524 中南大学学报 ( 医学版 ) JCentSouthUniv(MedSci) 2010,35(5) htp://xbyx.xysm.net 近交系小鼠牙胚同种异体移植至口腔黏膜下成牙能力的研究李恒 1, 阙国鹰 1 2, 张磊 ( 中南大学 1. 湘雅医院口腔科 ;2. 湘雅口腔医学院, 长

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耻卒贺
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1 524 中南大学学报 ( 医学版 ) JCentSouthUniv(MedSci) 2010,35(5) 李恒 1, 阙国鹰 1 2, 张磊 ( 中南大学 1. 湘雅医院口腔科 ;2. 湘雅口腔医学院, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 观察近交系 BALB/C 小鼠牙胚移植至口腔黏膜下的成牙能力, 为组织工程化牙齿的培养寻找有利的体内环境方法 : 将出生后 4dBALB/C 小鼠的下颌第一磨牙牙胚植入 BALB/C 成年雄鼠的口腔黏膜下, 分别于植入后 1,2,3,6 周取材,HE 染色, 观察牙胚发育的形态学变化结果 : 牙胚在口腔黏膜下生长良好, 釉质和牙髓牙本质复合体继续发育, 牙本质小管结构清晰可见结论 :BALB/C 小鼠牙胚移植至 BALB/C 成年雄鼠口腔黏膜下能够进一步发育矿化, 可为组织工程化牙齿的构建提供简便合适的发育环境 [ 关键词 ] 近交系小鼠 ; 牙胚 ; 移植 ; 组织工程 DOI: /j.isn Dentificationabilityofinbredstrainmicetoothgerms homologicalytransplantedintooralsubmucosa LIHeng 1,QUEGuoying 1,ZHANGLei 2 (1.DepartmentofStomatology,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity;2.SchoolofStomatology, CentralSouthUniversity,Changsha410008,China) Abstract: Objective Toestablishasuitableenvironmentforthebioengineeredteethinvivo byobservingthedentificationabilityofbalb/cmicetoothgermshomologicalyimplantedintotheo ralsubmucosa.methods ThefirstmolartoothgermsofBALB/C mice4 daysafterbirthwere transplantedintotheoralsubmucosaofbalb/cmalemice,andthenrecycledforregularhistological observationafter1,2,3,and6weektransplantation.results Thetoothgermsintheoralsubmu cosagrewwelwithcontinuingdevelopingenamelum andpulpodentinalcomplex,andthedentinaltu buleswereclear.conclusion TheenvironmentoftheBALB/Cmalemiceoralsubmucosaisfavora bleforthegrowthoftoothgermsininbredstrainbalb/cmice,anditcanprovideanewenviron mentforthedevelopmentofbioengineeredteethinvivo. Keywords: inbredstrainmice; toothgerm; transplant; tisueengineering 牙的发育是一个长期复杂的生物学过程, 包括上皮间充质相互作用细胞分化形态发生组织矿化和牙萌出 [1], 此过程受极其复杂的精细的信号分子调控, 在牙齿发育的早期, 由于鼠收稿日期 (Dateofreception) 作者简介 (Biography) 李恒, 硕士研究生, 主要从事牙齿组织工程的研究通信作者 (Correspondingauthor) 阙国鹰,E mail:queguoying00@yahoo.com.cn 基金项目 (Foundationitem) 中南大学大学生创新性试验计划 (YA07053) SchemeofCentralSouthUniversity(YA07053). ThisworkwassupportedbyStudents InnovativePilot

