已有 7 种牙源干细胞被分离和鉴定 近年来, 不但对这些干细胞的分离 鉴定 生物学特征和功能进行了大量基础方面的研究, 而且对其临床应用也作了广泛的探讨 该文对牙源干细胞在口腔科学领域的应用, 如牙体 牙髓和牙周组织的修复和再造进行最新研究的综述, 以及对它们在全身疾病的治疗潜能方面作概括的介绍, 如在治疗脑血管意外, 脊髓神经损伤, 帕金森氏病, 心肌梗死, 糖尿病和免疫缺陷性疾病等方面的研究, 以促进牙源干细胞在基础与临床应用方面的深入研究 关键词牙源干细胞 ; 牙髓干细胞 ; 口腔颌面 ; 牙周组织 ; 组织修复 The Research Advance in Application of Dental Stem Cells for Repairing Injured Tissues Deng Qinnan 1,2, Zhang Bin 2,3, Gao Junyu 3, Han Fabin 2,3* ( 1 Dr. Samuel QN. Deng Dental Clinic, San Francisco, CA94123, USA; 2 Shandong Provincial Key Laboratory for Oral & Facial Medical Biology, Liaocheng People s hospital/the Affiliated Liaocheng Hospital, Taishan Medical University, Liaocheng , China; 3 Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Liaocheng People s hospital/the Affiliated Liaocheng Hospital, Taishan Medical University, Liaocheng , China) Abstract Dental stem cells (DSC) are mesenchyme stem cells isolated from human teeth and the associated tissues around the teeth. Since the isolation of dental pulp stem cells (DPSC) from dental pulp of teeth in the year of 2000, seven kinds of dental stem cells have been isolated and characterized. In recent years, researches on the characterization and biological functions of DSC have been widely investigated in the basic and clinical application of DSC. This review summarized the recent progress in using DSC to repair the teeth and teeth-associated tissues. In addition, the research applications of DSC in stroke, spinal cord injury, Parkinson s disease, cardiac infarction, diabetes and immune-deficient disorders are discussed in this review. Key words dental stem cell; dental pulp stem cell; oral-facial tissue; soft periodotal tissues; tissue repairing 1 牙源干细胞概述自 2000 年 Gronthes 分离出牙髓干细胞以来, 牙 源性干细胞 (dental stem cells, DSCs) 的研究越来越 多的引起重视 至今, 已从人类牙齿相关组织中分 离和鉴定出 7 种干细胞 : (1) 牙髓干细胞 (dental pulp stem cell, DPSC) [1], 来自恒牙牙髓 ; (2) 人类脱落乳牙 收稿日期 : 接受日期 : 2014 * 通讯作者 Tel: , hanfabin2@gmail.com Received: September 1, 2014 Accepted: October 1, 2014 This work was supported by the Developmental Fund of Shandong Science and Technology Department, Shandong, China (No. 2012GGA15049). *Corresponding author. Tel: , hanfabin2@gmail.com

2 2 综述 牙髓干细 (stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED) [2], 来自儿童脱落乳牙的牙髓 ; (3) 根尖乳头干细胞 (stem cell from the apical papilla, SCAP) [3-4], 来自牙根发育未完成的根尖乳头 ; (4) 牙 周膜干细胞 (periodontal ligment stem cell, PDLSC) 或牙周膜祖细胞 (periodontal ligment progenitor cell, PDLPC) [5-6], 均来自牙周膜 ; (5) 人类智齿牙滤泡祖细 胞 (precusor cell from human dental follicle of wisdon teeth, PC) [7], 或称为牙囊干细胞 (dental follicle stem cell, DFSC) [4], 来自智齿牙囊 ; (6) 牙槽骨干细胞 (alveolar bone proper