970 研究论文 Msx2 Lef1 和 Egr1 等转录因子并发生形态变化 [15] 在这篇文章中, 我们利用慢病毒载体在牙髓干细胞中分别过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 三个基因, 考察其对牙髓干细胞牙向分化的诱导作用 1 材料与方法 1.1 材料三质粒慢病毒系统 pnl-ires

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绣谒糜
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(9): 研究论文过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 对牙髓干细胞牙向分化的影响 1,2# 黄义德 * 1# 王放放 1,2 胡雪峰 ( 1 福建师范大学生命科学学院, 福州 ; 2 福建师范大学生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 福州 ) 摘要在组织工程研究领域中, 利用干细胞进行牙齿再生是一种途径目前, 研究认为牙齿的发育过程是上皮与间充质相互诱导的结果, 利用干细胞进行再生牙齿时也需要有上皮源性和间充质源性干细胞的参与牙髓干细胞是牙齿自体的干细胞, 具有多向分化潜能, 在牙齿再生中是一种理想的间充质源性干细胞该研究通过慢病毒介导在牙髓干细胞中分别过表达人 Msx1 Pax9 和 Bmp4 基因, 研究其对牙向分化的诱导潜能过表达这三个基因均能显著提高牙髓干细胞碱性磷酸酶的水平, 并且促使牙髓干细胞表达成牙本质细胞标志蛋白牙本质涎磷蛋白骨钙素骨桥素和形成钙化组织但在诱导牙向分化的能力上, 三个基因有一定的区别过表达 Msx1 基因对牙髓干细胞体外诱导牙向分化能力最为明显, 其次是 Bmp4 基因, 过表达 Pax9 在促进牙髓干细胞表达骨桥素和钙质形成上不是很显著关键词牙髓干细胞 ; Msx1; Pax9; Bmp4; 牙向分化利用干细胞进行再生牙齿的研究需要间充质源性和上皮源性干细胞的参与 [1] 目前, 用于牙齿再生研究的间充质源性成体干细胞主要有骨髓干细 [2-5] [6] 胞脂肪干细胞和牙髓干细胞等 Gronthos 等在 2000 年从成年人的牙髓中分离出的牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) 具有很强的分裂和克隆形成能力, 而且实验结果证实牙髓干细胞具有多向分化潜能将牙髓干细胞种植到羟磷灰石 / 三钙磷酸盐 (HA/TCP) 支架上能够在体内形成牙齿样结构 [7] 因此, 牙髓干细胞具有作为代替牙胚间充质进行牙齿再生的潜能在利用干细胞进行牙齿再生的研究中, 目前采用的一种技术手段和趋势是 : 根据牙齿器官发育过程有关基因调控的机制, 利用分子生物学和组织工程技术, 在体外诱导干细胞的牙齿发育能力, 进而诱导牙齿的再生, 形成能移植到体内的牙胚或再生牙齿 [8-9] Msx1 Pax9 和 Bmp4 是牙齿发育过程中起重要作用的三个基因小鼠模型的研究表明, 在牙齿发育的起始蕾状期和帽状期期间 Pax9 在牙间充质中有强烈表达, Pax9 缺失会导致小鼠牙齿发育停滞在蕾状期 [10] 人类 Pax9 基因突变导致牙齿的缺失 [11] 在牙齿的发育过程中同源异型框基因 Msx1 是一种重要的转录因子, 与 Pax9 基因相似, 在牙齿发育的早期阶段, Msx1 在牙间充质中有强烈表达 Msx1 的缺失会导致磨牙牙胚的发育停滞于蕾状期 [12], 人类 Msx1 基因的突变也会导致先天缺牙 [13] Bmp4 是一种重要的生长因子, 参与了许多器官的发育过程 Bmp4 基因敲除小鼠的胚胎在牙齿发生之前就已死亡 [14] 在牙齿发育的过程中, Bmp4 最早在牙上皮中表达 (E11), 随后 Bmp4 的表达转移到牙间充质 (E12) Bmp4 表达的转化与牙齿诱导潜能的转变相一致, 表明 Bmp4 是牙齿发育过程中重要的内源性信号分子之一在体外培养的实验中, BMP4 可以部分的替代牙上皮的诱导成牙潜能, 诱导牙间充质表达 Msx1 收稿日期 : 接受日期 : 福建省自然科学基金 (No.2008J04012) 资助项目 # 共同第一作者 * 通讯作者 Tel: , ydhuang@fjnu.edu.cn

