口腔2018-8

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栾狄
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1 491 [DOI] /j.issn 基础研究不同浓度 MTA 对根尖乳头干细胞增殖及分化的影响牛巧丽 1, 李一鸣 2, 宋艳艳 3, 李晨曦 4 1, 赵今 1. 新疆医科大学第一附属医院牙体牙髓科, 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 (830054); 2. 新疆医科大学第一附属医院牙周粘膜科, 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 (830054); 3. 新疆医科大学第一附属医院口腔修复科, 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 (830054); 4. 汉堡大学附属医院头部及神经中心, 口腔颌面外科, 头颈部肿瘤遗传学实验室, 头颈部再生医学实验室, 德国汉堡 (20246) 摘要目的探讨不同浓度无机三氧化矿物凝聚体 (mineral trioxide aggregate,mta) 对根尖乳头干细胞 (stem cells from apical papilla,scap) 增殖及分化能力的影响及促进其向成牙本质细胞分化的潜力方法向 SCAP 分别加入不同浓度 MTA 培养液, 配制成浓度为 mg/ml 的 MTA 实验组 ; 设不含 MTA 而含有 15% 胎牛血清的 α MEM 培养液为对照组,CCK 8 法测定 d 的细胞数, 观察不同浓度 MTA 对 SCAP 增殖的影响, 使用 Real time PCR 检测分化相关基因牙本质涎蛋白 (dentinsialoprotein,dspp) Runt 相关转录因子 (runt related transcription factor 2, Runx2) 表达的变化结果培养 1 d 时, 各实验组的 MTA 实验组对 SCAP 的体外增殖的促进作用与对照组相比差异均无统计学意义 (P>0.05); 而在培养 3 5 及 7 d 时,0.01 mg/ml 组的体外增殖作用比对照组高, 差异有统计学意义 (P<0.05), mg/ml 组与对照组差异均无统计学意义 (P>0.05), mg/ml 组的体外增殖作用均低于对照组, 差异有统计学意义 (P< 0.05) Real time PCR 检测显示, 经 0.01 mg/ml MTA 处理 7 d 的实验组细胞 DSPP(t= 11.12,P<0.05) 及 Runx2 (t= 10.62,P<0.05) 表达水平高于对照组结论 0.01 mg/ml 浓度组对 SCAP 的增殖成牙本质分化及成骨分化有显著促进作用, 而高浓度 MTA 则抑制 SCAP 的增殖关键词 MTA; 根尖乳头干细胞 ; 增殖 ; 分化 ; 基因表达中图分类号 R781.3 文献标识码 A 文章编号 (2018) 引用著录格式牛巧丽, 李一鸣, 宋艳艳, 等. 不同浓度 MTA 对根尖乳头干细胞增殖及分化的影响 [J]. 口腔疾病防治,2018,26(8): Effects of different concentrations of MTA on the proliferation and differentiation of stem cells from the apical papilla NIU Qiaoli 1, LI Yiming 2, SONG Yanyan 3, LI Chenxi 4, ZHAO Jin Department of Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi , China; 2. Department of Periodontics & Oral Medi cine, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi , China; 3. Department of Prosthodon tics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi , China; 4. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Head and Neurocenter Tumor Genetics Laboratory, Regenerative Medicine Laboratory Uni versity Medical Center Hamburg Eppendorf (UKE), Hamburg 20246, Germany Corresponding author: ZHAO Jin, merryljin@sina.com, Tel: Abstract Objective To investigate the effect of different concentrations of MTA on the proliferation and differen tiation of stem cells from the apical papilla (SCAP) and the potential of the SCAP to differentiate into odontoblasts. Methods SCAP were cultured in different concentrations of mineral trioxide aggregate(mta). MTA experimental group with concentration of 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 10 mg/ml and 20 mg/ 收稿日期 ; 修回日期基金项目新疆维吾尔自治区自然科学基金项目 (2016D01C315) 作者简介牛巧丽, 主治医师, 硕士, @qq.com 通信作者赵今, 教授, 博士, merryljin@sina.com

2 492 口腔疾病防治 2018 年 8 月第 26 卷第 8 期 ml were prepared. The number of cells at 1 day, 3 days, 5 days and 7 days were measured via a CCK 8 assay to ob serve the effect of MTA on SCAP proliferation. Real time PCR was used to detect the gene expression changes. Cells cultured in alpha MEM culture containing 15% FBS without MTA were set as the control group. Results When cul tured for 1 d, statistically significant differences in the promotion of in vitro proliferation of SCAP were not observed be tween each MTA experimental group and the control group (P>0.05). When cultured for 3 d, 5 d and 7 d, the 0.01 mg/ ml MTA group presented obvious promotion of SCAP proliferation compared with the control group (P<0.05), whereas the 0.02 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 1 mg/ml groups did not presented differences with the control group (P> 0.05). The in vitro proliferation of the 2 mg/ml, 10 mg/ml and 20 mg/ml groups was lower than that of the control group (P<0.05). Real time PCR detection showed that the expression levels of DSPP (t= 11.12, P < 0.05) and Runx2 (t= 10.62, P < 0.05) in the experimental group treated with 0.01 mg/ml MTA for 7 days were higher than those in the control group. Conclusion The 0.01 mg/ml concentration of MTA significantly promotes the proliferation of SCAP and shows the best ability to induce osteogenic and odontoblast differentiation