小麦显性矮秆基因复等位多态特性研究

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1 中国农业科学 2011,44(8): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响王洪荣, 陈旭伟, 王梦芝 ( 扬州大学动物科学与技术学院, 江苏扬州 ) 摘要 : 目的研究利用茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵和瘤胃内纤维降解菌变化的影响方法采用 2 4 因子体外培养试验设计, 因子一为对照组 ( 不添加皂苷 ) 和添加皂苷组 ( 添加 0.3% 茶皂素和 0.03% 丝兰皂苷的混合物 ), 因子二为不同精粗比水平 (20:80 40:60 50:50 及 60:40), 研究不同精粗比以及皂苷条件下对瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响结果茶皂素和丝兰皂苷的混合物能降低瘤胃 ph, 且精粗比为 20:80 时差异极显著 (P<0.01); 能够增加乙酸丙酸丁酸以及 TVFA 的浓度, 但从各成分所占比例来看, 茶皂素和丝兰皂苷混合物的添加降低了乙酸和丁酸的摩尔百分比例, 增加了丙酸的摩尔百分比例, 因此降低了乙酸 / 丙酸 ; 能够降低原虫真蛋白产量而细菌真蛋白产量提高, 细菌与原虫的比值提高且差异极显著 (P<0.01) 同一精粗比条件下, 添加皂苷组产琥珀酸拟杆菌的相对数量均比非添加组高, 除精粗比为 20:80 时差异不显著外 (P>0.05), 其它精粗比状态下差异极显著 (P<0.01); 除精粗比为 40:60 时外, 其它精粗比状态下添加皂苷组白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌的相对数量均比非添加组高结论添加皂苷有降低瘤胃液中原虫总数和 ph 的趋势, 并能够降低原虫真蛋白产量而提高细菌真蛋白产量茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵模式和瘤胃内纤维降解菌变化有一定影响, 其作用效果受培养底物精粗比的显著影响关键词 : 茶皂素 ; 丝兰皂苷 ; 瘤胃发酵 ; 瘤胃微生物 Effect of Yucca schidigera Saponin and Tea Saponin Mixture on the Rumen Fermentation and Its Fibrolytic Bacterial Activity in the Rusitec Substrates with Different Concentrate to Forage Ratio WANG Hong-rong, CHEN Xu-wei, WANG Meng-zhi (College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou , Jiangsu) Abstract: Objective An experiment was designed to explore the effect of Yucca schidigera saponin and tea saponin mixture and different concentrate/forage ratios In vitro on rumen fermentation and rumen fiberolytic bacterial activity. Method A 2 4 two factorial design of experiment was adopted: one factor was adding or without saponins (0.3% tea saponin and 0.03% Yucca schidigera extract), the other was four different concentrate/forage ratios (20:80, 40:60, 50:50, and 60:40). Result The results showed that the mixed saponins reduced ph and the group whose concentrate/forage ratio was 20:80 had significant effect (P< 0.05). Concentrations of acetate, propionate, butyrate and total VFAs were increased by addition of the mixed saponins, however, from