2 李恒, 等 525 牙与人牙在组织发生生理变化和功能上有很大相似性而成为牙齿发育研究的良好模型 [2] 以往研究较多的是鼠肾被膜下牙胚移植培养, 发现移植后的牙胚可以进一步发育, 形成组织工程化牙齿样结构, 再现牙齿形成中的细胞分化形态发生等生理过程, 而缺点是缺少牙根的发育另外曾有学者将大鼠牙胚植入同种异体大鼠的口腔右上颌切牙和第一磨牙间黏膜下, 但是回收失败, 可能是因为口腔内咀嚼运动导致移植物丢失 [3] 本试验以近交系小鼠为研究对象, 进行牙胚同种异体口腔黏膜下移植, 并连续观察其发育情况, 为组织工程化牙齿的构建寻找有利的体内环境 1 材料与方法 1.1 实验动物出生后 4d(4dayspostnatal,4dpn) 的 BALB/ C 小鼠 5 只 ( 体质量约 4 g/ 只 ) 和 6 周龄的 BALB/C 成年雄鼠 8 只 ( 体质量约 30g/ 只 ), 由中南大学实验动物中心提供 1.2 牙胚的获取及分组取 5 只 4dpnBALB/C 小鼠, 断颈处死, 浸人 75% 的乙醇中消毒 10min, 超净工作台内剪下小鼠头颅后, 用 0.01mol/LPBS 液反复漂洗, 体视显微镜下分离小鼠下颌骨, 探针挑破牙胚上方的黏膜, 用挖匙分离下颌第一磨牙牙胚, 分离的组织块大小约 1.0mm 1.5mm 1.5mm, 体视显微镜下可见所取牙胚由灰白色牙体硬组织和软组织构成, 硬组织表面似有尖窝结构, 将其放于 DMEM 培养液 ( 内含 10% 胎牛血清 50U/mL 青霉素 50μg/mL 链霉素 ) 中, 置 37,5% CO 2 温箱中备用共获得 10 个牙胚, 随机取其中 2 个放于 10% 中性甲醛中固定, 作为对照组, 其余 8 个用于下一步牙胚移植, 作为口腔黏膜下组 1.3 牙胚的移植成年 BALB/C 雄鼠以腹腔注射 10% 水合氯醛 (3mL/kg) 麻醉后, 仰卧位固定, 常规外科消毒选取成年雄鼠两下颌切牙间偏右侧的前庭沟黏膜为移植部位, 用手术刀沿矢状方向切开黏膜表层约 2mm, 血管钳向切口两边潜行分离, 未见明显出血, 生理盐水冲洗 3 次, 随机选取牙胚植入后间断缝合每只雄鼠植入 1 个牙胚, 共移植 8 只雄鼠, 移植后 5d 内进软食 1.4 移植物回收观察分别于术后第 1,2,3,6 周取材, 将雄鼠断颈处死, 用手术器械将移植物完整取出, 每次每组取 2 个, 将回收的移植物固定于 10% 中性甲醛中, 与步骤 1.2 中 2 个 4dpn 牙胚一起,2% 硝酸脱钙, 梯度酒精脱水, 常规石蜡包埋, 制作 4~ 5μm 连续切片,HE 染色, 中性树胶封片, 光镜观察牙胚发育情况 2 结果所有宿主动物术后均存活良好, 成功取材后脱钙, 制作连续切片, 回收的牙胚组织学观察结果如下 :(1) 对照组肉眼观察 : 牙胚为小米粒大小 ( 约 1.0 mm 1.5 mm 1.5 mm 灰白色组织 ), 质地较软镜下观察 : 牙胚处于钟状期晚期, 牙体硬组织开始形成, 釉质牙本质成釉细胞及成牙本质细胞等结构清楚, 成釉细胞和成牙本质细胞处于极化和分泌状态, 牙根尚未开始发育, 上皮隔仍处于延伸阶段 ( 图 1) (2) 口腔黏膜下组第 1 周, 肉眼观察 : 植入物无移位或脱落, 形态大小较正常牙齿小, 部分表面类似釉质样外观 ; 镜下观察 : 移植物继续发育, 可见牙髓牙本质结构, 牙本质厚度较对照组牙本质厚度增加, 成牙本质细胞及成釉细胞分化良好, 移植物周边可见骨样组织和淋巴细胞浸润 ( 图 2) 第 2 周, 肉眼观察 : 植入物无移位或脱落, 形态大小较正常牙齿小, 表面似釉质样外观部分的比例较第 1 周增加 ; 镜下观察 : 牙冠进一步发育, 牙髓牙本质复合体结构清楚, 可见成牙本质细胞, 牙本质较第 1 周的厚度增加, 移植物周边炎性浸润较第 1 周减轻, 出现了破骨吸收 ( 图 3) 第 3 周, 肉眼观察 : 植入物无移位或脱落, 形态大小较正常牙齿小, 表面似釉质样外观部分的比例较第 2 周增加 ; 镜下观察 : 牙冠进一步发育, 釉质及牙髓牙本质复合体结构存在, 成牙本质细胞排列整齐, 牙本质较第 2 周的厚度稍有增加, 移植物周边有炎性浸润和骨组织形成, 切片中未观察到破骨吸收现象 ( 图 4) 第 6 周, 肉眼观察 : 植入物无移位或脱落, 形态大小接近正常牙齿, 表面似釉质样外观部分的比例较前增加 ; 镜下观察 : 牙冠继续发育, 形态接近正常牙冠, 牙本质厚度较第 3 周增加, 牙髓内有纤维组织及血管长入, 炎性浸润较第 3 周有所减少, 但破骨吸收程度较第 2 周加重, 牙冠周围纤维及骨组织包裹 ( 图 5)