derived stem cell, ABPSC) [8], 来 自牙槽骨骨髓 ; (7) 牙龈 / 口腔黏膜干细胞 (ginginval/ oral mucosa stem cell, OMSC) [8-11], 来自牙龈黏膜下 结缔组织或来自牙胚的间充质干细胞 (mesenchymal stem cell from tooth germ) [12], 其来源属于牙髓干 细胞 ; 另外还有根尖牙囊干细胞 (periapical follicle stem cell, PAFSC) [13], 属于上述的 SCAP 牙源性干 细胞具有间充质干细胞的功能特性和多向分化能 力, 并表达间充质干细胞的表面标志物如 CD44 CD73 CD105, 但不表达 CD34 和 CD45 [9,14] 不同 来源的牙源干细胞如图 1 所示 SHED DPSC ABPSC OMSC PDLSC SCAP DFSC SHED: 人类脱落乳牙牙髓干细胞 ; DPSC: 牙髓干细胞 ; ABPSC: 牙 槽骨干细胞 ; OMSC: 牙龈 / 口腔黏膜干细胞 ; PDLSC: 牙周膜干细胞 ; SCAP: 根尖乳头干细胞 ; DFSC: 牙囊干细胞 SHED: stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth; DPSC: dental pulp stem cell; ABPSC: alveolar bone proper derived stem cell; OMSC: ginginval/oral mucosa stem cell; PDLSC: periodontal ligment stem cell; SCAP: stem cell from the apical papilla; DFSC: dental follicle stem cell. 图 1 不同牙源干细胞的来源组织部位 Fig.1 Sources and locations of dental stem cells 2 牙源干细胞在口腔科学的应用研究在牙齿组织工程研究中, 目前常用的是牙髓干 细胞 (DPSC), DPSC 具有许多优点 [12,15] : (1) 来自自体 易于采集, 产生并发症可能性很低 ; (2) 来自阻生牙 或乳牙牙髓 DPSC 都能进行有效的分离和扩增, 并 有较强的增殖分化能力 ; (3) 生成牙釉质和牙本质 细胞能力较强 ; (4) 具有免疫抗炎能力, 有利于异体 移植研究与应用 根据牙齿组织再生的目的不同, 可以选用不同的牙源干细胞 DPSC 主要用于牙髓 及牙本质的修复再建 ; SCAP 主要用于牙根的生成 ; PDLSC 和 PDLP 则偏重牙周组织的重建 在临床上 主要是利用干细胞的分化和再生潜力促进组织愈合 和再生 [9,15-16] 2.1 牙本质 / 牙髓组织的修复和再生 近年研究报道, DPSC SHED 和 SCAP 都具有 一定多向分化潜能, 其中包括形成牙本质 / 牙髓样复 合体 [4,17-19] 目前牙本质 / 牙髓组织修复和再生方法 主要有以下几种 (1) 将牙源干细胞直接植入牙髓腔 Nakashima 等 [20] 用电穿孔技术将 BMP-2 基因导入 DPSC, 再植入 自体牙髓, 发现移植到犬牙牙髓损伤模型中的 DPSC 形成修复性牙本质 他们将 DPSC 或 DPSC+BMP-2 移植到犬牙牙髓腔, 可以显著地促进牙本质 / 牙髓复 合体的修复和再生 Gotlieb 等 [21] 研究报道, 用牙源 干细再生牙髓组织可以代替传统的根管治疗 (2) 将牙源干细胞与支架结合直接植入牙髓腔 上述将干细胞直接植入牙髓腔的方法较难成功, 关 键问题是来自根尖孔的血供不能满足干细胞的生存 需要以及牙髓组织本身自愈和再生力有限 Iohara 等 [22] 报道, 从 DPSC 中分离出 CD105 + 细胞亚群移植 到活体猎犬可以再生牙髓 他们将 CD105 + 牙髓干 细胞与胶原支架结合置入根管下部 根管上部加 入细胞因子 SDF-1 和磷酸锌粘固粉覆盖并以光敏塑 胶充填, 90 天后新生的牙髓样组织生长到釉牙本质 与粘固粉接触界面, 其内有类似正常人的牙髓细胞 新生毛细血管和神经突触从根尖孔长入新生牙髓 所以, Iohara 等认为, DPSC 的 CD105 + 亚群对人类牙髓 组织的再生与修复具有更重要的临床应用潜力 [22] (3) 将牙源干细胞和支架材料先植入动物体内, 再取出植入人体牙髓腔 Huang 等 [23] 报道, 将 DPSC 或 SCAP 种植到聚合物支架上并移植到小鼠的皮下 经过一定时间, 将此含牙源干细胞的支架取出, 再植

3 邓琴南等 : 应用牙源干细胞进行组织损伤修复的研究进展 3 入人体根管 结果发现, 有新生血管生长入人体牙髓组织, 并形成牙本质样组织生长在根管内壁上 但是这层再生的牙本质样组织与天然的不同, 如无牙本质小管及牙本质细胞形态异常等 (4) 将牙源干细胞和支架材料生长在人类牙组 [17] 织块上, 再植入动物体内 Prescott 等将 DPSC 胶原支架和 DMP-1 组成的结合体置于牙本质的人工穿孔处, 再植入裸鼠的皮下生长 在裸鼠体内生长 6 周后, 可见穿孔处有良好的牙本质 / 牙髓复合体生成 [24] Cordeiro 等将 SHED 种植在生物支架上, 再将此支架植入人类牙片内 结果发现, 有类似生理性牙髓组织形成 通过透射电镜和免疫组化实验研究表明, 移植的 SHED 分化为牙本质细胞和血管内皮细胞 [25] Sakai 等通过牙片模型 (tooth slice model) 研究发现, 以多聚乳酸 (poly-l-lactic acid, PLLA) 支架和 DPSC 再生的人工牙髓上有新生牙本质形成 2.2 牙周组织的修复和再生 [26] He 等应用干细胞进行了牙周再生的早期研 [27] 究 随后, Yen 等进行了 全牙再生 的研究报道 牙周组织主要包括上皮 牙骨质 牙槽骨和牙周膜四种组织, 其再生需要细胞 信号分子 血管和支架材料四种成分才能形成完整的牙周组织 不同类型的干细胞组合可以作为牙周组织修复和再生的干细胞来源 (1) 单独使用一种干细胞进行牙周组织修复 由于 PDLSC 和 PDLP 可以衍生出牙周膜, 并可分化为成骨细胞 成牙骨质细胞和成纤维细胞, 因此首选 PDLSC 和 PDLP 进行牙周组织修复 其他可以利用的干细胞包括骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC) 脂肪干细胞 (adipose-derived stem cell, ADSC) 和胚胎干细胞 [28] (embryonic stem cell, ESC) Dangaria 等对牙髓干细胞 牙周干细胞和牙滤泡干细胞进行比较研究发现牙周膜干细胞产生并表达骨膜素 (periostin) 和腱蛋白 (scleraxis) 最高 牙周膜干细胞在天然牙根表面一般经 3 周培养后能形成新的牙周膜 若将此牙根植入牙槽骨, 即可形成新的牙周膜并与牙槽稳定固位 另外可将其他的干细胞先与牙周膜 (PDL) 细胞共同培养, 使其获得 PDLSC 的特性, 再用于牙周组织 [26] 的修复和再生 (2) 两种牙源干细胞联合进行牙周组织的修复 将 SCAP 和 PDLSC 结合支架材料, 用于修复和再生 牙周组织 近年的研究包括以下几种方法 : 第一, 将 [6] 干细胞直接植入缺损区 Seo 等在免疫抑制的大鼠下颌磨牙区造成牙周手术缺损, 然后将人体 PDLSC 植入, 结果发现 6 例样本中有 2 例可见 PDLSC 融入牙周膜的部位, 并有少量 PDLSC 附着在牙槽骨和牙齿的表面 这些发现表明, PDLSC 在牙周再生中有潜在的治疗作用 第二, 将干细胞先在体外培养 扩增和定向 [29] 分化, 再用于牙周缺损修复 Yamada 等将自体骨髓间充质干细胞 (BMMSC) 在体外培养和定向分化后, 与富含血小板的血浆混合再用于修复牙周缺损, 结 [30] 果发现修复效果明显提高 Kawaguchi 等用自体骨髓间充质干细胞 (BMMSC) 在体外扩增, 然后移植到动物模型的牙周缺损区, 结果发现 4 周后缺损完全修复 虽然 BMMSC 并非牙源干细胞, 但 BMMSC 和牙源干细胞同属间充质干细胞 (MSC), 因而它们具有相似的功能 第三, 干细胞移植与常规牙周手术结合 特别是施行深部洁治和根面平整术时 (scaling and root plannin, SRP), 通常干细胞移植与传统的牙周炎治疗 [24,31] 相结合才能取得更好的治疗效果 (3) 干细胞与细胞生长因子及辅助材料结合修复牙周组织 目前常用的细胞生长因子有 TGF-β bfgf BMP IGF-1 PDGF BMP-2 和 Emdogain 等 应用这些细胞因子使牙源干细胞处于一个类似天然微环境条件下更好的发挥作用 有研究者使用 PDLSC PDGF 和 BMP, 结果发现牙周组织的三个组成部分均能得到再生修复 将干细胞 SCAP 和 PDLSC 置入颗粒性的羟化磷灰石 / 磷酸三钙 (HA/ TCP) 组成的支架上, 然后植入猪的牙槽可见牙根 / 牙周组织复合体的形成 另外将多聚糖酸 (Polyglycolic acid, PLGA) 支架材料与 PDLSC 结合用于牙周修复 [27] 也取得明显效果 由于过去的支架制造过程复杂 做成的支架与牙周缺损形状相差较大, 而且无法控制成品支架小孔的状态, 近年发展的 3D 快速成形 (Rapid prototyping, RP) 加上纳米技术, 可以克服以上缺陷, 并能在几小时内形成 3D 个体化支架, 开拓了用干细胞与支架材料结合修复牙周组织缺损的 [26] 新方法 [13] Park 等报道, 在猎犬的牙周用手术造成巨大缺损并用异物引发炎症, 然后将三种牙源性干细胞 PDLSC, DPSC 和 PAFSC( 根尖牙囊干细胞, 取自未成熟的根尖部牙囊组织, 属于 SCAP) 通过与颗粒载体结合, 分别置入缺损区, 结果发现三种牙源干细胞移

4 4 综述 植 2 个月后, 实验组动物的牙周袋变浅, 牙槽骨 牙周膜和牙骨质都有再生, 组织学检查发现牙周膜中的 Sharpey 氏纤维能长入牙骨质, 还可见明显的外周神经和新生血管生成 以上三种牙源干细胞以 PDLSC 修复效果最好, PAFSC 次之, DPSC 居第三 该研究对牙源干细胞治疗重症牙周炎的机理进行了探讨, 结果提示牙源干细胞除了能提供再生的细胞之外, 还可通过阻止上皮细胞向根尖方向的生长, 提供组织再生需要的空间, 激发受体本身的间充质干细胞及调节免疫和抗炎作用促进组织再生 Fawzy [32] 等报道以牙龈干细胞进行牙周再生的研究 他们用猪的牙齿动物模型造牙齿巨大缺损 将边缘性牙龈内结缔组织分离的牙龈干细胞分别与两种不同的支架 ( 无机脱蛋白网状骨支架和有机的胶原支架 ) 结合置入缺损区 细胞移植前后均作牙周炎的临床表现和组织学检查 结果显示, 牙龈干细胞与支架植入 12 周后, 牙周炎临床表现中临床附着水平 牙周袋深度和牙龈萎缩程度改善均显著高于对照组, 组织学的检测可见牙周组织的再生如牙槽骨高度 附着上皮和结缔组织再生均有显著改善, 并有规则的 Sharpey 氏纤维插入牙骨质 此研究表明, 通过干细胞与支架的移植, 可以使有出血 骨缺损 牙周袋加深和牙龈萎缩的牙周炎组织得以再生修复 Feng [5] 等应用 PDLP 对 3 例患者的 16 颗牙进行治疗牙周炎的临床研究 他们先拔除患者第三磨牙, 从牙周膜中分离 PDLP 和体外扩增, 然后和生物骨移植材料 (CALCITITE4060-2) 一起置入自体牙周炎病人患牙的骨下缺损处 移植 PDLP 后发现牙周袋深度下降 牙龈回缩, 临床患牙松动度下降及牙周组织得到重建 术后 72 个月 X 线检查显示牙周的骨质再建和支架逐步吸收 所有的患者均未发现局部和全身的不 [26] 良反应 He 等提出了以牙源性干细胞再生牙周组织的基本过程应包括 : (1) 收集干细胞 冷藏备用 (2) 在临床使用之前, 将需要的细胞因子 ( 如 BMP PDGF TGF-β 和 FGF-2 等 ) 导入牙源干细胞 (3) 应用 CT 或 MRI 收集患者个体的牙周缺损资料, 以此制作个体化模型 (4) 选择要使用的支架材料和 RP 技术 (5) 制作符合个体缺损的并能与干细胞相结合的复合支架 (6) 将牙源干细胞与支架复合物植入牙周组织缺损区观察修复效果 2.3 牙体的再生目前的植牙术缺乏天然牙根的外形和牙周膜, 因此, 再生天然的牙根或全牙是临床上急需解决的难题 有研究者试用非牙源性干细胞, 为牙体的再 [33] 生进行了探索性的研究 Ohazama 等将胚胎牙上皮与成人的骨髓基质细胞结合, 再植入动物肾囊, 结果发现形成牙样结构 进一步研究表明, 用神经干细胞 (neural stem cell, NSC) 胚胎干细胞(ESC) 和成人骨髓间充质干细胞 (BMMSC) 合成的胚胎性口腔上皮植入成人的颌骨和动物肾囊, 发现有牙样结构 [34] 和骨质的再生 Ferro 等也成功地在体外将脂肪衍生干细胞 (ADSC) 转分化为 3D 的类似牙蕾的器官和表型 这些研究对用牙源性干细胞再造牙体具有重 [27] 要的指导作用 [12] 牙冠再生 Yu 等将 DPSC 和成年鼠的根尖牙蕾细胞 (apical bud cells) 结合, 在植入活体后形成典型的牙冠样结构, 其中包括成釉细胞层 牙釉质 牙本质 前期牙本质和成牙本质的细胞层, 但是这个以 DPSC 为基础的方法, 至今未能观察到牙根的形成 人类釉质是由成牙的上皮组织发育而成的, 对于牙上皮性干细胞 ( 亦即能表达釉质蛋白的干细胞 ) 还在探索阶段 正常人的牙齿, 成牙的上皮干细胞已消失 只有在动物中, 如小鼠切牙的颈环尚有成 [35] 牙上皮的干细胞存在 Nagano 等报道成牙本质细胞具有牙釉质蛋白表达, 为用非成釉细胞合成牙釉质带来希望 [36] 牙根再生 Sonoyama 等用 SCAP 和 PDLSC 分别与 HA 或 TCP 支架材料结合, 再植入猪下颌骨的牙槽窝, 3 个月后形成生物性牙根可供牙齿修复打桩和作冠 此牙根由 SCAP 生产的牙本质组成, 周围有牙周膜围绕, 并与牙槽骨形成天然的结合 但其缺点是残余在牙本质内的 HA, 降低了牙根的强度, 另 [12] [37] 外其组织相容性还有待长期的研究 Guo 等用大鼠的牙囊干细胞 (DFSC), 经 9 个月传代培养后收集, 接种在牙本质基质支架上, 再植入大鼠牙槽窝, 结果在 4 周后形成牙根样组织 但同样的 DFSC 植入颅骨则不能形成牙根 此结果表明 DFSC 与牙本质基质支架需要牙槽窝的微环境才能再生出牙根 全牙再生人类牙齿的形成有赖于成牙上皮和成牙性间充质的相互作用 但牙胚形成牙釉质的过程一旦完成 牙体一旦萌出, 成牙性上皮细胞随即凋亡消失 所以许多研究都将牙源性干细胞与 [38] 牙胚细胞合用 Ikeda 等报导从小鼠牙齿发育的杯状期分离出成牙上皮细胞, 将其与 DPSC 结合在胶原

5 邓琴南等 : 应用牙源干细胞进行组织损伤修复的研究进展 5 凝胶上进行体外培养, 形成的牙胚植入小鼠颌骨内, 结果发现此生物合成牙与牙槽骨结合良好, 并具有天然牙齿的功能 目前, 进行全牙再生的细胞主要有四种来源 : 牙胚的组织细胞, 包括整个牙胚或部分牙胚或牙胚分离的细胞 ; 成体的组织细胞, 如牙髓和牙龈细胞等 ; 牙源性和非牙源性干细胞, 非牙源性干细胞有骨髓间充质干细胞 (BM-MSC) 和脂肪干细胞 (ADSC); 由自体组织细胞经体细胞重编程产生的诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cell, ipsc) 以上四种细胞可单独使用或联合使用诱导全牙再生 目前全牙再生的实验方法有 : (1) 将牙胚组织或细胞先植入活体的某一部位, 如鸡尿囊绒膜 肾囊下或皮下等, 待形成牙冠后, 再将移植体植入颌骨产生牙齿 (2) 将分离的细胞先在体外先培养 诱导 扩增后, 再植入活体的牙槽骨或其他部位产 [4,12,34,38-40] 生全牙 成体牙源性干细胞是间充质干细胞 (MSC) 的一种, 但不包括成牙性上皮细胞 因此利用牙源性干细胞再造全牙, 存在缺乏成牙性上皮的缺陷 近来, 随诱导多能干细胞 (ipsc) 技术的发展, 为全牙再生带来希望 利用 ipsc 再生生物牙的简要过程包括 : 体外分离和扩增自体的 DPSC 将 4 个重编程基因 (Oct4 Sox2 KLf4 和 c-myc) 导入体细胞如 DPSC 形成 ipsc 并诱导 ipsc 分化为成牙性上皮细胞以及成牙性上皮细胞与自体 DPSC 结合后植入人体颌骨, 使其 [12,41] 继续生长和再生全牙 由于生物牙再生还存在很多问题如人类成牙性上皮细胞来源有限, 目前仅有的细胞来源只是未分化成熟的智齿和阻生牙, 因此利用 ipsc 技术进行牙齿再生将是具有发展前景的 [27,38] 重要研究方向 2.4 颅骨 颌骨及面骨的损伤修复研究 [42] d Aquino 等用 DPSC 成功培养出骨组织碎片, 将此碎片植入动物可产生有血管供应的板状骨 他们还报道了用 DPSC 治疗下颌骨缺损的临床研究结果 他们先拔取患者的上颌智齿, 分离培养自体 DPSC, 再将其植入明胶载体产生 DPSC 复合体 然后拔除双侧下颌智齿, 一侧置入 DPSC 复合体, 另侧作对照 结果发现, 术后 60 天实验侧第二磨牙皮质骨垂直增生至牙釉与本骨质交界 术后 3 个月, 上皮附着高度 新生骨组织 BMP-2 和血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达在实验侧显著优于对侧 术后 1 年, 实验侧完全稳定骨化, 达到第二磨牙骨质再生的目 [42] [39] 的 另外, Seo 等报道 SHED 在动物身上能使大 [43] 面积的颅骨缺损修复 Riccio 等也报道应用人类 DPSC 配合丝纤蛋白支架修复了大鼠顶骨的大片缺损 但也有研究报道用非牙源性干细胞如 ADSC 或 BM-MSC 修复颅面缺损, 还有研究报道用 ADSC 或 BM-MSC 结合 BMP-2 细胞因子和支架进行颅骨缺损 [44-45] 修复 2.5 口腔科学其他方面应用的研究 牙源干细胞与再植牙手术结合牙齿再植术适用于外伤脱臼的牙齿以及在口腔外科进行根管治疗的病牙 再植牙一般术后都能与牙槽愈合, 但缺乏牙周膜并会有牙根逐渐吸收和脱落的缺点 