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1 中国组织工程研究第 18 卷第 37 期 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 牙髓细胞成牙本质分化的体外诱导 : 诱导因子及机制揭示 邹慧儒 1,Steven Brookes 2,Xuebin Yang 2 ( 1 南开大学口腔医院, 天津市口腔医院, 天津市 ; 2 Department of Oral Biology,Leeds Dental Institute, University of Leeds,Leeds LS2 9LU,UK.) 文章亮点 : 1 此问题的已知信息 : 大量研究表明, 牙髓细胞具有多向分化能力, 在一定条件下经诱导可以向成牙本质细胞方向分化, 该定向诱导由多种分子组成的信号网络调控, 包括生长因子 信号分子 转录因子等 2 文章增加的新信息 : 系统归纳了牙髓细胞在不同的诱导因子作用下, 例如 : 骨形态发生蛋白 β- 甘油磷酸钠 抗坏血酸及多种生长因子等, 通过相关信号通路作用, 经过诱导在一定程度上向成牙本质细胞分化, 为研究牙髓细胞成牙本质分化提供参考 3 临床应用的意义 : 随着研究的不断进展, 牙髓细胞有望作为种子细胞, 在一定诱导因子的作用下, 通过激活或抑制某些信号转导通路向成牙本质方向分化, 从而达到牙髓 - 牙本质复合体再生甚至牙齿再生, 实现应用生物学方法修复临床牙体缺损, 再造 生物功能牙 的目的 但目前研究方向多样, 结果不一, 许多具体问题尚待解决 相信随着研究探索的进一步深入, 基础研究获取的信息将会越来越接近临床应用 关键词 : 干细胞 ; 诱导 ; 牙髓细胞 ; 成牙本质细胞分化 ; 信号转导主题词 : 牙髓 ; 成牙质细胞 ; 信号传导基金资助 : 天津市卫生局科技基金资助项目 (2012KY19) 邹慧儒, 女,1979 年生, 河北省秦皇岛市人, 汉族, 英国利兹大学口腔医学院毕业, 博士, 主要从事牙本质再生方面的研究 doi: /j.issn [ 中图分类号 :R318 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) 稿件接受 : 摘要背景 : 研究表明牙髓细胞在一定条件下经诱导可以向成牙本质细胞方向分化, 该过程由信号网络调控 目的 : 综述牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的诱导因子及作用机制的研究进展 方法 : 应用计算机检索 1998 年 1 月至 2014 年 7 月中国知网 (CNKI) 和万方数据库相关文献, 检索词 牙髓细胞, 成牙本质细胞分化 限定文献语言种类为中文 同时计算机检索同期 PubMed 数据库相关文献, 检索词 dental pulp cells,odontoblastic differentiation, 限定文献种类为英文 初检所得文献 467 篇 包括中文 214 篇, 英文 253 篇 对于初检文献, 阅读标题和摘要进行初筛, 排除因研究目的与本研究无关者或内容重复性的研究, 最终纳入 63 篇文章进行综述 结果与结论 : 不同的诱导因子可以作为调控器, 文章系统归纳了牙髓细胞在不同的诱导因子作用下, 例如 : 骨形态发生蛋白 β- 甘油磷酸钠 抗坏血酸及多种生长因子等, 通过相关信号通路信号转导在一定程度上参与牙髓细胞向成牙本质细胞分化定向诱导 但成牙本质细胞分化是一个复杂的过程, 进一步从细胞及分子水平研究成牙本质分化诱导因子及相关机制对于牙齿再生治疗临床应用具有重要意义 邹慧儒,Steven Brookes,Xuebin Yang. 牙髓细胞成牙本质分化的体外诱导 : 诱导因子及机制揭示 [J]. 中国组织工程研究,2014,18(37): Odontoblastic differentiation of dental pulp cells in vitro: odontogenic stimuli and the underlying mechanisms Zou Hui-ru 1, Steven Brookes 2, Yang Xue-bin 2 ( 1 Tianjin Stomatological Hospital, Nankai University, Tianjin , China; 2 Department of Oral Biology, Leeds Dental Institute, University of Leeds, Leeds LS2 9LU, UK) Abstract BACKGROUND: Studies have shown that dental pulp cells can differentiate into odontoblastic like cells under certain stimulations, which is regulated by several signal pathways network. OBJECTIVE: To summarize