2 970 研究论文 Msx2 Lef1 和 Egr1 等转录因子并发生形态变化 [15] 在这篇文章中, 我们利用慢病毒载体在牙髓干细胞中分别过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 三个基因, 考察其对牙髓干细胞牙向分化的诱导作用 1 材料与方法 1.1 材料三质粒慢病毒系统 pnl-ires2-egfp pvsvg 和 phelper 为美国 Tulane 大学陈一平博士惠赠含人 Mxs1 和人 Pax9 cdna 序列的载体 pbot7-hmxs1 和 pbot7-hpax9 购自 Open Biosystems 含人 Bmp4 全长 cdna 序列的载体 pbluescript II KS-hBmp4 为本实验室保存成人第三磨牙由福建协和医院提供 α-mem 培养基 D-MEM 高糖培养基 Collagenase type I Dispase 购自 GIBCO 公司 ; 胎牛血清 L- 谷氨酰胺购自 Hyclone 公司 ; NaCl KCl Na 2 HPO 4 和 KH 2 PO 4 购自 SIGMA 公司 ; 青霉素链霉素购自 AMRESCO 公司 ; 兔抗人骨钙素 (osteocalcin) IgG 单克隆抗体鼠抗人牙本质涎蛋白 (dentin sialoprotein DSP) IgG 单克隆抗体购自 Santa Cruz 公司 ; 羊抗人骨桥素 (osteopontin) IgG 单克隆抗体购自 R&D 公司 ; HRP 偶合二抗和免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥公司 1.2 方法带 GFP 报告基因的慢病毒过表达载体 pnl- Bmp4-IRES2-EGFP pnl-msx1-ires2-egfp 和 pnl- Pax9-IRES2-EGFP 的构建含人 Bmp4 cdna 序列的质粒 pbluescript II KS-hBmp4 用 Sal I 和 Sac II 进行双酶切, 割胶回收目的条带同时, 慢病毒载体 pnl-ires2- EGFP 也用 Sal I 和 Sac II 进行双酶切并割胶纯化将 Sal I 和 Sac II 双酶切后的慢病毒载体 pnl-ires2-egfp 与 Bmp4 片段相连构建成过表达载体 pnl-bmp4-ires2- EGFP 用 EcoR I 和 Xho I 对质粒 pbot7-hmxs1 和 pbot7- hpax9 进行双酶切, 并纯化回收目的片段慢病毒载体 pnl-ires2-egfp 用 EcoR I 和 Sal I 进行双酶切因为 Sal I 与 Xho I 是同尾酶, 酶切后的目的片段和载体仍可以进行定向克隆用 T4 DNA 连接酶连接慢病毒载体和 Msx1 Pax9 目的片段, 构建成过表达载体 pnl-msx1-ires2-egfp 和 pnl-pax9-ires2-egfp 过表达载体中 EGFP 作为报告蛋白检测目的基因的表达慢病毒的生产用 QIAGEN 试剂盒 (QIAGEN Plasmid Midi Kit) 提取 pnl-bmp4-ires2-egfp pnl- Msx1-IRES2-EGFP pnl-pax9-ires2-egfp pnl- IRES2-EGFP pvsvg 和 phelper 质粒, 定量后 20 ºC 冻存备用 293T 细胞复苏后以个细胞数接种于 10 cm 的塑料细胞培养皿, 置于 37 ºC, 5% CO 2 条件下培养次日, 当细胞长到 70%~80% 丰度时, 向细胞培养皿中加入 10 µl 的 25 mmol/l 氯喹, 37 ºC 静置 45~60 min 分别吸取 14.0 µg pnl-ires2-egfp pnl-bmp4-ires2- EGFP pnl-msx1-ires2-egfp 和 pnl-pax9-ires2- EGFP 分别加入到 1.5 ml 离心管中, 同时向每个离心管加入 8.2 µg phelper 和 5.7 µg pvsvg 质粒向每个离心管中加入 40 µl 2.5 mol/l CaCl 2, 用 ph7.0 的 TE 补加到 625 µl, 并混匀将上述含 CaCl 2 的质粒混合液逐滴加入 625 µl 的 HEPES 缓冲液 (ph7.0) 中, 混匀, 室温静置 30 min 将静置后的质粒混合液逐滴加入细胞培养皿中细胞在 37 ºC, 5% CO 2 条件下培养 10~12 h 后弃去培养皿中的转染液, 并加入含 10% 胎牛血清的 α-mem 培养液每 12 h 后收集含病毒颗粒的培养液, 并加入新鲜的培养液含病毒颗粒的培养液 4 ºC 暂存, 在收集三次后进行病毒浓缩采用超速离心方法浓缩病毒三次收集后的含病毒颗粒的培养液于 4 ºC, r/min 离心 10 min 以去除细胞碎片将含病毒颗粒的上清转移到超速离心管, 4 ºC, r/min 超速离心 2.5 h 以沉淀病毒浓缩后的病毒颗粒分装成 20 µl/ 管液氮速冻后置于 80 ºC 保存牙髓干细胞最佳感染复数的确定牙髓 [6] 干细胞按 Gronthos 等建立的方法进行分离将 (2~4) 10 5 个牙髓干细胞接种到 3.5 cm 细胞培养皿中, 细胞培养基成分为含 10% 胎牛血清的 α-mem( 含 2 mmol/l 谷氨酰胺, 100 U/mL 青霉素, 100 μg/ml 链霉素 ) 以不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI) 值向牙髓干细胞中加入不同量的浓缩病毒液, 然后置于 37 ºC, 5% CO 2 条件下培养过夜受病毒转染过夜的牙髓干细胞进行换液, 并置于 37 ºC, 5% CO 2 条件下继续培养 48 h 倒置荧光显微镜下观察表达 EGFP 蛋白的牙髓干细胞, 确定最佳 MOI 值牙髓干细胞培养与慢病毒转染本文按不同实验采用两种方法培养和转染牙髓干细胞 : (1) 贴壁单层培养将 (2~4) 10 6 个牙髓干细胞接种于 10 cm 塑料细胞培养皿中, 加入 10 ml 含 10% 胎牛血清 αmem