近年牙源干细胞与再植术结合提高了再植的效果 [28] Dangaria 等将大鼠的上磨牙进行再植研究, 再植前在牙根表面涂上 PDLSC, 6 个月后未涂干细胞的对照牙牙根全部吸收, 而涂有 PDLSC 的牙根未发现吸收, 组织学检查发现有干细胞结合的种植牙牙根表面形成明显的牙周膜 牙源干细胞与钛合金种植牙结合 Mangano [46] 等对 DPSC 与钛合金表面的结合部位进行基因表达的研究, 结果发现 DPSC 能很快分化为成骨细胞和内皮细胞沿合金表面形成骨组织, 并表达相应的特异蛋白标志物 此结果表明, 牙源干细胞移植具有促进种植牙牙周膜再生的作用 另有研究证明, 移植的牙源干细胞可能在钛合金种植牙根的表面形成 [47] 牙周膜, 从而克服现代种植牙缺乏牙周膜的缺点 牙源干细胞与透明质酸 HA 涂面的种植牙 [48] 结合 Yamada 等报道, 当 DPSC 或 SHED 与 PRP 合用, 所形成的骨质能与涂有透明质酸 (hyaluronic acid, HA) 的种植牙根更好的结合 他们用动物犬造成骨缺损模型后, 随机分成 5 组进行研究 : 在缺损中单独加入 PRP 组 加入 PRP 和 BMMSC 组 加入 PRP 和成年犬的 DPSC 组 加入 PRP 和幼犬的 SHED 组和对照组 结果发现, 植入干细胞的三组种植牙在 HA 涂面形成良好成熟的骨组织和血管 牙源干细胞促进伤口软组织愈合 Nishino [49] 等报道关于 SHED 促进伤口癒合的研究 他们用手术制造小鼠切割伤模型, 伤口处理分以下 4 组 : 植入 SHED 植入 MSC 植入成纤维细胞和磷酸盐缓冲液对照 分别在术后 天评估伤口的癒合情况 结果表明移植干细胞的前三组愈合比对照组显著加快, 组织学检查可见移植细胞被人类 HA 结合

6 6 综述 蛋白所围绕, 同时发现干细胞组 HA 表达明显增加 此研究提示 SHED 和人类间充质干细胞 (MSC) 都具 有促进伤口愈合作用 3 牙源性干细胞在其他疾病研究中的应用 3.1 牙髓干细胞用于脑血管意外损伤修复研究 Yang 等 [50] 通过诱导人类第三磨牙的 DPSC, 并 诱导其转化为神经干细胞 将此 NSC 细胞移植到大 脑中动脉栓塞大鼠模型, 结果发现治疗组的神经性 障碍明显改善 Sugiyama 等 [51] 从猪牙髓衍生取得 DPSC 细胞 (CD31 /CD146 ) 将 Sprague-Dawley 大鼠 进行大脑中动脉栓塞 (TMCAO), 24 小时后将 DPSC 细胞 (CD31 /CD146 ) 注入大脑 结果发现, DPSC 细胞体内分化为 NSC 及神经细胞, 表达 doublecortin 的神经细胞数上升 2 倍 ; 表达 NeuN 的神经细胞增长 8 倍 ; 在缺血的脑部 VEGF 的水平比正常大脑提高 28 倍 此结果表明来自牙髓的 DPSC 细胞 (CD31 / CD146 ), 能够促进移植的和内源性神经干细胞的分 化, 并且诱导血管形成和改善脑部中动脉栓塞后的 缺血状况 Kiraly 等 [52] 研究由 DPSC 分化的神经干细 胞移植到 CNS 后与脑组织的整合 并发现如下改变 : 注入的 DPSC 以单细胞方式迁移到脑部各部位, 但大 多数集中在神经干细胞区带 (SVZ SGZ SCZ), 并 于创伤后迁移到受损伤区 ; 移植的 DPSC 表达多种神 经细胞标志物如 N-tubulin NF-M NeuN 和神经胶 质细胞标志物 GFAP 这些标志在受伤 4 周后在皮质 病变区的 DPSC 中表达明显升高 ; 植入的细胞表现出 神经细胞和神经胶质细胞的有关电生理特性 他们 的研究结果提示, DPSC 分化的细胞可以与宿主大脑 整合, 以促进脑组织的损伤修复 Leong 等 [53] 报道 DPSC 治疗脑中风的动物实验 报告 他们用小鼠造成局部脑缺血 24 小时后, 向脑 内注射 DPSC 结果在 4 周后发现, 小鼠前肢感觉功 能的明显改善, 提示移植的细胞可在脑内存活, 并能 向病灶迁移 另外在梗死的纹状体周围发现移植的 DPSC 可分化为神经细胞和星形胶质细胞 因此他 们认为 DPSC 治疗中风的机制不仅是替代神经细胞, 而且可以通过 DPSC 分泌细胞因子发挥作用 3.2 牙髓干细胞用于脊髓损伤的修复研究 神经组织细胞一旦受到损伤, 周围胶质细胞趋 于密集, 形成纤维胶质性疤痕, 阻碍神经细胞及其轴 索的再生 因此在损伤早期移植干细胞是促进神经 元再生修复的关键 由于中枢神经系统只有海马齿状回的颗粒下层和侧脑室下层等少数区域存在内源神经干细胞 (NSC), 但无法自此两部位分离自体 NSC 来修复颅脑和脊髓损伤 因此必须从其他组织 [38] 中寻找干细胞的来源 在动物的胚胎发育中牙髓是发源于神经脊 神经脊在发育过程中形成神经系 [54] 统和脊髓 Nosrat 等研究表明, 神经元可以从牙髓的干细胞诱导分化产生 随后许多研究进一步表 [55] 明, DPSC 具有转化为神经元的能力 Huang 等成功地将 DPSC 移植到在小鼠海马区, 并在体内分化为神经细胞, 为牙源性干细胞修复中枢神经系统疾病提供了证据 其他牙髓干细胞如 PDLSC DFSC 和 [39] [25] SHED 等也具有神经分化能力 另外, Nosrat 等在动物模型中还发现, 牙源性干细胞可以分泌细胞因子促使轴突生长, 同时能提高损伤脊髓的运动神 [25] 经元的生存能力 Sakai 等移植 DPSC 和 SHED 到脊髓全断大鼠, 结果发现 DPSC 和 SHED 的表面标志 基因表达和分泌的细胞因子发生明显改变 移植 DPSC 和 SHED 后脊髓全断大鼠后肢的运动功能明显恢复及神经轴突明显再生 通过以上研究发现, DPSC 可能通过 3 个方面促进脊髓损伤修复 : 抑制损伤导致的神经元 星形胶质细胞和少突胶质细胞的凋亡 ; 直接抑制多种阻碍轴突生长的抑制因子如硫酸软骨素 蛋白聚糖和髓磷脂等相关糖蛋白 ; 分化为成熟的少突胶质细胞促进神经轴索生长 3.3 牙髓干细胞用于帕金森氏病修复研究 [56] Nesti 等将 DPSC 与中脑神经组织细胞联合培养后移植到体外帕金森氏病 (Parkinson s disease) 模型上, 发现 DPSC 提高大脑神经细胞对 MPP + 或鱼藤 [57] 酮所导致神经毒性的保护作用 Ibarratxe 等报道了牙髓干细胞用于帕金森氏病修复治疗具有许多优越性 : 牙源性干细胞比较容易得到自体细胞, 可避免免疫排斥和炎症反应 ; DPSC 本身具有神经细胞及胶质细胞标记物的表达 ; DPSC 具有类似神经元的电活动如表达神经细胞的受体, 并产生动作电位 ; DPSC 可在宿主的神经组织内生长存活 ; 牙源干细胞可分泌许多细胞因子如 BDNF GDNF IGF 和 IL 对比邻细胞的存活起到免疫调节作用 但是至今为止, 移植到神经组织内的 DPSC 和 MSC 是否真正转分化为 NSC 是否真正能和宿主的神经元形成功能性的突触连接, 还有待于进一步研究