the research progress of stimulating molecules and underlying molecular mechanisms of dental pulp cells odontoblastic differentiation. METHODS: A computer-based online search of CNKI and Wanfang databases was undertaken for the related Chinese articles dated from January 1998 to July 2014 with the keywords of dental pulp cells and odontoblastic differentiation in Chinese. Meanwhile, PubMed database was searched for the related English articles dated from January 1998 to July 2014 with the same keywords in English. Those with unrelated research subjects, or repetitive studies were excluded. Finally, 63 articles were reviewed. RESULTS AND CONCLUSION: Various stimuli, including bone morphogenetic protein, β-glycerophosphate and ascorbic acid, can stimulate dental pulp cells differentiation into odontoblastic like cells under certain conditions Zou Hui-ru, M.D., Tianjin Stomatological Hospital, Nankai University, Tianjin , China Accepted: ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6051

2 regulated by several signal pathways network. But odontoblastic differentiation is a complex process, and further research into stimulating molecules and underlying molecular mechanisms of dental pulp cells odontoblastic differentiation is significantly important for clinical applications of dental regenerative therapy. Subject headings: dental pulp; odontoblasts; signal transduction Funding: the Science and Technology Fund of Tianjin Health Bureau, No. 2012KY19 Zou HR, Brookes S, Yang XB. Odontoblastic differentiation of dental pulp cells in vitro: odontogenic stimuli and the underlying mechanisms. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(37): 引言 Introduction 目前, 组织工程干细胞研究进展迅速, 牙髓干细胞作为组织工程重要的种子细胞之一, 由于其来源广泛 可塑性强 可自体应用无免疫排斥反应等优势, 临床应用前景广阔 牙髓干细胞在体内 外具有向成牙本质细胞方向分化, 形成牙髓 - 牙本质复合体能力, 还具有向脂肪样细胞 神经样细胞等多向分化能力 适宜的诱导因子 支架材料以及微环境等可以促进牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化, 形成牙髓 - 牙本质复合体样结构 文章就近年来牙髓细胞成牙本质分化的相关诱导因子及机制研究做一综述 1 资料和方法 Data and methods 1.1 资料来源应用计算机检索中国知网 (CNKI) 和万方数据库 1998 年 1 月至 2014 年 7 月相关文献, 检索词 牙髓细胞, 成牙本质细胞分化 限定文献语言种类为中文 同时计算机检索 PubMed 数据库 1998 年 1 月至 2014 年 7 月相关文献, 检索词 dental pulp cells, odontoblastic differentiation, 限定文献种类为英文 1.2 入选标准实验研究文章中采用随机 