3 黄义德等 : 过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 对牙髓干细胞牙向分化的影响 971 细胞培养液, 置于 37 ºC, 5% CO 2 条件下培养待细胞丰度达到 50% 时弃去旧的培养液, 加入新鲜的培养液, 以最佳感染复数计算所要加入的病毒量转染牙髓干细胞每隔三天给细胞换一次液, 细胞连续培养 7 d 后, Trypsin-EDTA 消化液消化细胞消化后的细胞用于碱性磷酸酶和牙本质涎磷蛋白 (dentin sialophosphoprotein, DSPP) 基因转录情况检测 ; (2) 三维球状细胞培养慢病毒转染后的牙髓干细胞按文献 [16] 采用三维球状细胞培养法进行体外培养约个牙髓干细胞放置 1.5 ml 离心管中, 按照最佳感染复数加入所需病毒液, 补加 αmem 细胞培养液至 200 µl, 细胞在 37 ºC, 5% CO 2 培养箱转染 3 h 转染结束后, r/min 离心 5 min, 弃掉上清向细胞团块加入新鲜的培养液, 37 ºC, 5% CO 2 培养箱 10 d, 每隔一天更换一次培养液碱性磷酸酶活性测定将原代培养的牙髓干细胞用 Trypsin-EDTA 消化液消化后接种于 96 孔培养板, 每孔接种 100 µl, 细胞数约为个 37 ºC, 5% CO 2 培养过夜后, 每孔按最佳感染复数计算所要加入的病毒量加入病毒, 转染牙髓干细胞转染 24 h 后, 弃去培养液终止感染, 加入新鲜的含 10% 胎牛血清 αmem 细胞培养液每隔 1 d 换一次培养液, 持续培养 7 d 7 d 后, 将 96 孔板取出, 用 PBS 缓冲液冲洗细胞 3 次每孔加入细胞裂解液 (1% NP40, 50 mmol/l Tris-HCl, 150 mmol/l NaCl) 100 µl, 充分吹打, 至细胞完全裂解加入碱性磷酸酶底物 pnpp 反应混合液, 37 ºC 孵化 60 min, 1 mol/l NaOH 终止反应酶标仪 490 nm 测吸光值 RT-PCR 检测 DSPP 基因表达转染携带有人 Msx1 Pax9 Bmp4 基因和空载慢病毒载体的牙髓干细胞在培养皿中连续培养 7 d 后, 细胞用 Trypsin- EDTA 消化液消化利用 Trizon 法提取总 RNA, 并合成模板 cdna 利用 DSPP 特异性引物 ( 上游 : 5 -TGG GCA GAA GTA GGA GGG AAG AGT-3 ; 下游 : 5 - ACG CGT TTG CTT TCT CTA TGG TTG A-3 ) 扩增 DSPP 片段扩增条件为 : 95 ºC 10 min; 94 ºC 2 min; 54 ºC 20 s; 72 ºC 20 s; 72 ºC 10 min, 反应 35 个循环同时以 β-actin 作为内参, 扩增 β-actin 的上游引物为 : 5 -TGC TGT CCC TGT ATG CCT CT-3, 下游引物为 : 5 -TTT GAT GTC ACG CAC GAT TT 免疫组化慢病毒转染后的牙髓干细胞经三维球状培养法培养 10 d 后, 样品进行免疫组化检测牙本质标记蛋白骨钙素牙本质涎蛋白和骨桥素的表达情况所用一抗的稀释度为 : 骨钙素 1:100; 牙本质涎蛋白 1:100; 骨桥素 1: 茜素红染色检测钙化情况三维球状培养法培养后的牙髓干细胞石蜡切片经梯度脱蜡复水后, 浸入 1% 茜素红溶液 30 min 0.2% 醋酸溶液冲洗一次, 滤纸吸干梯度酒精系列脱水, 二甲苯固定, 封片, 显微观察 2 结果 2.1 Msx1 Pax9 和 Bmp4 慢病毒过表达载体的构建将 Pax9 和 Msx1 cdna 序列从质粒 pbot7-hpax9 和 pbot7-hmxs1 (Open Biosystems) 中亚克隆到慢病毒载体 pnl-ires2-egfp 多克隆位点 EcoR I 和 Sal I 之间, 构建成过表达载体 pnl-pax9-ires2-egfp 和 pnl-msx1-ires2-egfp 将人 Bmp4 cdna 序列从质粒 pbluescript II KS-Bmp4 中亚克隆到慢病毒载体 pnl-ires2-egfp 多克隆位点 Sal I 和 Sac II 上, 构建成过表达载体 pnl-bmp4-ires2-egfp 构建好的过表达载体测序证实表达序列和表达框均正确 2.2 慢病毒载体能有效转染牙髓干细胞为了确定实验所用慢病毒能有效转染牙髓干细胞, 我们用空载慢病毒载体 pnl-ires2-egfp 