in the SCAP, whereas high concentrations of MTA inhibited the proliferation of SCAP. Key words Mineral trioxide aggregate; Stem cells from apical papilla; Proliferation; Differentiation; Gene expression [1 2] Sonoyama 等从人和猪的未完全发育完成的年轻恒牙的根尖乳头组织中发现并分离出一种新的间充质干细胞根尖乳头干细胞 (stem cells from apical papilla,scap), 并证明这类细胞是与牙髓干细胞是不同类型的细胞 SCAP 因其高度的增殖能力较强的自我更新能力和多向分化的潜能, 迅速成为促使牙本质再生及牙根发育的研究焦点, 在诱导根尖孔的闭合及牙根的形成方面发挥着重要作用目前使用的氢氧化钙材料盖髓, 可能会导致一些牙髓组织失去正常功能, 严重时被吸收, 导致根管钙化等现象 [3] 无机三氧化矿物凝聚体 (min eral trioxide aggregate,mta) 作为新型的盖髓材料, 具有封闭性好持久性好刺激性及生物毒性低等特点研究发现高浓度的 MTA 对牙髓干细胞起到抑制作用 [4] 为明确高浓度 MTA 是否对 SCAP 也有抑制增殖的作用, 并摸索和筛选能促进 SCAP 增殖的最适 MTA 浓度, 本实验将制取不同浓度的 MTA, 观察其对 SCAP 增殖能力的影响, 并探索适宜浓度的 MTA 是否具有促进 SCAP 向成牙骨质或者成骨分化的潜能, 为临床上应用 MTA 做年轻恒牙的根尖诱导提供理论依据 1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器 α MEM 培养基 (Hyclone, 美国 ), 胎牛血清 FBS ( 四季青, 中国 ),STRO 1,CD90 和 CD24 单克隆抗体和 FITC 标记的二抗 (millipore, 美国 ),CCK 8 (Dojindo, 日本 ), 流式细胞仪 (BD FACSAria, 美国 ), 倒置相差显微镜及照相系统 ( 莱卡, 德国 ), 酶联免疫仪 (Thermo Fisher Scientific, 美国 ),MTA (Dentsply 公司, 美国 ) PrimeScriptTM RT reagent Kit 逆转录试剂盒 (Takara, 日本 ); 引物合成 ( 奥科生物技术公司, 中国 );SYBR Premix Ex TaqTM Real time PCR 试剂盒 (Takara, 日本 ) 1.2 实验方法根尖乳头干细胞分离培养实验牙来源于新疆医科大学第一附属医院口腔颌面外科门诊患者, 年龄 15~18 岁, 因阻生而拔除的牙根未发育完成的第三恒磨牙, 无牙体牙周组织疾病, 经患者知情同意, 牙拔除后用含双抗 ( 青霉素和链霉素 ) 的 Hanks 液洗去血迹, 在无菌操作台中, 用组织剪将牙根与牙根根尖部质地柔软的根尖乳头组织剪开, 使两者分离, 将牙乳头组织用 PBS 缓冲液清洗 3 次后, 转移至含有 10 ml 培养液 ( 含有 15% 的血清 ) 的培养皿中, 用组织剪在培养皿中反复剪碎先前得到的牙乳头组织, 直至牙乳头组织变成一个个类似针尖大小的细小组织块, 用巴氏管将小组织块与培养液完全混匀, 置于 37 体积分数为 5% 的 CO 2 恒温细胞培养箱中细胞贴壁后隔日半换液倒置显微镜下观察细胞生长情况, 细胞融合率达 80% 后按 1 3 传代根尖乳头干细胞的鉴定取第 2 代 SCAP, 消化重悬并计数, 以个细胞每 500 μl 分装至 4 个 EP 管中, 避光条件下分别加入经 FITC 标记的相关抗体 STRO 1,CD90 和 CD24, 最后 1 管不加

493 抗体, 作阴性对照室温孵育 30 min 后于流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达情况 1.2.3 实验分组依照说明书, 将 MTA 粉末与无菌蒸馏水混合调匀, 凝固后, 捣碎成粉末, 取一定量的 MTA 粉末分别加入含有 15% 胎牛血清的 α MEM 的培养液, 配制成浓度为 0.01 0.

具体为到达预定时间点后, 用 PBS 轻柔漂洗各组细胞后, 吸弃 PBS, 并在避光条件下按说明书每孔加入配制好的 CCK 8 检测液 100 ul, 每组设 6 个复孔, 37 孵育 2 h,450 nm 测其吸光度 1.2.5 基因表达检测将密度为 3 10 5 个 /ml 的 SCAP 细胞悬液接种于 6 孔板, 处理方法同 1.2.3 中浓度为 0.