the molar ratio of VFAs it was found that the proportion of propionate and butyrate were decreased while the proportion of propionate was increased, so the acetate/propionate ratio descended. The mixed saponins increased ruminal bacterial protein yield whereas the yield of ruminal protozoal protein was decreased, and the ratio of bacterial protein/ protozoal protein was significantly increased (P<0.05) compared with the control group. The relative amount of Fibrobacter succinogenes was extremely higher by addition of the mixed saponins whose concentrate/forage ratio was not 20:80. And the mixed saponins increased the relative amount of Ruminococcus flavefaciens and Ruminococcus albus except that the concentrate/forage ratio was 40:60. Conclusion 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ) 联系方式 : 王洪荣, hrwang@yzu.edu.cn

2 8 期王洪荣等 : 茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响 1711 Results indicate that this mixed saponins have effects on microbial fermentation and fibroliytic bacteria activities, and that the effects depend on the ratio of concentrate to rughage in the substrate. Key words: Yucca schidigera saponin; tea saponin; rumen fermentation; fibrolytic bacterial activity 0 引言研究意义瘤胃在反刍动物营养与生理功能中发挥重要作用多年来, 动物营养与饲料学界一直在探索瘤胃调控的有效方法随着抗生素类添加剂应用受到各国政策法规的限制, 绿色无污染饲料添加剂的开发逐渐成为研究热点皂苷中, 丝兰皂苷和茶皂素在反刍动物饲料中应用较多它们具有抗菌促生长提高免疫力和抗氧化等功能, 在瘤胃调控方面表现出了巨大潜力前人研究进展不同来源皂苷的化学结构特性和作用效果有一定差异目前, 中国对茶皂素的化学组成和结构理化性质及分离方法等进行 [1-2] 了比较深入的研究叶均安等研究发现, 茶皂素有抑制瘤胃原虫生长和改善瘤胃发酵的作用, 但是在体外发酵培养时, 还没有找到茶皂素最佳的添加浓度丝兰皂苷是最早应用于动物饲料的皂苷类之一, 它是丝兰属植物提取物 (yucca schidigera extract, 为 YSE 或 YE) 的主要成分目前国际上对丝兰皂苷的研究较 [3] 多 Alexander 等发现在体外瘤胃发酵试验中, 经 24 h 培养后发现, 原生动物的数量减少 63%, 氨水平降低 30% Valdez [4] 在体外培养基中添加和 77 mg L -1 的丝兰皂苷, 增加了瘤胃细菌总数, 提高了基质中酸性洗涤纤维的消化率, 减少了原虫总数李 [5] 国祥等在体外培养中, 添加不同水平的丝兰提取物 (A:0 mg g -1 B:2 mg g -1 C:4 mg g -1 D:6 mg g -1 及 E:8 mg g -1 ) 研究对瘤胃微生物组成及甲烷产量的影响试验表明, 随着丝兰提取物添加水平的增加, 培养液的 NH 3 -N 浓度甲烷产量原虫数目及产气量均呈下降趋势 Girard [6] 研究发现添加丝兰提取物可改变瘤胃乙酸丙酸浓度, 使乙酸浓度下降 (P<0.05), 丙酸浓度上升 (P<0.05) 可见, 丝兰提取物具有强烈的抗原虫类微生物活力的能力, 可降低原虫数量, 从而有利于提高瘤胃内氮的利用效率, 增加微生物蛋白流向小肠的数量本研究切入点迄今为止, 