双盲 对照等设计 ; 观察对比研究 经验总结 个案报道等不同文献无限制条件 排除标准 : 研究目的与本综述目的无关 重复研究的文献 1.3 质量评估对于获取的文献, 由 2 名评价员分别仔细阅读所获文献文题 摘要和全文, 以确定是否符合入选标准 文献筛选和质量评价由 2 名研究者独立进行并交叉核对, 如有分歧, 则通过讨论集体解决 1.4 数据的提取经过计算机和手工检索, 获取初检文献, 经过质量评估后获取相关文献, 2 结果 Results 2.1 文献检索结果及质量评价初检所得文献 467 篇 包括中文 214 篇, 英文 253 篇 对于初检文献, 阅读标题和摘要进行初筛, 排除因研究目的与本研究无关者或内容重复性的研究, 最终纳入 63 篇文章进行综述 符合纳入标准的 63 篇文献中, 文献 [1-8] 探讨了转化生长因子 β 在牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的作用及可能机制的相关研究进展, 文献 [9-16] 探讨了骨形态发生蛋白 2 诱导牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的相关研 究进展, 文献 [17-24] 探讨了 β-catenin 与 Wnt/β-catenin 信号通路在成牙本质细胞分化中的可能作用, 文献 [25-26] 列举了矿化诱导液用于牙髓细胞矿化诱导方面的研究成果, 文献 [27-34] 归纳了无机三氧化聚合物 Biodentine Bioaggregate 以及 iroot 用于牙髓细胞分化诱导的研究报道, 文献 [35-44] 分析了釉基质蛋白及其组成成分与其他基质类物质对成牙本质分化的诱导作用, 文献 [45-63] 则就上述文中未提到的体外诱导牙髓细胞成牙本质分化的诱导因子及机制研究进行分析归纳 2.2 综述情况牙髓细胞在体内生理状况下, 处于牙髓组织特殊的微环境中, 能保持干细胞未分化状态, 具备分化形成多种细胞的特性和功能 在某些炎症刺激或其他病理情况下, 牙髓细胞可能向成牙本质细胞方向分化 众多研究表明, 体外培养条件下不同的诱导因子, 例如 : 转化生长因子 β 骨形态发生蛋白 β- 甘油磷酸钠 抗坏血酸及其他诱导因子等可以作为调控器, 通过相关信号通路信号转导在一定程度上参与成牙本质细胞分化定向诱导 转化生长因子 β 与 Smad 信号通路转化生长因子 β 是一类具有多种生物学活性的细胞因子, 对细胞增殖 迁移 分化和凋亡等都有重要的调节作用 作为牙胚上皮 - 间充质之间相互作用的一种信号分子, 转化生长因子 β 通过调节细胞核内转录因子 细胞黏附因子等活性水平参与调控细胞增殖 分化与牙齿发育 转化生长因子 β1 在成体牙髓中能诱导成牙本质前体细胞分化和牙本质基质分泌, 下调与牙本质矿化相关的细胞外基质蛋白的基因表达, 促进牙髓 - 牙本质复合体形成 [1] 转化生长因子 β1 转化生长因子 β3 单独或与其他细胞因子协同作用可调节牙髓或前体细胞的增殖 迁移和分化, 参与牙本质 - 牙髓复合体和修复性牙本质的形成 [2-4] [5] 聂鑫等将人第 3 磨牙牙髓组织剪碎, 与牙本质陶瓷粉及 2 mg/l 转化生长因子 β1 混合, 将该混合物以骨基质明胶为载体置于不锈钢金属网架上, 成功构建牙髓组织体外培养模型, 发现转化生长因子 β1 可明显促进牙髓细胞向成牙本质细胞的分化诱导潜能, 并形成骨 - 成牙本质样组织 众多研究表明转化生长因子 β 可以作为一种成熟的诱导因子用于牙髓细胞向成牙本质细胞方向定向分化 有关其作用机制, 目前公认的是转化生长因子 β 可 6052 P.O. Box 10002, Shenyang

3 以结合到细胞表面的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶受体从而激活其受体, 通过 Smad 信号通路或其它信号通路将信号转导至细胞内发挥作用 Smad 信号分子包括 9 个成员, 其中 Smad2 Smad3 是转化生长因子 β 在细胞内特异的信号转导分子 转化生长因子 β 与细胞表面受体结合, 使 Smad2 Smad3 磷酸化, 形成异源寡聚物, 核转位后识别 c-jun 等基因启动子的相关序列, 启动其表达, [6] 进而调控成牙本质相关基因表达 包柳郁等通过激光共聚焦显微镜观察转化生长因子 β1 刺激初期牙髓细胞内 Smad 2 3 由胞质向胞核转位的现象, 同时采用蛋白免疫印迹方法检测刺激后期 Smad 2 3 蛋白表达情况, 发现转化生长因子 β1 刺激初期 Smad 2 3 通过发生核转位参与转导转化生长因子 β1 信号至胞核内, 而刺激后期 Smad 3 表达水平的下调可能与转化生长因子 β1 负反馈调节有关 [7] 之后, 包柳郁等将转化生长因子 β3 作用于牙髓细胞, 与空白对照组相比, 牙髓细胞内 Smad 3 在转化生长因子 β3 刺激后 6,12 h, 其蛋白表达量无明显变化, 而在刺激后 24 h 表达量明显下降, 刺激 48 h 后表达十分微弱,Smad 2 在空白对照组以及刺激后各时间组蛋白表达量无显著变化 