7 邓琴南等 : 应用牙源干细胞进行组织损伤修复的研究进展 牙髓干细胞用于心肌梗死 糖尿病和免疫缺 陷性疾病的修复研究 Gandia 等 [58] 用冠状动脉结扎法在大鼠裸鼠造 成急性心肌梗死的模型, 并将 DPSC 注入心肌内 4 周之后显示心肌功能改善, 梗死区缩小, 新血管形 成增加 他们认为, DPSC 可以作为急性心肌梗死 细胞疗法的干细胞来源 另一项研究表明, 对来自 智齿的牙源性干细胞进行体细胞重编程, 可使牙源 性干细胞回转为具有胚胎干细胞 (ESC) 性质的诱导 多能干细胞 然后在体外分化成能跳动的心肌细 胞 [39,59] Xin 等 [60] 报道牙源性干细胞分化为心肌细 胞主要通过调节 P13 激酶 /Akt 信号通道能诱导牙源 性干细胞向心肌细胞分化, 牙源性干细胞也可以作 为心肌细胞再生的细胞来源 近年来, 干细胞治疗 糖尿病的研究, 一方面是产生能分泌胰岛素的细胞 ; 另一方面是利用干细胞调节免疫反应发挥对胰腺 抗原的耐受 [39] Huang 等 [4] 研究表明, PDLSC 能产 生胰岛素, 并且能够通过免疫调节作用降低血糖 Govindasamy 等 [61] 报道将 DPSC 分化为胰岛样细胞聚 集体 (islet-like cell aggregates, ICA) 并发现其表达 相应的转录因子如 CPP Pdx1 Pdx 4 Pdx 6 Ngn 和 Isl1 等, 从而起到调节血糖治疗糖尿病的作用 研 究表明, MSC 对很多自身免疫疾病 ( 系统性红斑狼 疮 类风湿关节炎 多发性硬化症等 ) 有一定的疗效, 可能是通过免疫调节发挥作用 [47,62] 牙源性干细胞 属于 MSC 的一种, 也提示牙源性干细胞移植能够改 善自身免疫性疾病造成的组织损伤 此研究将是今 后重要的研究方向之一 4 结论与展望牙源干细胞 (DSC) 是取自牙齿和牙周组织的间 充质干细胞, 具有与骨髓间充质干细胞相似的形态 和功能特点 由于 DSC 具有取材方便, 增殖能力强 及成骨分化等特性, 对于牙齿 牙髓损伤及牙周病 组织损伤修复和全牙再生具有重要应用价值 同时 因其具有分化为神经细胞, 心肌细胞及其它细胞的 多向分化能力, 使其成为修复神经损伤与神经退行 性疾病, 心肌梗死和糖尿病等的重要细胞来源 另 外, 牙源干细胞与其它牙科技术联合应用, 可以提高 再植牙和种植牙的治疗效果 但目前牙源干细胞研 究多数处于体外培养鉴定, 多向分化及动物实验阶 段, 今后的研究将以牙源干细胞的临床转化应用为 目的, 开展多方面的深入研究 参考文献 (References) 1 Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(25): Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG, et al. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(10): Sonoyama W, Liu Y, Yamaza T, Tuan RS, Wang S, Shi S, et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: A pilot study. J Endod 2008; 34(2): Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: Their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res 2009; 88(9): Feng F, Akiyama K, Liu Y, Yamaza T, Wang TM, Chen JH, et al. Utility of PDL progenitors for in vivo tissue regeneration: A report of 3 cases. Oral Dis 2010; 16(1): Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 2004; 364(9429): Morsczeck C, Gotz W, Schierholz J, Zeilhofer F, Kuhn U, Mohl C, et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biol 2005; 24(2): Fawzy El-Sayed KM, Dorfer C, Fandrich F, Gieseler F, Moustafa MH, Ungefroren H. Erratum to: Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Adv Biochem Eng Biotechnol 2013; 130: Mitrano TI, Grob MS, Carrion F, Nova-Lamperti E, Luz PA, Fierro FS, et al. Culture and characterization of mesenchymal stem cells from human gingival tissue. J