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败朱
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1 第 17 卷第 3 期生命科学研究灾燥造援员 7 晕燥援 3 圆园 13 年 6 月蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Jun. 圆园 13 窑综述窑非牙源性干细胞在牙齿再生研究中的应用宋颖楠, 林鑫, 朱伯汉, 王冰梅 * ( 福建师范大学生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 中国福建福州 ) 摘要院近年来, 干细胞治疗研究获取的成果为牙齿的修复和再生研究奠定了有力的理论基础. 根据牙齿的发育特征, 牙齿再生需要牙源性的上皮干细胞和牙源性的间充质干细胞, 目前研究表明, 牙源性的间充质干细胞可应用于牙齿再生, 例如牙髓干细胞和牙周韧带干细胞. 但是, 人牙源性上皮干细胞仅存在于胚胎期, 萌发后的牙齿并不存在牙上皮干细胞, 因此学者们开始探索将非牙源性干细胞替代牙源性上皮细胞应用于牙齿再生研究. 以下概述了胚胎干细胞尧成体干细胞和诱导性多潜能性干细胞等非牙源性干细胞在牙齿再生中的研究进展. 关键词 : 干细胞 ; 牙上皮 ; 釉质 ; 牙齿再生中图分类号 : Q819 文献标识码 : A 文章编号 : 1007 鄄 7847 渊 2013 冤 03 鄄 0262 鄄 05 Nonodontogenic Stem Cells in the Application Research of Tooth Regeneration SONG Ying 鄄 nan, LIN Xin, ZHU Bo 鄄 han, WANG Bing 鄄 mei * (Fujian Key Laboratory of Development and Neurobiology, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou , Fujian, China) Abstract:Recent progress in stem cell 鄄 based therapeutic research is provided apowerful tool for the repair, regeneration of defective teeth. According to the developmental characteristics of the teeth, tooth regenera 鄄 tion need odontogenic epithelial stem cell and odontogenic mesenchymal stem cell. At present, various odontogenic mesenchymal stem cells (for example, dental pulp stem cells and periodontal ligament cells etc.) which are isolated from adult teeth have been applied to the tooth regeneration. Because odontogenic epithe 鄄 lial cells undergo apoptosis after enamel formation and are no longer present in erupted teeth. Moreover, if the enamel suffered corrosion or mechanical damage, it would cause permanent and irreversible damage. Therefore, an alternative solution is to use nondontogenic stem cells to replace the odontogenic epithelial cells. The recent progresses regarding the application of nonodontogenic stem cells (embryonic stem cells, adult stem cells and induced pluripotent stem cells) in tooth regeneration were reviewed. Key words: stem cells; dental epithelium; enamel; tooth regeneration (Life Science Research,2013,17(3):262 耀 266) 机械损伤化学物质的腐蚀或人体本身自有的基因缺陷等因素可能会造成釉质永久性的缺损和牙齿内部结构的损伤, 严重时还会造成牙齿缺 [1,2] 失. 目前修复牙齿的方法主要是利用非生物材料或人造的填充物修补牙齿, 以及直接将种植义齿插入上下颌骨以替代缺少的牙齿, 但这些方法都容易使口腔产生异物感, 并且由于人体自身的主要组织相容性等原因, 可能会引起免疫排斥. 收稿日期 : 2013 鄄 01 鄄 22; 修回日期 : 2013 鄄 03 鄄 04 基金项目 : 国家自然科学基金青年科学基金资助项目 ( ); 福建省教育厅科技项目 (JA12081); 福建省自然科学基金资助项目 (2011J01146); 福建师范大学优秀青年骨干教师培养基金资助项目 (fjsdjk ) 作者简介 : 宋颖楠 (1986 鄄 ), 女, 贵州贵阳人, 硕士研究生, 主要从事干细胞与再生医学研究 ; * 通讯作者 : 王冰梅 (1982 鄄 ), 女, 福建南安人, 福建师范大学生命科学学院讲师, 博士, 主要从事干细胞与再生医学研究,Tel: 0591 鄄 , E 鄄 mail: bmwang@fjnu.edu.cn.