该研究表明转化生长因子 β3 对 Smad2 Smad 3 二者表达的调控方式有所不同 Lee [8] 等研究发现转化生长因子 β1 通过蛋白酶解通路诱导核转录因子 (Nuclear factor I-C,NFI-C) 的降解, 转化生长因子 β1 信号分子的激活通过降解 NFI-C 蛋白而非抑制 NFI-C 蛋白转录导致 NFI-C 蛋白水平降低 过表达 Smad2 或 Smad3 均可导致内源性 NFI-C 蛋白降解 Smad3 敲除后, 转化生长因子 β1 不再影响 NFI-C 蛋白的降解 该研究提出转化生长因子 β1 通过 Smad 信号通路增加 p21 和转化生长因子 β 应答基因的表达水平以及 NFI-C 蛋白的降解, 从而抑制 p21 表达, 诱导牙髓细胞发生成牙本质细胞分化 骨形态发生蛋白 2 与 Smad 丝裂原活化蛋白激酶信号通路骨形态发生蛋白 2 是一种多功能的生长因子, 属于转化生长因子 β 超家族, 在细胞生长 分化 凋亡和机体各种组织及器官发育过程中起重要调节作用 骨形态发生蛋白 2 可体外诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞分化 [9] 利用腺病毒载体诱导牙髓细胞产生骨形态发生蛋白 7, 发现可以明显增加牙髓细胞碱性磷酸酶活性, 诱导牙本质涎磷蛋白表达, 形成骨样牙本质 以骨形态发生蛋白 2 诱导牙髓细胞, 观察到相似的结果 将转染的细胞接种于三维支架材料上, 观察到明显的硬组织形成 [10-11] 骨形态发生蛋白相关信号通路研究近年来开展的 [12] 较多 Qin 等研究骨形态发生蛋白 /Smad 通路在成牙本质细胞分化中的可能作用, 发现骨形态发生蛋白 2 可诱导牙髓细胞 Smad 1/5 的磷酸化以及核转位 此外, 骨 形态发生蛋白 2 信号抑制剂 noggin 可显著抑制骨形态发生蛋白 2 诱导的牙髓细胞的碱性磷酸酶活性和成牙本质细胞分化, 降低矿化结节形成 结果提示 Smad 1/5 与骨形态发生蛋白 2 诱导成牙本质细胞分化有关 [12] 小异源二聚体与许多转录因子例如 Runx2 互相作用, 调控细胞增殖 分化 能量代谢等 研究显示小异源二聚体可能介导骨形态发生蛋白 2 信号通路, 促进牙本质基质矿化 [13] 丝裂原活化蛋白激酶是细胞内执行信号级联放大的一类蛋白质, 该家族可以在一系列刺激因素作用下参与信号转导, 调控细胞行为 作为该家族的四大亚家族之一,P38 亚族在许多调控行为中发挥重要作用 P38 丝裂原活化蛋白激酶途径可由多种诱导因子刺激细胞发生蛋白磷酸化级联反应而激活, 从而调节细胞增殖 分化 炎症反应甚至凋亡等 第一个发现的 P38 成员是 [14] p38α Qin 等通过构建重组反转录病毒 shrna 干扰 p38α 丝裂原活化蛋白激酶编码, 研究 p38α 丝裂原活化蛋白激酶在骨形态发生蛋白 2 诱导成牙本质细胞分化中的可能作用 结果显示骨形态发生蛋白 2 上调人牙髓细胞 p38α 磷酸化, 呈剂量和时间依赖性 与对照组相比, p38α 丝裂原活化蛋白激酶基因敲除组人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节形成显著抑制 此外, 抑制 p38α 丝裂原活化蛋白激酶可以抑制人牙髓细胞的成牙本质细胞分化 该研究提出 p38α 丝裂原活化蛋白激酶参与骨形态发生蛋白 2 诱导人牙髓细胞的成牙本质细胞分 [15] 化 付蕾等通过观察 p38 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 SB 对人牙髓细胞矿化相关基因表达和矿化能力的影响, 发现 p38 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 SB 具有抑制人牙髓细胞分化和矿化的作用, 同样证实了 p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路可能参与牙髓细胞向成牙本质细胞分化这一推论 信号通路之间的交互作用在细胞调控中经常发生 例如,P38 信号通路对 ERK1/2 通路具有抑制作用,P38 与 Jun 氨基末端激酶 (Jun N-terminal kinase,jnk) 的上游有很多相同的调节因子, 可以被某些刺激因子共同激活, 在下游两者也有重叠的地方, 例如都可以激活 AP-1 [16] 的转录活性 Qin 等研究发现骨形态发生蛋白 2 上调牙髓细胞中的 JNK 磷酸化, 呈剂量和时间依赖性 成牙本质细胞分化的早期标志物, 包括细胞碱性磷酸酶活性, 骨桥蛋白和牙本质基质蛋白 1 表达不受 JNK 抑制剂 SP 的抑制 但是,JNK 抑制剂对成牙本质细胞分化的晚期标记物, 包括骨钙素 牙本质涎磷蛋白和骨涎蛋白的基因表达有明显的抑制作用, 同时也降低了骨形态发生蛋白 2 诱导后的牙髓细胞矿化结节的形成 JNK 丝裂原活化蛋白激酶沉默减少了后期的成牙本质细胞分化 该结果表明 JNK 的活性是骨形态发生蛋白 2 诱导的成牙本质细胞分化晚期必需的 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6053