对这两种皂苷在反刍动物瘤胃中的综合作用效果及其受日粮类型影响的研究甚少本研究在前期研究丝兰皂苷和茶皂素单一作用的基础上, 进一步研究茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵的影响, 采用体外培养和分子生物学技术相结合的研究方法, 探讨其对瘤胃发酵和纤维降解菌变化的分子机制拟解决的关键问题研究茶皂素和丝兰皂苷混合物在不同精粗比日粮条件下对瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响, 为通过皂苷调控瘤胃发酵和提高反刍动物对日粮纤维的利用效率提供调控方法和理论依据 1 材料与方法 1.1 试验动物选用 4 只健康年龄和体重相近的徐淮山羊羯羊, 统一驱虫, 单圈饲养, 每日按其体重的 2% 饲喂干物质量, 每日 8:00 和 20:00 两次等量饲喂, 自由饮水按常规手术方法安装永久性瘤胃瘘管, 用于采集瘤胃液 1.2 试验日粮与饲养管理粗料为铡短的 (3 cm) 羊草, 精料为玉米豆粕 ( 表 1) 按精粗比分别为 20:80 40:60 50:50 及 60:40 配制日粮试验羊单舍饲喂, 每日 8:00 和 20:00 等量饲喂, 自由饮水表 1 日粮组成和营养水平 Table 1 Composition and nutrient level of basal diet 项目 Items 精粗比 Concentrate to roughage ratio 20:80 40:60 50:50 60:40 日粮组成 Ingredients 玉米 Corn (%) 豆粕 Soybean meal (%) 羊草 Hay (%) 营养成分 nutrient level (%) 干物质 DM 粗蛋白质 CP 代谢能 ME (MJ kg -1 ) 试验设计体外培养按 2 4 因子试验设计 ( 表 2), 因子一分为添加茶皂素和丝兰皂苷的混合物和不添加 2 个水平, 因子二分 4 个精粗比水平 (20:80 40:60 50 : 50 及 60:40) 在不同精粗比水平下添加茶皂素和丝兰皂苷的混合物的 4 个处理组分别设为 a b c 及 d ( 其添加量均为 0.3% 茶皂素和 0.03% 丝兰皂苷 ); 在

3 1712 中国农业科学 44 卷表因子试验设计 Table factor trial design 精粗比 Concentrate to roughage ratio 20:80 40:60 50:50 60:40 不添加组 Control groups (without saponins) A B C D 添加茶皂素和丝兰皂苷混合物组 (0.3% 茶皂素 % 丝兰皂苷 ) Adding saponins groups (0.3% tea saponin % Yucca schidigera extract) a b c d 不同精粗比水平下 4 个对照组分别设为 A B C 及 D ( 表 1) 供试茶皂素购于浙江东方茶业科技有限公司, 其纯度为 53%; 丝兰皂苷购于西安天一生物技术有限公司, 其纯度为 60% 然后分别在体外发酵培养系统和体外产气系统中培养并进行相关指标的测定 1.4 体外培养系统发酵装置由恒温振荡水浴锅和 150 ml 三孔 ( 进气口出气口及采样通道 ) 带有橡皮塞的三角烧瓶组成三角烧瓶用橡皮塞塞好后, 调节气体流量, 使其在 39 温度条件下培养 1.5 试验方法瘤胃液的采集利用自制真空负压装置, 通过瘤胃瘘管从 4 头山羊瘤胃内采取瘤胃液各 250 ml( 晨饲前 ), 经过 4 层纱布过滤后, 其滤液装于事先通有 CO 2 的灭菌生理盐水瓶中, 混合均匀,39 水浴保温体外产气试验 : 取 4 种日粮的 200 mg 底物 20 ml 人工唾液培养液及 10 ml 瘤胃液先后加入具塞注射器内腔, 然后用凡士林润滑培养器内塞外壁, 以消除培养器内腔和内塞之间的摩擦, 排出培养器中的气泡, 密封, 记录初始刻度后, 将其置于 39 水浴震荡培养在及 48 h 时分别读取产气量数值, 并当注射器内的气体量达 50 ml 时放掉气体设置一个无底物的空白对照体外培养按照试验设计称取不同日粮的底物 1.2 g, 于不同标号的三角瓶中紫外灭菌 30 min, 用注射器分别加入人工唾液 80 ml( 事先通 CO 2 至饱和, 于 39 水浴 30 min), 再分别加入混合瘤胃液 40 ml, 塞好橡皮塞, 通过进气通道通入混合气体至饱和,39 恒温水浴增设一个空白对照, 即瘤胃液与人工唾液的混合液在培养和 24 h 时各取瘤胃液 1 ml 用于原虫计数样品的采集分别在培养后及 24 h 取样, 每次取 6 ml, 分装于 2 只 5 ml 的离心管中, 立即测定 ph, 然后于 -20 冷冻保存, 用于挥发性脂肪酸 (VFA) 浓度的测定培养结束后, 