2 第 3 期宋颖楠等 : 非牙源性干细胞在牙齿再生研究中的应用 263 随着干细胞生物学发育生物学和组织工程学的迅猛发展, 学者们开始从器官发育的角度出发, 根据目前已知的与牙齿发育相关的分子机制, 探索将干细胞技术与组织工程学技术相结合应用于牙齿的修复和再生研究. 牙齿是由外胚层上皮干细胞和颅神经嵴间充质干细胞相互作用而形成的, 牙齿再生过程也离不开这两种细胞. 目前, 已从人类牙齿中分离出乳牙干细胞牙周韧带干细胞牙乳头干细胞和牙髓干细胞等牙源性的间充质干细胞, 将这些细胞移植到裸鼠体内后几乎可以分化为除了釉质以外的所有牙齿组成部分, 例如牙本质牙周韧带牙 [3 耀 5] 骨质和牙髓, 这些研究从理论上解决了牙齿再生过程中间充质干细胞的来源问题. 在人类牙齿发育过程中, 牙上皮干细胞是唯一能够分泌釉质 [6] 的细胞, 牙上皮在釉质分泌后就凋亡了, 人们要获取牙上皮干细胞必须从人类的胚胎幼儿或者青少年身上取得, 这将涉及道德观念法律限制和伦理等问题, 另外在体外分离牙上皮干细胞非 [7] 常困难, 并且难以维持细胞原有的形态, 所以这些细胞难以大规模培养和应用于临床治疗. 因此学者们开始探索利用干细胞的可塑性与再生医学的理论相结合由非牙源性干细胞替代牙源性上皮细胞应用于牙齿再生研究. 1 牙齿再生研究概况牙齿再生 (tooth regeneration) 是通过获得自体或异体的牙源性种子细胞, 在体内构建具有一 [8] 定形态和功能的牙器官, 替换病损的牙齿. 目前研究牙齿再生的方法主要有以下两种 : 1.1 牙源性干细胞与生物支架材料复合体该方法是将牙源性干细胞接种到复合支架材料上, 并移植到免疫缺陷小鼠体内进行培养. 有研究报道, 将人类第三磨牙切除牙冠和压根部分, 然后将牙髓取出, 用 poly 鄄 L 鄄 lactic acid (PLLA) 支架填补牙髓腔制成 1mm 厚的牙齿薄片, 之后将消化后的脱落乳牙的干细胞 (SHED) 滴加到该薄片上并移植到免疫缺陷小鼠皮下培养 14 耀 32 d 后, 可以发现 SHED 细胞分化为成牙本质细胞和 [9,10] 内皮细胞. 除 PLLA 外, 常用的生物支架材料还有胶原壳聚糖羟基磷灰石鄄磷酸三钙等, 生物支架材料在使用时还需考虑该材料与人体的组织相容性降解速度空间结构和毒性等等. 1.2 胚层重组方法经典的胚层重组实验是 1987 年 Mina 等 [11] 首先建立的, 他们先是将处于胚胎期第 9d(E9) 耀 11 d(e11) 的第一鳃弓 ( 将来发育为口腔等器官 ) 上皮与第二鳃弓间充质重组, 发现有牙齿形成. 该实验说明了在 E9 耀 E12 d, 小鼠的成牙潜能在牙上皮, 可以诱导非牙源性的间充质组织牙向分化. 另外, 胚层重组方法还与重组体培养的微环境控制, 器官培养技术有关. 2 非牙源性干细胞在牙齿再生研究中的现状由于牙源性上皮细胞培养困难, 因此目前学者们正尝试利用牙源性间充质细胞或组织提供牙齿发生的信号, 结合胚层重组实验和生物材料的优点, 利用特定的信号分子诱导非牙源性干细胞牙向分化. 在牙齿再生领域, 已有 3 种干细胞用于组织工程牙齿的构建 : 即成体干细胞胚胎干细胞和诱导性多潜能性干细胞. 2.1 胚胎干细胞胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ESCs) 是一种高度未分化的细胞, 具有自我更新和无限增殖的能力, 在一定条件下,ESCs 还能被诱导分化为机体中几乎所有的细胞类型. 目前, 已有一些研究报道 ESCs 具有分化为类似于牙齿中的成骨细胞的潜能 [12,13], 并且将其与口腔上皮细胞重组后,ESCs 可以分化为与成牙本质细胞类似的细胞 [14]. 在 2010 年,Ning 等 [15] 寻找到一种能够有效诱导小鼠 ESCs 向牙上皮细胞方向分化的方法. 在这项研究中, 作者将小鼠 ESCs 放在无血清的 ameloblasts serum 鄄 free conditioned medium(asf 鄄 CM) 中培养, 并诱导其向牙上皮细胞方向分化. 在 ASF 鄄 CM 中培养 14 d 后, 形成类胚体的 ESCs 中细胞角蛋白 14(CK14) Ameloblastin Amelogenin 等成釉细胞特异性蛋白的表达比没有形成类胚体的胚胎干细胞强. 他们还发现将诱导的类胚体移植到裸鼠的体内, 能够长出具有类似牙源性上皮细胞特性的结构. 这说明 ASF 鄄 CM 可以为胚胎干细胞提供一个适宜的微环境, 使其向牙上皮细胞方向分化. 这些研究表明胚胎干细胞不仅具有分化为与牙源性间充质细胞和上皮细胞的潜能, 并且对于研究干细胞的定向分化具有重要的意义. 2.2 成体干细胞成体干细胞具有自我更新和多向分化的潜