4 2.2.3 β-catenin 与 Wnt/β-catenin 信号通路 β-catenin 最早作为一种黏附因子被发现, 后来研究发现它还是一种多功能的蛋白质 β-catenin 广泛存在于各种类型的细胞, 如内皮细胞 成纤维细胞 成骨细胞 成牙本质细胞中, 在细胞黏附 增殖 分化和凋亡等方面发挥重要 [17] 调节作用 Kim 等研究表明 β-catenin 在成牙本质细胞中强表达, 在牙根形成中发挥重要作用 在发育中的成牙本质细胞中特异性失活 β-catenin 可导致形成的磨牙 [18] 缺少牙根, 切牙异常菲薄 Han 等观察到 β-catenin 在直接盖髓术后修复性牙本质形成过程中露髓部位下方的成牙本质细胞样细胞和牙髓细胞中均有表达 体外培养的牙髓细胞向成牙本质方向分化过程中 β-catenin 的表达也显著上调 Runx2 呈现与 β-catenin 相似的表达模式 免疫荧光染色结果表明, 修复性牙本质形成过程中 β-catenin 表达阳性的成牙本质细胞样细胞和牙髓细胞 Runx2 表达也呈现阳性 β-catenin 敲除可影响 β-catenin 与 Runx2 启动子的结合, 减少 Runx2 的表达, 打乱成牙本质细胞分化 相反, 氯化锂 (LiCl) 诱导 β-catenin 积累产生与 β-catenin 敲除相反的效果 β-catenin 可以通过激活 Runx2 增强成牙本质细胞分化, 由此推测这可能是修复性牙本质形成过程中成牙本质细胞分化的机制 β-catenin 在经典 Wnt 信号通路作用于牙齿发育和 [19] 干细胞自我更新中发挥至关重要的作用 Scheller 等 研究发现通过反转录病毒介导稳定转导典型 Wnt-1 或 β-catenin 活性形式的牙髓细胞细胞外骨桥蛋白表达显著升高,COL-1 表达轻微升高, 但是碱性磷酸酶活性及矿化结节形成显著降低 此外, 过表达 β-catenin 也足以抑制大鼠牙髓干细胞的分化和矿化 由此该研究认为经典 Wnt 信号通路对牙髓干细胞的成牙本质细胞分化呈负调控 [20] Chen 等研究发现在发育中的牙间充质细胞组织特异性失活 β-catenin 可导致细胞自主性丧失 Lef1 mrna 的表达, 但不影响骨形态发生蛋白 4 的表达 而在 β-catenin 介导的经典 Wnt 信号缺失情况下, 骨形态发生蛋白 4 不足以维持牙间充质细胞中 Lef1 的表达 上述数据表明, 在发育中的牙间充质细胞中 Lef1 mrna 的表达直接受到 Wnt /β-catenin 信号调节, 提示 Wnt/ β-catenin 信号在牙齿发育早期间充质细胞活化方面发挥重要作用 有研究通过检测牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的相关基因与 microrna 表达, 推测上述靶基因的不同表达情况与不同的生物学功能与丝裂原活化蛋白激酶和 Wnt 信号通路相关 [21-22] [23] Kim 等通过观察 MDPC-23 细胞向成牙本质细胞分化过程中 mir-663 表达显著增高, 对 mir-663 靶基因的预测显示, adenomatous polyposis coli (APC) 基因与 mir-663 有一个结合位点在其 3 - 非翻译区 (UTR), 该基因与 Wnt/ β-catenin 信号通路相关 APC 的表达被 mir-663 显著抑制, 而 APC 表达下调通过 β-catenin 在细胞核内聚集激活 Wnt /β-catenin 信号通路 该研究认为,miR-663 通过靶向介导 APC 激活 Wnt /β-catenin 信号通路, 从而促进 MDPC-23 细胞分化为成牙本质细胞 在牙髓组织修复过程中, 人牙髓细胞迁移到损伤部位, 分化为成牙本质样细胞 在牙齿发育过程中,Wnt6 可以激活非经典信号途径例如 c-jun 氨基末端激酶 [24] (c-jun N-terminal kinase,jnk) 通路 Li 等研究发现 Wnt6 可以激活人牙髓细胞的 JNK 通路, 促进细胞迁移 矿化结节的形成和碱性磷酸酶活性 Wnt6 也增加 Runx2 牙本质涎磷蛋白 牙本质基质蛋白 mrna 的表达 阻断牙髓细胞的 JNK 通路可以导致 Wnt6 诱导产生的细胞迁移和分化能力降低, 但不能完全消除该作用 该研究结果提示 Wnt6 可以激活人牙髓细胞 JNK 信号通路从而导致细胞迁移和分化 矿化诱导液大量研究表明, 矿化诱导液可以诱导牙髓细胞发生成牙本质细胞分化 目前用于牙髓干细胞矿化诱导的矿化液种类较多, 最常用的是含一定比例的地塞米松 抗坏血酸及 β- 甘油磷酸钠的培养液 其中地塞米松对成骨及成牙本质分化均有明显促进作用, 抗坏血酸则广泛参与细胞增殖 分化等多项活动,β- 甘油磷酸钠则可以为矿化提供必须的磷酸根离子 有研究采用含一定浓度的 β- 甘油磷酸钠 抗坏血酸和地塞米松的矿化液诱导人牙髓干细胞, 通过倒置相差显微镜 透射电镜 免疫细胞化学染色 vonkossa 染色方法, 观察和检测矿化液诱导后细胞形态 超微结构 表型和矿化基质分泌的变化, 