取 10 ml 瘤胃液分装于两个离心管中, 用于分离微生物以测定其它指标剩余 -20 冷冻保存微生物的分离 (1) 原虫 : 取瘤胃液加等体积生理盐水 39 水浴震荡 (125 r/min) 培养 60 min, 并辅以搅拌 ; 再经 4 层纱布过滤, 滤液离心 (150 r/min 10 min), 收集沉淀即为原虫用生理盐水将其洗涤两次后悬浮, -20 贮存待测 (2) 细菌 : 收集 ⑴ 离心后上清, 再高速离心 ( r/min 15 min), 收集沉淀为细菌, 其余处理同 ⑴ 测定指标及测定方法 (1) 瘤胃液 ph:phs-3c 型 ph 计于采样后立即测定 (2) 瘤胃液 VFA 浓度 : 日本岛津 GC-9A 气相色谱仪测定测定条件 : 毛细管柱 CP-WAX( 长 30 m, 内径 0.53 mm, 膜厚 1 μm); 气化室温度 200,FID 检测器温度 200 ; 柱温采用程序升温法, 初温 100, 末温 150, 升温速率 3 /min, 灵敏度为 10 1, 衰减为 2 5, 以巴豆酸为内标物瘤胃液处理 : 瘤胃液经 r/min 离心 10 min 后取上清液 1 ml, 加 0.2 ml 20% 的偏磷酸 ( 含 60 mmol L -1 巴豆酸 ), 混匀后高速离心, 然后取上清液 0.4 μl 进样分析 (3) 微生物真蛋白含量的测定和计算取分离微生物样品经 r/min, 离心 10 min, 弃上清液加入 5 ml 10 % 三氯乙酸 (TCA), 混匀后置室温 30 min, 离心 (6 000 r/min 10 min), 弃上清液再加入 5 ml 5% NaOH 混匀溶解后, 离心 (6 000 r/min 10 min), 取上清液用 756 型紫外光分光度计测定 OD 280 和 OD 260 值 Pr(mg ml -1 )=(1.45 OD OD 260 ) 稀释倍数 (4) 瘤胃纤维降解菌的测定 PCR 反应 : 以瘤胃混合微生物总 DNA 为模板,

4 8 期王洪荣等 : 茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响 1713 分别设计产琥珀酸拟杆菌 (Fibrobucter succinogenes) 白色瘤胃球菌 (Ruminococcus albus) 和黄化瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens) 的扩增引物 [7] ( 表 3), PCR 扩增按照表 4 所示的反应条件进行 PCR 扩增取扩增产物 10 μl,1.2% 琼脂糖凝胶电泳拍照 1.6 数据处理 Excel 软件整理数据,SPSS13.0 软件 Univariate 法进行统计分析, 各平均数之间用 LSD 法进行多重比较表 3 扩增引物的设计 Table 3 Designed primer of PCR 细菌 Bacteria 引物 Primer 产琥珀酸拟杆菌 5'-GGT ATG GGA TGA GCT TGC-3' Fibrobucter succinogenes 5'-GCC TGC CCC TGA ACT ATC-3' 白色瘤胃球菌 5'-CCC TAA AAG CAG TCT TAG TTC G-3' Ruminococcus albus 5'-CCT CCT TGC GGT TAG AAC A-3' 黄化瘤胃球菌 5'-TCT GGA AAC GGA TGG TA-3' Ruminococcus flavefaciens 5'-CCT TTA AGA CAG GAG TTT ACA A-3' 表 4 PCR 扩增反应条件 Table 4 Conditions of PCR reaction 细菌 Bacteria 变性条件 Denaturing condition 退火条件 Anncealing condition 延伸条件 Extending condition 循环数 Cycling times 产琥珀酸拟杆菌 Fibrobucter succinogenes 白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus 黄化瘤胃球菌 Ruminococcus flavefaciens 94 4 min s 94 9 min s 94 9 min s s 72 1 min 72 7 min s s min s s min 结果 2.1 添加皂苷和日粮精粗比对培养液 ph 的影响不同底物条件下, 各组培养液 ph 随培养时间的变化 ( 图 1), 同一精粗比条件下, 添加皂苷组的 ph 除了精粗比为 50:50 外均低于对照组, 但是只有在精各组数字小写字母不同者差异显著 (P<0.05), 大写字母不同者差异极显著 (P<0.01) 下同 