526 中南大学学报 ( 医学版 ),2010,35(5) 图 1 正常 4dpn 牙胚 A: 出生后 4d 的乳鼠牙胚处于钟状期晚期, 有少量牙体硬组织形成 ( 箭头标示, 40);B: 上皮隔处于延伸阶段 ( 400) Fig.1 Normaltoothof4dpn.

图 2 口腔黏膜下移植 1 周后 A: 40;B: 400 可见牙髓前期牙本质牙本质釉质等结构, 牙本质小管结构清晰, 移植物周边有骨样组织及炎性浸润 (D 示牙本质,E 示牙釉质,P 示牙髓 ) Fig.2 Oralmucosa1weekaftertransplantation.

Pulp,pre dentin,dentin,andenamelstructurecanbe seen,withcleardentintubulestructureandgraftbone liketisuesuroundingandinflammatoryinfiltration(dshowsdentin,

3 526 中南大学学报 ( 医学版 ),2010,35(5) 图 1 正常 4dpn 牙胚 A: 出生后 4d 的乳鼠牙胚处于钟状期晚期, 有少量牙体硬组织形成 ( 箭头标示, 40);B: 上皮隔处于延伸阶段 ( 400) Fig.1 Normaltoothof4dpn.A:Belstageofthetoothoffourdaysrats,showingsomedentalhardtisue(arowmark, 40);B: Epithelialcompartmentintheextendedphase( 400). 图 2 口腔黏膜下移植 1 周后 A: 40;B: 400 可见牙髓前期牙本质牙本质釉质等结构, 牙本质小管结构清晰, 移植物周边有骨样组织及炎性浸润 (D 示牙本质,E 示牙釉质,P 示牙髓 ) Fig.2 Oralmucosa1weekaftertransplantation.A: 40;B: 400.Pulp,pre dentin,dentin,andenamelstructurecanbe seen,withcleardentintubulestructureandgraftbone liketisuesuroundingandinflammatoryinfiltration(dshowsdentin, Eshowsenamel,andPshowspulp). 图 3 口腔黏膜下移植 2 周后 A: 40;B: 400 可见牙髓牙本质等结构, 牙髓内部有凝血样物质, 牙本质周边有破骨吸收现象出现 ( 箭头处 )(D 示牙本质,P 示牙髓 ) Fig.3 Oralmucosa2weeksaftertransplantation.A: 40;B: 400.Dentalpulpanddentinstructurecanbeseen,withthe bloodcoagulation likesubstancewithinthepulpanddentinsuroundedbybrokenboneresorptionphenomenon(arowmark) (DshowsdentinandPshowspulp).

Dentalpulp,pre dentin,dentin,enamellevel,andstruc tureofdentinaltubulescanbeseenclear,peripheralinflammatoryinfiltratingandboneformating(dshowsdentin,eshows enamel,andpshowspulp).