来感染 P1 代的牙髓干细胞, 结果表明慢病毒载体 pnl- IRES2-EGFP 能有效的转染牙髓干细胞 ( 图 1) 2.3 最佳感染复数的确定慢病毒转染靶细胞时有一个最佳病毒数与靶细胞数的比值, 也就是感染复数 (MOI) 我们用不同感染复数对牙髓干细胞进行转染, 观察报告基因 EGFP 的表达情况, 结果显示感染复数为 50 时, 慢病毒能最有效地转染牙髓干细胞 ( 图 2) 因此, 在过表达实验中均以感染复数为 50 的病毒量对牙髓干细胞进行转染 2.4 过表达人 Msx1 Pax9 和 Bmp4 增强牙髓干细胞碱性磷酸酶的表达过表达人 Msx1 Pax9 和 Bmp4 慢病毒和空载病毒载体分别转染 96 孔板中培养的牙髓干细胞 24 h 后终止转染, 继续培养一周后裂解细胞, 检测碱性磷酸酶含量结果显示, 与没有携带外源基因的空载病毒相比, 过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 均能显著提高牙髓干细胞碱性磷酸酶的表达, 其中过表达 Msx1 基因的牙髓干细胞碱性磷酸酶活性增加最为显著 ( 图 3)

研究论文 972 A: 牙髓干细胞明场图片; B: 牙髓干细胞荧光图片, 显示EGFP报告蛋白在牙髓干细胞中的表达 A: bright field micrograph showing morphology of dental pulp stem cells; B: fluorescence micrograph showing expression of reporter gene EGFP

2 Effect of different MOI on dental pulp stem cells A: 过表达Msx1; B: 过表达Bmp4; C: 过表达Pax9; D: 转染空载慢病毒 pnl-ires2-egfp; E: 该组切片的HE染色; F: RT-PCR检测结果 A: Msx1 overexpressing cells; B: Bmp4 overexpressing

5 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4牙髓干细胞增强牙本质特异性蛋白牙本质涎蛋白骨钙素和骨桥素的分泌表达正在极化的成牙本质细胞功能型成牙本质细胞和成熟型成牙本质细胞均有强烈的DSPP表达, overexpressing cells; D: cells infected by lentivirus pnl-ires2-egfp as negative control; E: H&E

4 研究论文 972 A: 牙髓干细胞明场图片; B: 牙髓干细胞荧光图片, 显示EGFP报告蛋白在牙髓干细胞中的表达 A: bright field micrograph showing morphology of dental pulp stem cells; B: fluorescence micrograph showing expression of reporter gene EGFP in dental pulp stem cells. Fig.1 图1 慢病毒载体pNL-IRES2-EGFP转染牙髓干细胞 Transfection of lentivirus vector pnl-ires2-egfp to dental pulp stem cells 图2 不同感染复数对牙髓干细胞感染率的影响 Fig.2 Effect of different MOI on dental pulp stem cells A: 过表达Msx1; B: 过表达Bmp4; C: 过表达Pax9; D: 转染空载慢病毒 pnl-ires2-egfp; E: 该组切片的HE染色; F: RT-PCR检测结果 A: Msx1 overexpressing cells; B: Bmp4 overexpressing cells; C: Pax9 图3 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4对牙髓干细胞碱性磷酸酶表达的影响 Fig.3 Effect of human Msx1, Pax9 and Bmp4 overexpression on alkaline phosphatase activity in dental pulp stem cells 2.5 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4牙髓干细胞增强牙本质特异性蛋白牙本质涎蛋白骨钙素和骨桥素的分泌表达正在极化的成牙本质细胞功能型成牙本质细胞和成熟型成牙本质细胞均有强烈的DSPP表达, overexpressing cells; D: cells infected by lentivirus pnl-ires2-egfp as negative control; E: H&E staining; F: RT-PCR analysis of the expression of DSPP gene. 图4 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4对牙髓干细胞 DSPP表达的影响 Fig.4 Effect of human Msx1, Pax9 and Bmp4 overexpression on the expression of DSPP in dental pulp stem cells DSPP表达可作为成牙本质细胞分化成熟的标志在过表达Msx1 Pax9和Bmp4的牙髓干细胞中, 通过 RT-PCR的方法我们首先检测DSPP mrna的转录情