Means with the different small letters are different significantly (P<0.05); means with the different capital letters are different significantly (P<0.01). The same as below 图 1 添加皂苷下精粗比对培养液 ph 的影响 Fig. 1 Effect of adding mixed saponin on ph in incubation 粗比为 20:80 时差异极显著 (P<0.01), 其它精粗比时差异不显著, 并且是否添加皂苷与精粗比之间没有互作效应同一皂苷处理状态下, 不添加皂苷组的 ph 随精粗比的增加而下降, 并且 A 组与 D 组差异显著 (P<0.05), 其它组之间差异不显著 ; 添加皂苷组的 ph 随精粗比的增加呈现钟形变化,c 组高于其它组, 并且与 d 组差异显著 (P<0.05) 2.2 添加皂苷和日粮精粗比对培养液挥发性脂肪酸的影响各组培养液内挥发性脂肪酸平均值的变化见表 5 没有添加皂苷的 4 组中, 除精粗比为 40:60(B 组 ) 外, 其它组的乙酸摩尔浓度随精粗比的升高呈下降趋势, 精粗比为 40:60(B 组 ) 与 50:50(C 组 ) 60:40(D 组 ) 差异显著和极显著 (P<0.01); 添加皂苷的 4 组中, 精粗比为 20:80(a 组 ) 40:60(b 组 ) 与 60:40(d 组 ) 差异显著 (P<0.05) 丙酸摩尔浓度随精粗比的升高有上升的趋势, 其中只有添加皂苷的 a 组 (20:80) 和 d 组 (60:40) 差异显著 (P <0.05) 丁酸摩尔浓度随精粗比的变化没有乙酸和丙酸有规律, 但随精粗比的升高大致表现为先上升后下降的趋势, 各组之间差异不显著没有添加皂苷的 4 组 TVFA 浓度变化趋势为随精粗比的升高先上升后下降,B 组 (40:60) 最高, 随后依次为 A 组 (20: 80) C 组 (50:50) D 组 (60:40), 但 4 组之间无显著差异 ; 添加皂苷的 4 组 TVFA 浓度随精粗比

5 1714 中国农业科学 44 卷的升高而降低,4 组之间也无显著差异 (P<0.05) 乙酸 / 丙酸的变化趋势和 TVFA 的变化趋势类似, 但总体表现为随精粗比的上升而下降挥发性脂肪酸各组分所占比例的变化见表 5 同一皂苷处理水平下, 各组分所占比例总体随精粗比的升高表现出有规律的变化, 但其中也存在一定的波动乙酸的摩尔百分比随精粗比的升高总体呈现下降趋势, 但 B 组高于 A 组其中不添加皂苷的 4 组,D 组与 A 组 B 组差异显著极显著 ; 添加皂苷的 4 组中, a 组与其它 3 组有显著或极显著差异,b 组与 d 组有极显著差异丙酸的摩尔百分比随精粗比的升高总体呈现上升趋势, 但 B 组低于 A 组, 不添加皂苷的 4 组中 D 组与其它 3 组之间有显著或极显著差异 (P<0.01); 添加皂苷的 4 组中 a 组与其它 3 组之间有显著或极显著差异, 而 d 组与其它 3 组之间有极显著差异 (P< 0.01) 丁酸的摩尔百分比随精粗比的升高总体呈现升高趋势, 不添加皂苷的 4 组之间无显著差异, 而添加皂苷的 4 组中 a 与 c d 组之间均有显著差异从同一精粗比水平来看, 乙酸和丁酸的摩尔百分比添加皂苷组比不添加组 ( 对照组 ) 低, 而丙酸的摩尔百分比添加皂苷组比对照组高乙酸 / 丙酸精粗比为 20:80 时添加皂苷组比不添加组高, 其它精粗比情况下添加皂苷组比不添加组低, 但只有精粗比在 40:60 时存在极显著差异 (P<0.01) 2.3 添加皂苷和日粮精粗比对微生物蛋白产量的影响从表 6 可知,4 种精粗比水平下, 添加皂苷组的原虫总数比对照组有不同程度的下降, 其中, 以精粗比 20:80 和 40:60 组差异极显著 (P<0.01); 在培养 24 h 的原虫蛋白产量比非添加组分别下降了和 mg ml -1, 当精粗比为 20:80 和 40:60 时差异极显著 (P<0.01), 其它水平下无显著差异 ; 同时细菌蛋白产量添加皂苷组与非添加组相比分别提高了和 mg ml -1, 其中精粗比为 20:80 和 60:40 时差异极显著 (P< 0.01), 精粗比为 40:60 时差异显著, 其它水平下差异不显著从表 6 和图 2 可以看出,4 种精粗比条件下, 添加皂苷组的细菌 / 原虫均高于非添加皂苷组, 除 50:50 水平下差异显著外, 其它精粗比条件下差异极显著 (P<0.01) 2.4 添加皂苷和日粮精粗比对体外产气量的影响 4 种精粗比条件下添加皂苷对体外 48 h 累计产气量的动态变化规律见表 6 各组的 48 h 累计产气量逐步上升, 总体在 3 12 h 