3 264 生命科学研究圆园 13 年能, 并且具有组织取材过程创伤性小, 细胞易于分离培养, 短时间内能够大量扩增的优点, 主要用于细胞移植和细胞替代治疗. 成体干细胞的发现不仅使患者用自身的成体干细胞治疗疾病成为可能, 还避免了免疫排斥的问题表皮干细胞表皮干细胞是一种位于表皮基底部的成体干细胞, 可以分化为表皮中的各种组织细胞, 维持 [16] 表皮的正常结构和内部稳定. 表皮干细胞可用于 [17] [18] 眼角膜的再生以及治疗重度烧伤的病人. 因此, 表皮干细胞是一种经过体外培养后仍能安全应用于临床的干细胞. [19] Wang 等从儿童包皮环切手术中废弃的包皮中分离出表皮干细胞, 并采用胚层重组的方法将其与小鼠 E13.5 d 的牙胚间充质重组, 发现在重组体中分别加入 FGF8 及 SHH 蛋白, 或同时加入 FGF8 和 SHH 蛋白,E13.5 d 小鼠间充质都可以诱导人类表皮干细胞向成牙釉质细胞方向分化. 这一研究结果说明表皮干细胞在 FGF8 SHH 生长因子的诱导和牙间充质的支持下, 可以分化为成釉质细胞并分泌釉质, 同时添加 FGF8 生长因子还能诱导牙上皮关键基因 Pitx2 的表达. 这 [20] 一发现与 Kettunen 等的结果一致, 并且 Fgf8 还具有在牙齿发育早期参与决定牙齿发生位置和发育类型的作用. 由于表皮干细胞的培养技术较成熟, 来源广泛, 因此表皮干细胞可以作为组织工程牙中牙上皮再生的种子细胞口腔上皮干细胞口腔上皮干细胞与牙源性上皮干细胞一样都来自于来自外胚层上皮. 口腔上皮是一种复层扁平组织, 由于基底层的表皮干细胞的存在, 口腔 [21] 上皮可以迅速进行自我的更新. 口腔上皮很少进行分裂, 因为在组织受损或者受到外界刺激时, 它们可以迅速增殖, 促进伤口的愈合. 口腔上皮还可 [22] [23] 以应用于其他组织的重建, 例如口腔表皮以 [24] 及眼表 (ocular surface) 的再生等. [25] Xiao 等将人类的口腔上皮细胞 (OEC) 和牙髓干细胞 (DPSCs) 置于胶原或人工基底膜上进行培养建立了一个牙齿早期发育的三维模型. 这项研究结果表明, 将口腔上皮细胞与牙髓干细胞在体外进行重组, 能够模拟出牙上皮的下陷过程. 而另外一种永生化的口腔上皮细胞 NDUSD 鄄 1 却无法与牙髓干细胞形成下陷与包绕凝聚. 这说明选择合适的细胞类型对在体外模拟牙齿发育的过程有至关重要的作用. 作者还发现 OECs 和 DP 鄄 SCs 形成的重组体中 CDH1(E 鄄 cadherin) 的表达显著高于 NDUSD 鄄 1, 而 CDH2(N 鄄 cadherin) 的表达则低于 NDUSD 鄄 1, 在 NDUSD 鄄 1 中甚至不表达 Shh 和 Wnt10b, 这证明了 CDH1 CDH2 Shh 和 Wnt10b 可能是引起牙上皮下陷的关键因子, 而口腔上皮干细胞也有代替牙源性上皮细胞进行牙齿再生研究的潜能. 文章中构建的牙齿再生培养模式也可以作为研究其他器官中上皮与间充质相互作用研究的一个工具, 例如毛囊和肺的再生等骨髓干细胞已有报道证明骨髓中有干细胞的存在, 并且 [26,27] 有分化为类牙间充质细胞的潜能, 还有研究显 [28 耀 30] 示骨髓干细胞可以分化为各种类型的上皮细胞. [31] Lei 等从 4 周龄的 Sprague 鄄 Dawley(SD) 大鼠的胫骨和股骨中分离出骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMM 原 SCs) 接种到去除了牙齿颈部和牙釉质的人类第三磨牙牙本质平板 ( 带有牙髓腔 ) 和牙本质薄片 ( 已切成 2mm 3 大小 ) 上, 之后将接种有 BMMSCs 的牙本质薄片移植到 8 周龄的 SD 大鼠肾囊膜下培养 6 周, 而接种有 BMMSCs 的牙本质平板则在体外培养 2 周. 