以未诱导组为对照 经矿化液连续培养 7 d, 人牙髓干细胞细胞形态明显改变, 呈成牙本质样细胞极化表现 ; 超微结构观察显示诱导后的细胞体积增大, 核浆比例下降, 胞浆细胞器丰富 ; 诱导前细胞不表达牙本质涎磷蛋白和骨钙素, 诱导后均表达 ; 连续培养 21 d, 诱导组细胞形成多个矿化结节 该研究结果提示矿化液能诱导人牙髓干细胞向成牙本质细胞样细胞分化并产生矿化基质 [25] 近来有研究将 KH 2 PO 4 作为矿化液的常规添加成分, 更加经济方便有效提供矿化所需的磷酸根离子, 与矿化诱导液的其他成分共同作用发挥矿化诱导作用 [26] 但矿化液中各组成成分矿化诱导具体作用机制仍有待进一步阐明 无机三氧化聚合物 Biodentine Bioaggregate 以及 iroot 无机三氧化聚合物可诱导牙髓细胞分化为成牙本质细胞, 形成牙本质样矿化结构 [27-28] [29] Woo 等 研究发现 1 g/l 的无机三氧化聚合物可以显著上调牙本质涎磷蛋白 牙本质基质蛋白 1 表达水平, 促进矿化结节形成 硝苯地平可以抑制无机三氧化聚合物诱导的牙髓细胞成牙本质分化作用 细胞外信号调控激酶 (Extracellular signal-regulated kinase, ERK) p38 和 6054 P.O. Box 10002, Shenyang

5 JNK 抑制剂 U0126,SB 和 SP 可以阻断无机三氧化聚合物的诱导效果 该研究显示无机三氧化聚合物中的钙离子释放在牙髓细胞成牙本质细胞分化中发挥重要作用, 该过程通过 ERK 和 JNK 活化调控 [30] Jung 等对 Biodentine Bioaggregate 以及无机三氧化聚合物作用于人牙髓细胞的矿化诱导能力进行了比较并探讨其可能的信号转导通路, 发现三者在细胞活性方面非常相似, 与空白对照组相比都能上调牙本质涎磷蛋白 牙本质基质蛋白 1 mrna 的表达, 促进矿化结节形成,ERK p38 和 JNK 磷酸化 丝裂原活化蛋白激酶抑制剂可以抑制三者诱导牙髓细胞形成矿化结节的能力 上述 3 种材料都通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路诱导成牙本质分化和矿化结节形成, 表明 Biodentine 和 Bioaggregate 作为新型材料, 可以用于牙髓再生治疗, 与以往研究结果相符 [31-32] [33] Luo 等研究发现 Biodentine 通过丝裂原活化蛋白激酶和钙 / 钙调蛋白依 [34] 赖的蛋白激酶 II 途径促进牙髓细胞分化 Zhang 等将牙髓细胞分别接种于 BioAggregate iroot BP Plus 和无机三氧化聚合物, 比较了细胞增殖以及分化诱导情况, 发现上述材料均没有细胞毒性, 可以诱导成牙本质分化及矿化形成 釉基质蛋白 釉原蛋白以及牙本质基质蛋白釉基质蛋白可以促进牙髓细胞增殖, 提高牙髓细胞碱性磷酸酶活性及钙盐沉积, 上调碱性磷酸酶 骨桥蛋白 牙本质涎磷蛋白 骨涎蛋白以及骨形态发生蛋白表达水平 此外, 还上调成牙本质相关转录因子 Osterix 和 Runx2 表达水平 [35-37] 也有研究联合釉基质蛋白与无机三氧化聚合物或辛伐他汀作用于牙髓细胞, 均观察到良好的成牙本质分化诱导效果 [38-39] 作为釉基质蛋白的主要成分, 釉原蛋白诱导牙髓细胞向成牙本质细胞方向分 [40] 化的研究也多有报道 张艺文等取 6 月龄猪第 2 磨牙牙胚牙釉质, 用液相色谱法分离纯化低分子猪釉原蛋白 (LMWPA), 并观察其对人牙髓细胞和牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响 结果发现 LMWPA 在 50 和 100 mg/l 时能显著促进牙髓细胞和牙周膜细胞的增殖, 且碱性磷酸酶活性上调 (P < 0.01); 而在 150 mg/l 时则显著抑制细胞的增殖, 碱性磷酸酶活性下调 (P < 0.01) 该研究表明 LMWPA 影响 HDPCs 和 HPLCs 的增殖和碱性磷酸酶活性 也有研究观察釉原蛋白的不同裂解产物对成牙本质分化的不同作用, 发现含外显子 8 和 9 片段的富含亮氨酸的釉原蛋白多肽与不含外显子 8 和 9 片段的多肽相比, 可以显著促进牙髓细胞增殖分化, 促进修复性牙本质形成 提示釉原蛋白外显子 8 和 9 在牙髓再生修复中可能发挥重要作用 [41] 此外, 牙本质基质蛋白牙本质基质蛋白 1 在牙胚发育过程中具有诱导成牙本质细胞分化, 促进细胞分泌基质, 启动牙本质矿化等作用, 还可以作为细胞间信号分 子发挥作用 [42] 牙本质基质物质以及细胞基质物质在牙髓损伤修复 牙本质再生方面也显示出广泛的应用前景 [43-44] 但其作用受多种细胞因子 酶等因素综合调控, 具体作用机制仍待进一步研究证实 其他方面有研究报道人牙髓细胞成牙本质分化过程中胸腺素 β4 mrna 和蛋白表达上调 胸腺素 β4 sirna 转染可通过降低碱性磷酸酶活性 分化标志物 mrna 表达和钙结节形成降低成牙本质诱导液诱导成牙本质细胞分化效果 而胸腺素 β4 激活可以通过增强 p38 JNK