4 李恒, 等 527 图 4 口腔黏膜下移植 3 周后 A: 40;B: 400 牙髓前期牙本质牙本质釉质层次清楚, 牙本质小管结构清晰, 周边炎性浸润及骨组织形成 (D 示牙本质,E 示牙釉质,P 示牙髓 ) Fig.4 Oralmucosa3weeksaftertransplantation.A: 40;B: 400.Dentalpulp,pre dentin,dentin,enamellevel,andstruc tureofdentinaltubulescanbeseenclear,peripheralinflammatoryinfiltratingandboneformating(dshowsdentin,eshows enamel,andpshowspulp). 图 5 口腔黏膜下移植 6 周后 A: 40;B: 400 可见牙髓牙本质等结构, 牙冠形状类似正常牙冠, 破骨吸收现象明显 ( 箭头处 )(D 示牙本质 P 示牙髓 ) Fig.5 Oralmucosa6weeksaftertransplantation.A: 40;B: 400.Dentalpulpanddentinstructurecanbeseen,crownshape issimilartothenormalcrown,brokenbonemarkedresorption(arowmark)(dshowsdentinandpshowspulp). 3 讨论国内外学者以鼠牙胚的移植培养为手段, 对组织工程牙齿培养的有利体内环境进行了大量研究, 取得了丰富的经验, 目前鼠牙胚移植培养的环境分为两种 : 一种是体外培养环境, 如鸡胚特制的培养基等 [4 6], 可以满足牙胚短期发育的需求另一种是体内培养环境, 如肾被膜下肠系膜内皮下等 [6 8], 其中以肾被膜下培养环境为最有利于牙胚发育的环境, 由于体内外环境存在差异, 体内移植是必需的一个环节, 因此多数的研究集中在鼠牙胚的体内移植培养, 但既往研究中有效的体内培养模型存在创伤大不利于临床研究的缺点, 本试验尝试以口腔作为实验环境, 选择黏膜下为移植部位, 利用近交系小鼠移植排斥反应较轻的特点, 采用操作简便且损伤低的手术方法, 有利于本实验的成功本研究结果显示近交系 BALB/C 小鼠牙胚移植入同种异体成年 BALB/C 雄鼠口腔黏膜下, 可以进一步发育 4dpn 的 BALB/C 小鼠牙胚处于钟状晚期, 在上皮与间充质的相互诱导下, 成釉细胞与成牙本质细胞分化完成, 并开始分泌牙釉质和牙本质, 此时的牙体硬组织尚未钙化完全, 植入口腔黏膜下 1 周后, 牙体硬组织分泌增加, 并逐渐钙化, 第 2 周至第 6 周牙冠逐渐发育, 呈现了牙齿发育过程中的形态发生组织矿化等过程本实验第 3 周移植物发育程度与以往肾被膜下 3 周移植物发育程度相近, 但牙胚的肾被膜下移植创伤大手术难度高, 不适合大样本研究, 而本实验移植部位表浅, 血运丰富, 操作简单, 便