经 RT 鄄 PCR 和 Western 鄄 blot 检测技术可以发现牙本质特有的标志物 DSP/Dspp 表达强烈, 在牙本质薄片周围还发现有极化的细胞出 [32] 现.2006 年,Hu 等分别从 16 耀 20 周龄的 C57BL/ 6 鄄 EGFP 和 CD1 小鼠中分离出骨髓细胞, 然后将带有 c 鄄 Kit 标记的骨髓干细胞与牙源性上皮细胞混合, 再与牙间充质进行重组. 经免疫荧光技术检测发现, 带有 c 鄄 Kit 标记的骨髓干细胞迁移到牙间充质细胞附近, 其表现出来的形态分子和功能特征都与牙源性上皮相似. 以上结果证明了骨髓细胞也可以被诱导为与牙源性的上皮和间充质细胞类似的细胞, 也说明骨髓细胞有作为牙源性上皮细胞和间充质细胞来源的潜能, 虽然这两项研究中应用到牙源性的细胞和组织, 但对人们研究来自不同胚层和不同类型的干细胞转分化的过程有重要意义. 2.3 诱导性多潜能性干细胞 ips 细胞 (induced pluripotent stem cell) 的出现为干细胞研究带来了一个全新的理念. 构建 ips 细胞的原理主要是通过导入与胚胎干细胞特性相关的外源基因诱导体细胞发生重编程, 从而使体细胞转变成诱导性多潜能性干细胞, 即 ipsc. 目

4 第 3 期宋颖楠等 : 非牙源性干细胞在牙齿再生研究中的应用 265 前, 在构建 ips 细胞的技术上使用比较多的是慢病毒载体逆转录病毒载体和腺病毒载体的方法. 而为了使 ips 技术走向临床, 科学家们还研制出 [33] [34] 了非整合性的病毒载体和利用蛋白质诱导体细胞重编程为 ips 细胞的方法.iPS 细胞在伦理上要比胚胎干细胞更具优势, 而在分化潜能上则比成体干细胞更具有可塑性. ips 技术应用于牙齿再生上的研究还较少, [35] Harada 等首先将小鼠的 ips 细胞诱导成的神经嵴样的细胞再诱导形成牙源性间充质细胞.Duan [36] 等将 ips 细胞与釉质基质衍生物重组诱导为牙 [37] 周组织.Wen 等先将小鼠的 ips 细胞放在类胚体培养基中培养 3d, 之后将该类胚体消化成单细胞悬液, 并将该细胞放在添加有 BMP4 或 FGF4 蛋白的成骨诱导培养液进行培养,14 d 后收集细胞, 经 Real 鄄 time PCR 和 Western 鄄 blot 技术检测可以发现在成骨诱导培养液中的 Msx1 Lhx7 Pax9 和 Runx2 等牙源性间充质特有的标志物表达明显上升. 之后作者从 E14.5 d 小鼠的门牙牙胚中剥离出牙源性上皮和牙源性间充质组织, 再从这两种组织中分离出上皮细胞和间充质细胞, 并将这两种细胞与小鼠的 ips 细胞进行重组后在体外培养 5d 再移植到裸鼠肾囊膜下 4 周, 可以发现该重组体形成了与正常牙齿类似的结构, 具有完整的牙釉质牙本质和牙髓组织. 这些结果表明 ips 细胞可以作为牙齿再生研究中干细胞的来源, 也对牙齿发育过程的研究有重要意义. 而牙源性上皮细胞的再生可以参考这些研究中提出的方法, 首先通过 ips 技术诱导体细胞重编程, 再经外界环境的诱导使 ips 细胞定向分化为具有与正常牙上皮细胞特征类似的细胞. 3 小结与展望利用干细胞的特性, 在外界条件的诱导下 ( 例如培养基生长因子等 ), 通过胚层重组等方法可以将不同来源的干细胞诱导为类牙上皮细胞. [15] 虽然 Ning 等成功将小鼠 ESCs 诱导为类牙源性上皮细胞, 但对 ESCs 牙向分化的分子机制尚不清楚, 并且作者使用的 ASF 鄄 CM 培养基是否适用于诱导人 ESCs 向牙上皮细胞方向分化还需 [38] 进一步的探索. 除此之外, 有研究表明在应用 ESCs 进行干细胞治疗时, 有很大几率形成畸胎瘤, 而不是在定向分化后修复受损的器官, 使患者恢复健康, 所以对 ESCs 在临床上的应用必须谨慎, 尽量消除畸胎瘤的形成. 有报道证明将成体细胞重编程为 ips 细胞时会导致 DNA 损伤, 这种损伤体现在特定染色体上的基因组区域被删除或扩增 [39], 另外 ips 技术的应用也有可能导致恶性肿瘤的产生 [40], 因此在临床应用之前, 必须对 ips 细胞进行严格鉴定, 准确测试其基因的完整性. 