ERK 丝裂原活化蛋白激酶, 骨形态发生蛋白 2, 骨形态发生蛋白 4 Smad1/5/8 和 Smad2/3 的磷酸化以及转录因子 Runx2 和 Osterix 的表达促进成牙本质细胞分化 该研究表明, 胸腺素 β4 在人牙髓细胞成牙本质细胞分化中发挥重要作用, 胸腺素 β4 活化可能在牙髓再生中具有关键作用 [45] [46] 血红素加氧酶 1 活性与干细胞分化相关 Kim 等 研究发现钴原卟啉作用后的牙髓细胞生成血红素加氧酶 1, 促进细胞生长和矿化形成, 增加成牙本质细胞相关标记物碱性磷酸酶 骨桥蛋白 骨涎蛋白 牙本质基质蛋白 1 和牙本质涎磷蛋白 mrna 的表达, 血红素加氧酶 1 抑制剂可抑制牙髓细胞生长和分化 该研究推测药物性介入血红素加氧酶 1 有望做为牙髓盖髓及牙髓再生的一种有效的治疗方法 有研究表明机械应力可显著增加人牙髓细胞血红素加氧酶 1, 骨涎蛋白, 骨桥蛋白, 牙本质涎磷蛋白以及牙本质基质蛋白 1 mrnas 的表达 血红素加氧酶 1 基因沉默以及应用血红素加氧酶 1 ERK p38 丝裂原活化蛋白激酶, 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (Phosphoinositide 3-kinase) 或核转录因子 κb 抑制剂均可以抑制机械应力诱导的牙髓细胞分化 机械应力诱导的相关因子 (NE-E2-related factor-2,nrf2) 核转位可以被 PI3K 和核转录因子 κb 抑制剂抑制 上述研究结果表明机械应力诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化可能通过机械应力诱导的相关因子介导血红素加氧酶 1 通路进行调控 [47] [48] Lee 等研究茯苓酸是否影响牙髓炎症并通过血红素加氧酶 1 基因表达促进牙齿发育 研究发现过氧化氢可以导致牙髓炎症, 并扰乱成牙本质细胞分化 但是, 茯苓酸作用后可通过增加血红素加氧酶 1 表达发挥抗炎作用和成牙本质细胞诱导分化作用 此外, 茯苓酸对过氧化氢处理的牙髓细胞有较强的保护作用和矿化作用 茯苓酸显著抑制核转录因子 κb 进入细胞核并诱导 Nrf2 进入细胞核 核转录因子 κb 和 Nrf2 易位由血红素加氧酶 1 通路调节 茯苓酸通过血红素加氧酶 1 通路发挥抗炎作用和成牙本质细胞分化诱导作用 结果表明, 茯苓酸可以应用于口腔炎症的预防或改善应力作用下的牙本质矿化 谷氨酰胺可以促进不同类型细胞的有丝分裂, 有研 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 6055

6 究表明谷氨酰胺可以促进牙髓细胞的增殖 迁移 碱性磷酸酶活性 矿化结节形成以及成牙本质细胞标志物 mrna 的表达, 上述作用呈剂量依赖性 谷氨酰胺还可以上调白细胞介素 6 白细胞介素 8 MCP-1 MIP- 3α CCL2 CCL20 和 CXCL1 的表达 谷氨酰胺增加骨形态发生蛋白 2 和骨形态发生蛋白 4 基因的表达以及 Smad 1/5/8 磷酸化, 增加 β-catenin 和 Wnt 信号通路的关键蛋白的表达 此外, 谷氨酰胺还可以上调 p38 和 JNK 的表达 此外,noggin DKK1 以及 p38,jnk,erk 的抑制剂均能显著抑制谷氨酰胺的诱导作用 该研究表明谷氨酰胺可能通过骨形态发生蛋白 2 Wnt 以及丝裂原活化蛋白激酶信号通路调控作用促进牙髓细胞增殖 迁移及成牙本质分化 [49] ATF6 是一种内质网膜结合转录因子, 可以调控多种细胞功能 在磨牙牙胚成牙本质细胞层观察到 ATF6 表达, 并且 ATF6 牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白 1 表达量随着牙胚的发育逐渐增加 诱导液体外培养的牙髓细胞,ATF6 牙本质涎磷蛋白以及牙本质基质蛋白 1 表达随着未折叠蛋白反应标记物增加而增加 ATF6 过表达促进体外培养的牙髓细胞牙本质涎磷蛋白 牙本质基质蛋白 1 表达以及碱性磷酸酶活性和矿化形成 ATF6 抑制可以降低碱性磷酸酶活性和矿化形成 上述结果提示 ATF6 可能参与成牙本质细胞分化 [50] 最近, 有研究表明 PIN1, 一种肽基脯氨酰顺反异构酶, 也参与人牙髓干细胞的成牙本质分化以及成脂分化 [51] 作为一种凋亡转录因子,DDIT3 不仅在炎症反应以及成骨分化中具有至关重要的作用, 还同样参与成牙本质分化 [52] 除此以外, 还有报道 SIRT6 在牙髓组织和牙髓细胞内表达,SIRT6 参与牙髓细胞成牙本质分化与矿化 [53] 还有研究发现高迁移率族蛋白 1 在人牙髓组织和牙髓细胞的胞核内表达, 在成牙本质分化过程中, 高迁移率族蛋白 1 从胞核内转移到胞浆, 之后分泌出细胞体外 外源性高迁移率族蛋白 1 可以促进牙髓细胞增殖和矿化结节的形成, 上调成牙本质相关蛋白表达水平 [54] Krüppel-like factor 4(KLF4) 在细胞分化和增殖方面具有非常重要的作用 有研究显示 KLF4 特定表达于极化伸长的成牙本质细胞, 能够抑制牙髓细胞增殖, 促进成牙本质分化 [55] 细胞外基质磷酸化糖蛋白又名成骨细胞 / 骨细胞因子 -45(Osteoblast/osteocyte factor 45,OF-45), 细胞外基质磷酸化糖蛋白属于小整合素结合配体 N 连接的糖蛋白 (Small integrin-binding ligand with N-linked glycoprotein, SIBLING) 的远端家族, 与骨骼和牙齿的形成和发育关系密切 在牙齿组织中, 细胞外基质磷酸化糖蛋白主要表达于成牙本质细胞, 并与釉质发育不全 Ⅱ 和 Ⅲ 型牙本质发育不全有关 细胞外基质磷酸化糖蛋 白基因水平随着牙髓细胞的诱导分化表达上调, 与牙本质涎磷蛋白 骨涎蛋白 COL-1mRNA 表达具有相似的变化趋势, 通过外源性细胞外基质磷酸化糖蛋白刺激牙髓细胞及基因转染模型, 发现细胞外基质磷酸化糖蛋白可能通过某些信号转导途径正向调节牙髓细胞的增殖分化和牙髓 - 牙本质复合体的修复再生 细胞外基质磷酸化糖蛋白在细胞增殖和早期基质成熟阶段大量表达, 在矿化阶段表达则受到抑制, 由此推测细胞外基质磷酸化糖蛋白可能是牙髓细胞向成牙本质细胞分化的早期标记物之一 [56-58] [59] 王文静等通过研究细胞外基质磷酸化糖蛋白基因沉默对牙髓细胞增殖和成牙本质分化能力的影响, 发现细胞外基质磷酸化糖蛋白可能通过与细胞外基质胶原蛋白以及非胶原蛋白相互作用, 共同调节牙髓损伤修复, 但其具体作用机制仍需深入研究 除了上述文中提到的信号通路,Notch 信号通路在牙齿发育与细胞分化方面同样发挥重要作用 Zhang [60] 等研究发现过表达 Notch 配体 Jagged-1 可以激活牙髓细胞的 Notch 信号通路 体外实验证实 Jagged-1 抑制牙髓细胞成牙本质细胞分化 动物实验证实表达 Jagged-1 的牙髓细胞不能在体内形成矿化组织 此外, 组成性激活 Notch1 胞内结构域 (Notch-ICD) 的过表达也抑制牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化 该研究结果表明 Notch 信号途径可以抑制牙髓细胞成牙本质细胞分化 作为细胞间相互作用的一种主要通路, Notch-Delta 信号途径是调控细胞增殖和分化最重要的保守性信号途径之一, 参与调控多种干细胞分化方向 何飞等体外实验发现,Notch 配体 Delta-1 基因转染的牙髓细胞增殖活性显著提高, 向成牙本质细胞分化的时间明显提前 [61-62] Notch-Delta 途径与骨形态发生蛋白信号之间存在着直接的相互作用, 它们或协同或拮 [63] 抗, 共同控制了多种干细胞的增殖和分化 Wang 等 通过慢病毒介导的 Delta1-RNA 干扰进行牙髓细胞的 Notch 配体 Delta1 基因敲除, 观察到牙髓细胞生长速率显著抑制, 向成牙本质细胞分化的能力显著增强 该研究表明 Notch 信号途径在牙髓细胞自我更新和分化的调控方面发挥关键作用 提示 Delta1-RNA 干扰的牙髓细胞有望作为种子细胞用于牙齿组织工程与干细胞治疗 3 结论 Conclusion 牙髓细胞在一定诱导因子的作用下, 通过某些信号转导通路调控向成牙本质细胞方向定向分化 但成牙本质细胞分化是一个复杂的过程, 进一步从细胞及分子水平研究成牙本质分化诱导因子及相关机制对于牙齿再生治疗临床应用具有重要意义 相信未来随着研究的进一步深入, 会有更多重大发现将被报道 6056 P.O. Box 10002, Shenyang

7 作者贡献 : 第一作者构思并设计本综述, 与第二 第三作者一起分析并解析数据, 经数次修改与审校, 共同起草完成, 第一作者对本文负责 利益冲突 : 文章及内容不涉及相关利益冲突 伦理要求 : 没有与相关伦理道德冲突的内容 学术术语 : 骨涎蛋白 - 是由成骨细胞, 破骨细胞和成齿细胞合成的磷酸化糖蛋白 此种蛋白含有 RDG 序列, 可由破骨细胞的 αvβ3vitroneilin 受体 (CD51/CD61) 等亲合素受体所识别, 说明它在骨吸收中使活化的破骨细胞接触到骨的表面, 它也参与成骨细胞与骨的接触 作者声明 : 文章为原创作品, 无抄袭剽窃, 无泄密及署名和专利争议, 内容及数据真实, 文责自负 4 参考文献 References [1] Li Y, Lü X, Sun X, et al. Odontoblast-like cell differentiation and dentin formation induced with TGF-β1. Arch Oral Biol. 2011;56(11): [2] 余姗姗, 翁雨来, 蒋欣泉.AFGF 和 TGFβ1 联合诱导猪牙乳头细胞向成牙本质样细胞分化 [J]. 口腔医学,2008,28(6): ,294. [3] 周慧, 林锦梅, 任飞, 等. 转化生长因子 β3 诱导人乳牙牙髓干细胞向成牙本质样细胞的分化 [J]. 中国组织工程研究,2014,18(23): [4] He H, Yu J, Liu Y, et al. 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