3 493 抗体, 作阴性对照室温孵育 30 min 后于流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达情况实验分组依照说明书, 将 MTA 粉末与无菌蒸馏水混合调匀, 凝固后, 捣碎成粉末, 取一定量的 MTA 粉末分别加入含有 15% 胎牛血清的 α MEM 的培养液, 配制成浓度为 mg/ml 的 MTA 实验组培养液来培养细胞对照组不含 MTA 而含有 15% 胎牛血清的 α MEM 的培养液培养细胞 CCK 8 法检测细胞增殖能力取第四代生长良好的 SCAP 以个 /ml 的密度接种于 96 孔板中, 依照分组每孔加入相应的培养液, 在培养 d 用 CCK 8 方法检测细胞的增殖情况具体为到达预定时间点后, 用 PBS 轻柔漂洗各组细胞后, 吸弃 PBS, 并在避光条件下按说明书每孔加入配制好的 CCK 8 检测液 100 ul, 每组设 6 个复孔, 37 孵育 2 h,450 nm 测其吸光度基因表达检测将密度为个 /ml 的 SCAP 细胞悬液接种于 6 孔板, 处理方法同中浓度为 0.01 mg/ml 组, 在培养的第 7 天, 用 PBS 漂洗细胞后, 加入 Trizol(1 ml/ 孔 ), 提取细胞总 RNA, 按照 2 μg 反转 20 μl 体系进行反转录, 反应条件为 :42,15 min( 循环 3 次 ),85,5 s 采用 RT PCR 检测牙本质涎蛋白 (dentinsialoprotein,dspp) Runt 相关转录因子 (runt-related transcription factor 2, Runx2) 的表达水平, 引物序列见表 1 PCR 扩增反应条件 : 预变性 :95,5 s;pcr 反应 :95,5 s; 55,30 s;72,30 s; 共 40 个循环 ; 溶解曲线分析 :95,5 s 2 ΔΔCt 计算实验组的目的基因经 GAPDH( 内参 ) 校正后相对于对照组的相对表达量表 1 RT PCR 引物序列 Table 1 Primer sequence for the RT PCR 基因上游引物下游引物 DSPP GCATTTGGGCAGTAGCATGG CTGACACATTTGATCTTGCTAGGAG Runx2 CCATAACGGTCTTCACAAATCCT GGCCGGGACCTGACTGACTA GAPDH GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA 1.3 统计学分析采用 SPSS 17.0 统计软件对结果进行统计分析, 数据用 x ± s 表示, 所有实验均重复 3 次, 不同浓度实验组间的比较采用单因素方差分析, 方差分析有统计学差异时采用 Dunnett t 检验进行组内两两比较,P<0.05 为差异具有统计学意义 2 结果 2.1 牙根尖乳头组织形态观察牙根未发育完成的第三恒磨牙, 牙冠和牙根部呈球状的柔软的根尖乳头组织已分离 ( 图 1); 显微镜下 SCAP 细胞呈长梭形漩涡状排列 ( 图 2) 图 1 牙根未发育完成的第三恒磨牙根尖乳头组织 Figure 1 Apical papillary tissue of the third molar with an undeveloped root 图 2 SCAP 体外培养第四代细胞 40 Figure 2 SCAP in vitro culture of the fourth generation of cells SCAP 组织来源鉴定流式细胞仪检测结果显示 :SCAP 阳性表达间充质干细胞表面标记 CD90(96.2%) 和 STRO 1 (41.1%), 弱表达早期神经干细胞表面标记物 CD24(5.4%) 因为牙髓干细胞不表达 CD24 [5], 表明本实验得到的细胞为根尖乳头干细胞 SCAP 而非牙髓干细胞 2.3 不同浓度 MTA 对 SCAP 增殖影响如图 3 所示, 在培养 1 d 时,MTA 实验组对 SCAP 的体外增殖的促进作用与对照组相比差异均无统计学意义 (P>0.05) 而在培养 3 d 5 d 及 7 d 时,0.01 mg/ml 组的体外增殖作用比对照组高, 差异均具有统计学意义 (F=3.55,P=0.011,t D(3d)= 4.12,P (3d)=0.005;t D(5d)=3.94,P (5d)= 0.007;t D(7d)=

494 口腔疾病防治 2018 年 8 月第 26 卷第 8 期光密度值 (450 nm) 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 1 d 3 d 5 d 7d 0 0.01 0.02 0.1 0.2 1 2 10 20 对照 MTA 浓度 (mg/ml) :P<0.