973 黄义德等: 过表达Msx1 Pax9和Bmp4对牙髓干细胞牙向分化的影响况, 与对照组相比, DSPP mrna的转录水平均有所增加, 其中过表达Msx1基因DSPP转录水平增加最为明显, 其次是过表达Bmp4和Pax9(图4F) DSPP是成牙本质细胞分泌的一种前体蛋白, 随后被割裂生成两种蛋白产物: 牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,

D: 转染空载慢病结果与RT-PCR结果相互吻合(图4) 毒; E: HE染色除DSP外, 骨钙素和骨桥素作为牙本质细胞外基质的成份存在于牙本质中, 也是成牙本质细胞分化的重要指标之一通过免疫组化技术我们检测了骨钙素和骨桥素在过表达Msx1 Pax9和Bmp4的牙髓干细胞中的表达情况结果显示, 过表达三个 A: Msx1 overexpressing cells; B: Bmp4

5 973 黄义德等: 过表达Msx1 Pax9和Bmp4对牙髓干细胞牙向分化的影响况, 与对照组相比, DSPP mrna的转录水平均有所增加, 其中过表达Msx1基因DSPP转录水平增加最为明显, 其次是过表达Bmp4和Pax9(图4F) DSPP是成牙本质细胞分泌的一种前体蛋白, 随后被割裂生成两种蛋白产物: 牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein, DPP) 利用DSP抗体检测三维培养的牙髓干细胞, 结果发现DSP的表达量明显增加在三个过表达基因中, 过表达MSX1的牙髓干细胞DSP的表达量增加最大, 其次是过表达Bmp4基因, 过表达Pax9 的牙髓干细胞DSP的表达量增加较少免疫组化的 A: 过表达Bmp4; B: 过表达Msx1; C: 过表达Pax9; D: 转染空载慢病结果与RT-PCR结果相互吻合(图4) 毒; E: HE染色除DSP外, 骨钙素和骨桥素作为牙本质细胞外基质的成份存在于牙本质中, 也是成牙本质细胞分化的重要指标之一通过免疫组化技术我们检测了骨钙素和骨桥素在过表达Msx1 Pax9和Bmp4的牙髓干细胞中的表达情况结果显示, 过表达三个 A: Msx1 overexpressing cells; B: Bmp4 overexpressing cells; C: Pax9 overexpressing cells; D: cells infected by lentivirus pnl-ires2-egfp as control; E: H&E staining. 图6 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4对牙髓干细胞钙化的影响 Fig.6 Effect of human Msx1, Pax9 and Bmp4 overexpression on the formation of calcified tissues in dental pulp stem cells 基因均能明显增强牙髓干细胞骨钙素的表达, 其中, Msx1和Bmp4增强程度比Pax9更为明显(图5) 在表化沉积, 其中过表达Msx1和Bmp4基因的牙髓干细胞达Msx1 Pax9和Bmp4三个基因中, Msx1和Bmp4能钙化明显(图6) 显著增强牙髓干细胞骨桥素的表达, Pax9对牙髓干细胞骨桥素的表达增强不是很明显(图5) 2.6 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4促进牙髓干细胞钙化利用茜素红S染色来进一步检测三维培养牙髓干细胞有无钙化及钙化沉积的程度结果显示过表达人Msx1 Pax9和Bmp4均能增加牙髓干细胞的钙 3 讨论干细胞是一类能进行自我更新的多潜能细胞, 在一定条件下, 如在某些生长因子的诱导下或在特定的微环境中, 可以分化成特定的功能性细胞一直以来, 人们希望利用干细胞的多能性使干细胞形成所需的特定类型的细胞组织甚至器官, 用来治图5 过表达人Msx1 Pax9和Bmp4对牙髓干细胞骨钙素和骨桥素表达的影响 Fig.5 Effect of human Msx1, Pax9 and Bmp4 overexpression on the expression of octeocalcin and osteopontin in dental pulp stem cells