Periodontol 2010; 81(6): Marynka-Kalmani K, Treves S, Yafee M, Rachima H, Gafni Y, Cohen MA, et al. The lamina propria of adult human oral mucosa harbors a novel stem cell population. Stem Cells 2010; 28(5): Fournier BP, Ferre FC, Couty L, Lataillade JJ, Gourven M, Naveau A, et al. Multipotent progenitor cells in gingival connective tissue. Tissue Eng Part A 2010; 16(9): Yan M, Yu Y, Zhang G, Tang C, Yu J. A journey from dental pulp stem cells to a bio-tooth. Stem Cell Rev 2011; 7(1): Park JY, Jeon SH, Choung PH. Efficacy of periodontal stem cell transplantation in the treatment of advanced periodontitis. Cell Transplant 2011; 20(2): Zhang N, Wang W, Chen B, Chen C, Jia X, Ding Y, et al. Isolation and chracterization of human dental pulp stem cells. Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition) 2014; 4(3): Tatullo M, Marrelli M, Shakesheff KM, White LJ. Dental pulp stem cells: Function, isolation and applications in regenerative medicine. J Tissue Eng Regen Med Bossu M, Pacifici A, Carbone D, Tenore G, Ierardo G, Pacifici L, et al. Today prospects for tissue engineering therapeutic approach in dentistry. Scientific World Journal 2014; 2014: Prescott RS, Alsanea R, Fayad MI, Johnson BR, Wenckus CS,

8 8 综述 Hao J, et al. In vivo generation of dental pulp-like tissue by using dental pulp stem cells, a collagen scaffold, and dentin matrix protein 1 after subcutaneous transplantation in mice. J Endod 2008; 34(4): Murray PE, Garcia Godoy C, Garcia Godoy F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated? Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2007; 12(3): E Garcia-Godoy F, Murray PE. Recommendations for using regenerative endodontic procedures in permanent immature traumatized teeth. Dent Traumatol 2012; 28(1): Iohara K, Nakashima M, Ito M, Ishikawa M, Nakasima A, Akamine A. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res 2004; 83(8): Gotlieb EL, Murray PE, Namerow KN, Kuttler S, Garcia-Godoy F. An ultrastructural investigation of tissue-engineered pulp constructs implanted within endodontically treated teeth. J Am Dent Assoc 2008; 139(4): Iohara K, Imabayashi K, Ishizaka R, Watanabe A, Nabekura J, Ito M, et al. 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9 邓琴南等 : 应用牙源干细胞进行组织损伤修复的研究进展 9 regeneration with deciduous tooth stem cells, dental pulp stem cells, or bone-marrow-derived mesenchymal stem cells for clinical study using tissue engineering technology. Tissue Eng Part A 2010; 16(6): Nishino Y, Yamada Y, Ebisawa K, Nakamura S, Okabe K, Umemura E, et al. Stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) enhance wound healing and