成体干细胞种类繁多, 来源广泛, 还避免了 ESCs 面临的伦理道德和法律上的问题. 并且成体干细胞在一定条件下可以被诱导分化为类牙上皮细胞, 这意味着人们可以将自身的成体干细胞应用于牙齿再生研究, 可以在一定程度上避免异体移植所带来的免疫排斥问题, 而这是胚胎干细胞和 ips 细胞所欠缺的. 但是, 成体干细胞也有缺点, 例如增殖能力不够强, 在体外培养的过程中难以维持细胞的形态和特性, 牙向分化的效率较低, 从一些患有基因缺陷症的患者身体中分离出的成体干细胞也有可能带有缺陷基因等等. 因此, 从临床治疗角度出发, 还需要进一步深入了解牙齿发育过程中的分子机制, 找到能够高效诱导非牙源性干细胞牙向分化且安全可靠的方法, 这也是牙齿再生研究亟需解决的问题. 参考文献渊 References 冤 : [1] ROSS MH, PAWLINA W. Histology: AText and Atlas: With CorrelatedCell and MolecularBiology[M]. USA: Lippincott Will 鄄 iams &Wilkins, 鄄 453. [2] BROWN TL. Chemistry: The Central Science[M]. USA: Pear 鄄 son Education, [3] GRONTHOS S, MANKANI M, BRAHIM J, et al. Postnatal humandental pulpstemcells (DPSCs) in vitro and in vivo[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97 (25): 鄄 [4] GRONTHOS S, BRAHIM J, LI W, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells[j]. Journal of Dental Research, 2002, 81(8): 531 鄄 535. [5] YU J, DENG Z, SHI J, et al. Differentiation of dental pulp stem cells into regular 鄄 shaped dentin 鄄 pulp complex induced by toothgermcellconditionedmedium[j].tissueengineering,2006, 12(11): 3097 鄄 [6] LI X. Human stem cells and tooth regeneration[j]. Journal of Stem Cell Research &Therapy, 2012, 2(3): e107. [7] YEN AH, YELICK PC. Dental tissue regeneration amini 鄄 re 鄄 view[j]. Gerontology, 2011, 57(1): 85 鄄 94. [8] 金岩, 王松灵. 口腔颌面发育生物学与再生医学 [M]. 人民卫生出版社 (JIN Yan, WANG Song 鄄 ling. Oral and Maxillofacial Development Biology and Regeneration Medicine[M]. Beijing: People 忆 smedical Publishing House), 鄄 214. [9] SAKAI V, ZHANG Z, DONG Z, et al. SHED differentiate into functional odontoblasts and endothelium[j]. Journal of Dental Research, 2010, 89(8): 791 鄄 796. [10] CORDEIRO MM, DONG Z, KANEKO T, et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous

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