6 974 研究论文疗疾病或修复受损的组织和器官要实现干细胞的这些功能, 涉及到对干细胞的定向诱导分化干细胞的定向诱导分化已经在脂肪干细胞神经干细胞骨髓干细胞牙髓干细胞等许多成体干细胞中广泛 [2-5,17-18] 开展近年来也有不少体外诱导牙髓干细胞牙向分化的研究, 主要通过两种手段进行一种是向培养的牙髓干细胞添加牙向分化中起重要作用的 [19] 生长因子, 诱导牙髓干细胞牙向分化另一种是在牙髓干细胞中过表达牙齿发育过程中重要的基 [20] 因, 使牙髓干细胞定向分化两种方法均有报道牙髓干细胞体外诱导后能形成牙本质样细胞结构, 但均不能替代有诱导能力的牙间充质形成牙齿的结构在这篇文章中, 我们在牙髓干细胞中过表达牙齿发育过程中起重要作用的三个基因 Msx1 Pax9 和 Bmp4, 研究其对牙髓干细胞牙向分化的诱导潜能本文主要采取三维培养的方法培养转染目的基因的牙髓干细胞研究表明三维培养法能够形成细胞与细胞细胞与基质间相互作用, 而且三维培养中细胞分泌的胞外基质能作为天然的支架支持细 [16] 胞的生长与分化与传统的体外单层培养皿培养相比, 三维培养提供了一个与体内更相似的细胞间或细胞与间质间相互作用的环境过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 基因的牙髓干细胞显示碱性磷酸酶的水平均有显著的增加碱性磷酸酶是成骨细胞与成牙本质细胞分化的早期标志 [21] 物, 对钙组织的形成起重要作用碱性磷酸酶表达的增加表明过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 基因促进牙髓干细胞的分化对三维培养的牙髓干细胞钙化沉积检测表明, 过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 的基因钙化沉积明显 RT-PCR 结果表明, 三维培养的牙髓干细胞 DSPP 基因的转录水平显著增加, 其中过表达 Msx1 增加最为明显, 约是对照的 3.3 倍 ( 图 4F) DSPP 表达是成牙本质细胞分化成熟的特征性的一个重要标志物 DSP 蛋白 (DSPP 前体蛋白加工的两个成熟蛋白之一 ) 免疫组化检测与 RT-PCR 结果一致, 过表达 Msx1 增加最为明显 DSPP 检测结果显示, 在促进牙髓干细胞牙向分化上, Msx1 和 Bmp4 的能力比 Pax9 更强这点在对另两个成牙本质细胞标志蛋白骨桥素和骨钙素的检测中得到进一步证实 ( 图 5 和图 6) 细胞培养水平上表明, 过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 可使牙髓干细胞不同程度的向成牙本质细胞分化, 但是否过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 的牙髓干细胞具有牙齿诱导能力, 还有待进一步体内重组实验的研究参考文献 (References) 1 Duailibi SE, Duailibi MT, Vacanti J, Yelick PC. Prospects for tooth regeneration. Periodontology 2000; 41: Ohazama A, Modino SA, Miletich I, Sharpe PT. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res 2004; 83(7): Jing W, Wu L, Lin Y, Liu L, Tang W, Tian W. Odontogenic differentiation of adipose-derived stem cells for tooth regeneration: Necessity, possibility, and strategy. Med Hypotheses 2008; 70(3): Wu L, Zhu F, Wu Y, Lin Y, Nie X, Jing W, et al. Dentin sialophosphoprotein-promoted mineralization and expression of odontogenic genes in adipose-derived stromal cells. Cells Tissues Organs 2008; 187(2): Papaccio G, Graziano A, d Aquino R, Graziano MF, Piro-zzi G, Menditti D, et al. Long-term cryopre-servation of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: A cell source for tissue repair. J Cell Physiol 2006; 