the possibility of novel cell therapy. Cytotherapy 2011; 13(5): Yang KL, Chen MF, Liao CH, Pang CY, Lin PY. A simple and efficient method for generating Nurr1-positive neuronal stem cells from human wisdom teeth (tnsc) and the potential of tnsc for stroke therapy. Cytotherapy 2009; 11(5): Sugiyama M, Iohara K, Wakita H, Hattori H, Ueda M, Matsushita K, et al. Dental pulp-derived CD31(-)/CD146(-) side population stem/progenitor cells enhance recovery of focal cerebral ischemia in rats. Tissue Eng Part A 2011; 17(9-10): Kiraly M, Kadar K, Horvathy DB, Nardai P, Racz GZ, Lacza Z, et al. Integration of neuronally predifferentiated human dental pulp stem cells into rat brain in vivo. Neurochem Int 2011; 59(3): Leong WK, Henshall TL, Arthur A, Kremer KL, Lewis MD, Helps SC, et al. Human adult dental pulp stem cells enhance poststroke functional recovery through non-neural replacement mechanisms. Stem Cells Transl Med 2012; 1(3): Nosrat IV, Smith CA, Mullally P, Olson L, Nosrat CA. Dental pulp cells provide neurotrophic support for dopaminergic neurons and differentiate into neurons in vitro; implications for tissue engineering and repair in the nervous system. Eur J Neurosci 2004; 19(9): Huang AH, Snyder BR, Cheng PH, Chan AW. Putative dental pulp-derived stem/stromal cells promote proliferation and differentiation of endogenous neural cells in the hippocampus of mice. Stem Cells 2008; 26(10): Nesti C, Pardini C, Barachini S, D Alessandro D, Siciliano G, Murri L, et al. Human dental pulp stem cells protect mouse dopaminergic neurons against MPP+ or rotenone. Brain Res 2011; 1367: Ibarretxe G, Crende O, Aurrekoetxea M, Garcia-Murga V, Etxaniz J, Unda F. Neural crest stem cells from dental tissues: A new hope for dental and neural regeneration. Stem Cells Int 2008; 2012: Gandia C, Arminan A, Garcia-Verdugo JM, Lledo E, Ruiz A, Minana MD, et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells 2008; 26(3): Oda Y, Yoshimura Y, Ohnishi H, Tadokoro M, Katsube Y, Sasao M, et al. Induction of pluripotent stem cells from human third molar mesenchymal stromal cells. J Biol Chem 2010; 285(38): Xin LZ, Govindasamy V, Musa S, Abu Kasim NH. Dental stem cells as an alternative source for cardiac regeneration. Med Hypotheses 2013; 81(4): Govindasamy V, Ronald VS, Abdullah AN, Nathan KR, Ab Aziz ZA, Abdullah M, et al. Differentiation of dental pulp stem cells into islet-like aggregates. J Dent Res 2011; 90(5): Daltoe FP, Mendonca PP, Mantesso A, Deboni MC. Can SHED or DPSCs be used to repair/regenerate non-dental tissues? A systematic review of in vivo studies. Braz Oral Res 2014; 28(1): doi: / BOR-2014.