4 494 口腔疾病防治 2018 年 8 月第 26 卷第 8 期光密度值 (450 nm) d 3 d 5 d 7d 对照 MTA 浓度 (mg/ml) :P<0.05 vs 对照组 Figure 3 图 3 MTA 对 SCAP 增殖影响 Effects of MTA on the proliferation of SCAP 3.23,P (7d)= 0.026); 在培养 3 d 5 d 及 7 d 时 0.02 mg/ml,0.1 mg/ml,0.2 mg/ml,1 mg/ml 组与对照组差异均无统计学意义 (F=1.338,P=0.353), 而 2 mg/ml,10 mg/ml,20 mg/ml 组的体外增殖作用均低于对照组, 差异有统计学意义 (F=6.14,P < 0.005), 表明这 3 种浓度对 SCAP 增殖有抑制作用 mg/ml MTA 对 SCAP 成牙本质 / 成骨基因表达的影响 RT PCR 检测结果显示, 经 0.01 mg/ml 的 MTA 处理 7 d 的实验组细胞 DSPP(t= 11.12,P<0.05) 及 Runx2(t= 10.62,P<0.05) 表达水平高于对照组 ( 图 4) 提示 0.01 mg/ml 的 MTA 有影响 SCAP 分化方向的潜能 3 讨论牙髓受到感染的年轻恒牙, 由于其牙根还在发育过程中, 根尖呈漏斗状髓腔大管壁薄, 一旦根管内牙髓存在炎症, 就要行药物治疗让根尖组织恢复活力, 进一步发育成熟, 促进根尖部各类细胞分化, 从而产生根尖部牙本质及能够将根尖包 [6] 裹起来的牙骨质与其他口腔生物材料相比, MTA 作为盖髓材料在根尖诱导成形术直接盖髓术活髓切断术穿孔修补术和根尖倒充填术等治 [7] 疗中表现出更高的成功率虽然 MTA 在根尖诱导领域已取得了一定的成绩, 但仍有许多问题尚未解决, 有学者发现高浓度的 MTA 对牙髓干细胞相对 mrna 表达量 DSPP Runx2 对照组 0.01 mg/ml 实验组 :P<0.05 vs 对照组图 4 Figure 4 对照组 0.01 mg/ml 实验组 0.01 mg/ml 的 MTA 对 DSPP 及 Runx2 表达的影响 Effects of 0.01 mg/ml MTA on the expression levels of DSPP and Runx2 in the SCAP 起到抑制作用本实验发现 0.01 mg/ml 的 MTA 对 SCAP 的增殖有明显促进作用, 而高于 1 mg/ml 浓度的 MTA 则均对 SCAP 的增殖产生抑制作用在临床上,MTA 在用于根尖诱导时, 多是将纯 MTA 粉剂和配套液体直接调合, 其浓度远远高于 0.01 mg/ ml, 如此高浓度的 MTA 会抑制 SCAP 的增殖, 将会减少牙根周围帮助牙根继续发育的各种干细胞的数量, 延缓根尖诱导完成的时间, 所以继续深入研

5 495 究不同浓度 MTA 对干细胞的影响, 从而尽量避免这类问题的发生是很有必要的 [8] Abe 等在人未完全发育的磨牙根尖部分离出牙乳头, 以酶消化法体外培养获得集落状生长的牙乳头细胞, 该细胞在体外经诱导可分化为成牙本质样细胞脂肪样细胞和神经元样细胞, 并且表达目前公认的成牙本质细胞表面标志物 DSPP [9] 因此 SCAP 是牙根继续发育的重要细胞, 研究对其的促进增殖和定向分化作用具有重要的意义本实验中观察到, 如果将 MTA 稀释到 0.01 mg/ml 的浓度, 与对照组相比, 可以显著促进根尖乳头干细胞向成牙本质方向分化, 表现为显著促进成牙本质细胞表面标志物 DSPP 的表达 Araújo [10] 等将浓度为 1 mg/ml 的 MTA 作用于乳头干细胞, 发现牙本质基质蛋白 1 的表达得到了显著促进, 提示低浓度的 MTA 溶液有希望被研制开发为成品药剂, 应用到临床中, 去诱导牙乳头干细胞向成牙本质方向分化, 加速根尖孔的闭合及牙根的形成, 从而加速冠折露髓或牙髓感染的年轻恒牙牙根的发育本实验观察到, 将 MTA 稀释到 0.01 mg/ml 的浓度, 与对照组相比, 可以显著上调成骨基因 Runx2 的表达, 诱导根尖乳头干细胞向成骨方 [11] 向分化与此类似,Miller 等发现 MTA 可以显著 [12] 促进乳头干细胞向成骨方向分化 Proksch 等研究结果也表明 MTA 在促进人牙槽骨母细胞的增殖和硬组织形成方面有着卓越的表现严重的根尖周炎往往伴随根尖周牙槽骨的吸收, 既然 MTA 能促进成骨基因的表达, 临床工作者可以考虑在完成根管充填前, 先向根尖局部注射适量的 MTA, 从而促进根尖已吸收牙槽骨的骨重建和骨再生, 具体注入的 MTA 最适浓度还有待基础研究的支持本实验在对人根尖牙乳头干细胞进行体外分离培养和鉴定的基础上, 应用 CCK 8 Real time PCR 等技术, 研究 MTA 作用于人根尖牙乳头细胞后, 对其增殖及分化的影响, 结果显示 :0.01 mg/ml 的 MTA 对乳头干细胞的增殖和分化有显著促进作用, 而高于 1 mg/ml 浓度的 MTA 则均对乳头干细胞的增殖产生抑制作用, 这为后续深入研究 MTA 在临床使用时的浓度提供了参考, 通过 DSPP 及 Runx2 的基因表达改变, 证实了 MTA 作为盖髓材料, 根管侧穿修补材料的巨大潜力, 但其促进作用的机理仍需进一步的研究参考文献 [1] Sonoyama W, Liu Y, Yamaza T, et al. Characterization of the api cal papilla and its residing stem cells from human immature per manent teeth: a pilot study[j]. J Endod, 2008, 34(2): [2] Mao L, Tamura Y, Kawao N, et al. Influence of diabetic state and vitamin D deficiency on bone repair in female mice[j]. Bone, 2014, 61(1): [3] 孔令姣, 王金华. BMP9 通过 ERK5 信号通路调控根尖牙乳头干细胞成骨 / 成牙本质分化 [J]. 中国医科大学学报, 2017, 46(6): [4] Hakki SS, Bozkurt SB, Hakki EE, et al. Effects of mineral trioxide aggregate on cell survival, gene expression associated with miner alized tissues, and biomineralization of cementoblasts[j]. J Endod, 2009, 35(4): [5] Morsczeck C, Schmalz G, Reichert TE, et al. Somatic stem cells for regenerative dentistry[j]. Clin Oral Investig, 2008, 12(2): [6] 王燕萍, 吴锦涛, 王子露, 等. 磷酸二氢钾对根尖牙乳头干细胞成牙及成骨向分化能力的影响 [J]. 中华口腔医学杂志, 2013, 48(1): [7] 杜希希, 李波, 袁小平. 机械牵张应力对人根尖牙乳头干细胞增殖分化的影响 [J]. 医学研究生学报, 2017, 30(10): [8] Abe S, Yamaguchi S, Watanabe A, et al. Hard tissue regeneration capacity of apical pulp derived cells (APDCs) from human tooth with immature apex[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 371 (1): [9] 何梅, 吴家媛. Wnt/β catenin 信号通路对牙根发育的影响 [J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): [10] Araújo LB, Cosme Silva L, Fernandes AP, et al. Effects of mineral trioxide aggregate, biodentinetm and calcium hydroxide on viabil ity, proliferation, migration and differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth[j]. J Appl Oral Sci, 2018, 26(3): e [11] Miller AA, Takimoto K, Wealleans J, et al. Effect of 3 bioceramic materials on stem cells of the apical papilla proliferation and dif ferentiation using a dentin disk model[j]. J Endod, 2018, 44(4): [12] Proksch S, Brossart J, Vach K, et al. Evaluation of the bioactivity of fluoride enriched mineral trioxide aggregate on osteoblasts[j]. Int Endod J, 2018 (2): ( 编辑罗燕鸿, 曾雄群 )

211 better than those in the control group, with significant difference between two groups (P < 0.05). The ocular hypertension of patients in the cont

211 better than those in the control group, with significant difference between two groups (P < 0.05). The ocular hypertension of patients in the cont 210 毛果芸香碱联合拉坦前列素治疗原发性急性闭角型青光眼的疗效观察符元党 1, 郑振优 2, 林再雄 2, 周吉良 1. 昌江黎族自治县中西医结合医院, 海南昌江 572700 2. 海南医学院附属医院眼科, 海南海口 570100 1 摘要 : 目的探讨