208(2): Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(25): Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Boyde A, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res 2002; 81: Zhang Y, Chen Z, Song Y, Liu C, Chen Y. Making a tooth: Growth factors, transcription factors, and stem cells. Cell Res 2005; 15: Chai Y, Slavkin HC. Prospects for tooth regeneration in the 21st century: A perspective. Microsc Res Tech 2003; 60: Peters H, Neubuser A, Kratochwil K, Balling R. Pax9-deficient mice lack pharyngeal pouch derivatives and teeth and exhibit craniofacial and limb abnormalities. Genes Dev 1998; 12(17): Schuffenhauer S, Leifheit HJ, Lichtner P, Peters H, Murken J, Emmerich P. De novo deletion (14) (q11. 2q13) including PAX9: Clinical and molecular findings. J Med Genet 1999; 36(3): Satokaka I, Mass R. MSX1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet 1994; 6(4): Vastardis H, Karimbux N, Guthua SW, Seidman JG, Seidman CE. A human MSX1 homeodomain missense mutation causes selective tooth agenesis. Nat Genet 1996; 13(4): Winnier G, Blessing M, Labosky PA, Hogan BLM. Bone morphogenetic protein-4 is required for mesoderm formation and patterning in the mouse. Genes Dev 1995; 9: Chen YP, Bei M, Woo I, Satokata I, Mass R. Msx1 controls in-

7 黄义德等 : 过表达 Msx1 Pax9 和 Bmp4 对牙髓干细胞牙向分化的影响 975 ductive signaling in mammalian tooth morphogenesis. Development 1996; 122: Iohara K, Nakashima M, Ito M, Ishikawa M, Nakasima A, Akamine A. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res 2004; 83(8): Xu Y, Liu L, Li Y, Zhou C, Xiong F, Liu Z, et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adiposederived stem cells in vitro. Brain Res 2008; 1239: Daadi MM. In vitro assays for neural stem cell differentiation: Induction of dopaminergic phenotype. Methods Mol Biol 2008; 438: He H, Yu J, Liu Y, Lu S, Liu H, Shi J, et al. Effects of FGF2 and TGFb1 on the differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Cell Biology International 2008; 32: He F, Yang Z, Tan Y, Yu N, Wang X, Yao N, et al. Effects of Notch ligand Delta1 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Arch Oral Biol 2009; 54(3): Beck GR Jr, Zerler B, Moran E. Phosphate