5 528 中南大学学报 ( 医学版 ),2010,35(5) 于观察和取材, 比较适合于大样本研究对于牙胚器官体内移植的连续观察,Mezadri [9] 等将出生后 1d 的 Wistar 大鼠的上颌第一磨牙牙胚同种异体移植到成年大鼠双耳背部皮下, 发现移植后前 2 周牙胚发育正常, 第 2 周开始产生炎症反应, 出现破骨样细胞, 第 6 周移植物里仅有少量骨样牙本质残留而本实验中, 第 6 周移植物中仍可见较为完整的牙冠样物质, 这可能是因为本实验选择近交系小鼠, 为纯系动物, 基因型基本相同, 移植排斥反应低目前关于牙根发育机制的了解比较少, 涉及 [10 11] 内容众多, 有研究认为 : 牙根的发育决定于上皮源性的颈环干细胞龛和间充质源性的牙囊牙乳头干细胞龛之间的有序协调, 如果某个环节出现异常, 并且无其他代偿因素, 则可导致牙根发育不良本实验中, 牙根不能正常发育的原因, 一方面可能是因在非生理条件下, 牙胚缺少向冠方的萌出移动, 无法为牙根的继续发育提供空隙 [1] [12] 另一方面, 刘晓辉等将出生后 6d 的 20 个牙胚移植至肾被膜下, 有 4 个移植物的牙根类似正常牙齿的牙根, 提示出生后 6 天时牙根部牙本质的发育信号可能已确定, 而本实验使用的是出生后 4d 的牙胚, 牙根不能发育的另一个原因可能是由于移植造成牙胚颈环附近正常生理环境的破坏, 各种干细胞龛之间失去协调, 导致牙根发育的信号不能正常转导, 从而引起牙根的发育障碍本实验表明,BALB/C 小鼠牙胚移植至 BALB/C 成年雄鼠口腔黏膜下是可行的, 牙胚能够进一步发育矿化, 可为组织工程化牙齿的构建提供简便合适的发育环境参考文献 : [1] ZhangYD,ChenZH,SongYQ,etal.Makingatooth: growthfactors,transcriptionfactors,andstem cel[j].cel Res,2005,15(5): [2] 于金华, 金岩, 史俊南, 等. 大鼠牙胚同种异体异位移植的组织学观察 [J]. 临床口腔医学杂志,2005,21 (5): YU Jinhua,JIN Yan,SHIJunnan,etal.Thehistological studyofrattoothgermsofheterotopicalotransplantation[j]. ClinStomatol,2005,21(5): [3] 于世凤, 汪说之, 高岩, 等. 口腔组织病理学 [M]. 北京 : 人民卫生出版社,2003:23. YU Shifeng,WANG Shuizhi,GAO Yan,etal.OralHisto pathology[m ].Beijing: People s Medical Publishing House,2003:23. [4] 闫征斌, 田卫东, 刘磊, 等. 小鼠牙胚的鸡胚培养模型的建立 [J]. 华西口腔医学杂志,2004,22(3): YAN Zhengbin,TIAN Weidong,LIU Lei,etal. Establish mentofaculturesystem ofchickembryoformousetooth Germ Development[J].WestChinaJournalofStomatology, 2004,22(3): [5] 韩曙光, 张安波, 陈晖, 等. 人牙胚体外 16d 培养模型的建立 [J]. 口腔医学,2008,28(8): HAN Shuguang,ZHANG Anbo,CHEN Hui,etal.Establish mentofhuman tooth germ culture modelforlongerterm (16days) in vitro[j]. Stomatologv, 2008,28(8): [6] 谢瑞阅, 杨丕山, 李纾. 小鼠牙胚裸鼠体内移植的形态学观察 [J]. 上海口腔医学,2006,15(4): XIERuiyue,YANGPishan,LIShu.Ahistologicalinnovative studyofbalb/cmousetoothgerm transplantedtonudemouse invivo[j]. ShanghaiJournalofStomatology,2006,15 (4): [7] 于金华, 金岩, 史俊南, 等. 大鼠牙胚同种异体异位移植的组织学观察 [J]. 临床口腔医学杂志,2005,21 (5): YU Jinhua,JinYah,SHIJunnan,etal.Thehistological studyofrattoothgermsofheterotopicalotransplantation[j]. ClinStomatol,2005,21(5): [8] DuailibiSE,DuailibiM T,ZhangW,etal.Bioengineered dentaltisues grown in the ratjaw[j]. J DentRes, 2008,87(8): [9] MezadriTJ,Rivero TamesD,BoabaidF,etal.Develop mentoftoothgerm heterotopicalygraftedwithintheearskin. Anhistologicalstudyin therat[j]. Med Oral,2004,9 (3): [10] TummersM, TheslefI. Rootorcrown:a developmental choiceorchestratedbythediferentialregulationoftheepithe lialstem celnicheinthetoothoftworodentspecies[j]. Development,2003,130(6): [11] ApajalahtiS,HoltaP,TurtolaL.Prevalenceofshort root anomalyinhealthyyoungadults[j].actaodontolscand, 2002,60(1): [12] 刘晓辉, 文玲英, 苑芳, 等. 大鼠完整牙胚肾被膜下种植实验研究 [J]. 临床口腔医学杂志,2006,22(7): LIU Xiaohui,WEN Lingying,YUAN Fang,etal.Studyon implantingrattoothgermsinrenalcapsule[j].clinstoma tol,2006,22(7): ( 本文编辑彭敏宁 )

牙的发育

第二章牙的发育 Chapter 2 Development of Teeth Designed and produced by Dr. Wang Li 1 概述牙及其支持组织是从上下颌突和额鼻突的外胚层及外胚间叶细胞发育而来牙齿发育是一长期复杂的生物学过程牙齿发育是一个连续的过程, 包括牙胚的发生牙体组织形成和牙齿的萌出 Designed and produced by Dr. Wang

524 中南大学学报 ( 医学版 ) JCentSouthUniv(MedSci) 2010,35(5) htp://xbyx.xysm.net 近交系小鼠牙胚同种异体移植至口腔黏膜下成牙能力的研究 李恒 1, 阙国鹰 1 2, 张磊 ( 中南大学 1. 湘雅医院口腔科 ;2. 湘雅口腔医学院, 长

524 中南大学学报 ( 医学版 ) JCentSouthUniv(MedSci) 2010,35(5) htp://xbyx.xysm.net 近交系小鼠牙胚同种异体移植至口腔黏膜下成牙能力的研究李恒 1, 阙国鹰 1 2, 张磊 ( 中南大学 1. 湘雅医院口腔科 ;2. 湘雅口腔医学院, 长