is a specific signal for induction of osteopontin gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(15): Induction of Dental Pulp Stem Cell Odontogenic Differentiation by Overexpression of Msx1, Pax9 and Bmp4 Huang Yide 1,2# *, Wang Fangfang 1#, Hu Xuefeng 1,2 ( 1 College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou , China; 2 College of Life Science, Fujian Normal University, Fujian Key Laboratory of Developmental and Neuro Biology, Fuzhou , China) Abstract Tooth regeneration based on stem cells is a promising biological strategy in tissue engineering. Studies showed that odontogenesis involves in epithelial-mesenchymal interaction in developing embryo, tooth regeneration using stem cells also requires both epithelium-derived stem cells and mesenchyme-derived stem cells. In recent studies, dental pulp stem cell (DPSC), which were isolated from dental pulp tissues, showed excellent pluripotency potential, and might be used as suitable mesenchyme-derived stem cells for tooth regeneration. In order to induce DPSCs into odontogenic lineage, we over-expressed Msx1, Pax9 and Bmp4 by lentivirus-mediated method in DPSCs, respectively. Our results showed that over-expression of Msx1, Pax9 and Bmp4 induced expression of dentin sialoprotein, osteocalcin and osteopontin, differentiation markers for odontoblasts, formed mineralized tissues, and all leaded to an elevated alkaline phosphatase in DPSCs in vitro. The ability to induce differentiation of DPSCs into odontoblasts has some difference for Msx1, Pax9 and Bmp4. Over-expression of Msx1 had the most effective induction on odontogenic differentiation in DPSCs in vitro, the second was over-expression of Bmp4, Pax9- expressing DPSCs didn t obviously express osteopontin and form calcified tissues. Key words dental pulp stem cell; Msx1; Pax9; Bmp4; odontogenic differentiation Received: May 7, 2011 Accepted: June 16, 2011 This work was supported by Fujian Provincial Natural Science Foundation of China (No.2008J04012) # These two authors contributed equally to this work *Corresponding author. Tel: , ydhuang@fjnu.edu.cn

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