内上升较快, 之后增加逐渐趋于平缓由表可以看出, 精粗比为 50:50 时, 添加皂苷组的产气量比非添加皂苷组低 5.2 ml, 差异极显著 (P<0.01), 其它精粗比时, 添加皂苷组的产气量分别比对照组高了及 1.7 ml, 精粗比为 40 : 60 时差异极显著 (P<0.01) 同种皂苷处理水平时, 精粗比 60:40 时的 48 h 累计产气量均为最高不添加皂苷的 4 组之间, 除精粗比 50:50 和 60:40 之间差异不显著外, 其它精粗比之间差异极显著 (P<0.01); 添加皂苷的 4 组之间, 除精粗比 40:60 和 60:40 之间差异显著外, 其它组之间差异极显著 (P<0.01) 图 2 不同精粗比下皂苷对细菌 / 原虫比例的影响 Fig. 2 Effect of of adding mixed saponins on ratio of bacteria to protozoa in incubation 2.5 添加皂苷和日粮精粗比对纤维降解菌的影响由表 7 和图 3 可以看出, 同一精粗比条件下, 添加皂苷组产琥珀酸拟杆菌的相对数量比非添加组分别提高了 0.46% 5.76% 2.94% 6.01%, 除精粗比为 20:80 时差异不显著外, 其它精粗比状态下差异极显著 (P<0.01) 从同一皂苷处理水平来看, 随着精粗比的提高, 产琥珀酸拟杆菌的相对数量有下降的趋势由表 7 和图 4 可以看出, 除精粗比为 40:60 时, 添加皂苷组白色瘤胃球菌的相对数量比非添加组低 0.41% 外, 其它精粗比状态下添加皂苷组均比非添加组高, 分别提高了 0.04% 0.33% 和 0.62%, 精粗比为 60:40 时差异显著 (P<0.01)

6 8 期王洪荣等 : 茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响 1715

7 1716 中国农业科学 44 卷理水平来看, 随着精粗比的提高, 黄化瘤胃球菌的相对数量有下降的趋势, 但在精粗比为 60:40 时又有所上升 3 讨论图 3 产琥珀酸拟杆菌 PCR 扩增产物 Fig. 3 Gel segment of PCR for Fibrobucter succinogene 图 4 白色瘤胃球菌 PCR 扩增产物 Fig. 4 Gel segment of PCR for Ruminococcus albus 由表 7 和图 5 可以看出, 同样除精粗比为 40:60 时, 添加皂苷组黄化瘤胃球菌的相对数量比非添加组低 2.05% 外, 其它精粗比状态下添加皂苷组均比非添加组高, 分别提高了 0.62% 1.87% 和 0.71%, 精粗比为 50:50 时差异极显著 (P<0.01) 从同一皂苷处图 5 黄化瘤胃球菌 PCR 扩增产物 Fig. 5 Gel segment of PCR for Ruminococcus flavefaciens 3.1 添加皂苷和日粮精粗比对培养液 ph 的影响体外培养使用的一般人工模拟瘤胃装置并没有动物体内的产物外排和瘤胃壁吸收等完善的动态自调功能, 因此其产物的积累多表现在理化状况, 如 ph 等的变化上而引起瘤胃 ph 波动的根本原因则是日粮结构和日粮营养一般来说, 采食纤维含量高的饲料有利于维持瘤胃较高的 ph 因为, 采食纤维含量高的饲料时, 日粮所含的糖类多为结构性碳水化合物, 在瘤胃中发酵速度缓慢, 从而使微生物的 VFA 和其它有机酸的产生速度也较为缓慢从本次试验中也可以看出, 精粗比为 20:80 时的 ph 平均值最高, 随着精粗比的下降,pH 平均值显著下降, 这是由于精料较纤维性饲料中含有较多的非结构性碳水化合物, 瘤胃微生物快速发酵产酸, 使得 ph 下降瘤胃细菌繁殖最适 ph 为 6 7, 微生物蛋白质合成最适 ph 范围为从本试验来看, 除了精粗比为 50:50 外, 添加皂苷处理组的 ph 均低于对照组, 其原因可能由于添加皂苷使人工瘤胃中原虫数量降低, 细菌总数相对增加造成有文献报道瘤胃原虫通过控制挥发性脂肪酸的生成速度而稳定瘤胃 ph, 同时纤毛虫通过捕食细菌, 减少了细菌对淀粉的发酵消化, 使瘤胃发酵更加稳定在原虫缺乏的条件下, 淀粉被细菌发酵成丁酸, 然后转变成乳酸, 由于瘤胃壁对乳酸的吸收速度较慢, 故使瘤胃 ph 有下降的趋势添加皂苷降低了培养液 ph 的结果也与其它试验结果相同 [1] 3.2 添加皂苷和日粮精粗比对培养液挥发性脂肪酸的影响瘤胃中挥发性脂肪酸主要来源于日粮中碳水化合物的发酵, 其产量和组成主要受日粮发酵底物结构的 [8] 影响 Yang 等报道, 日粮精粗比例的不同, 导致乙酸丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸的产量不同当饲喂较低量的精饲料, 乙酸产量最大, 占挥发性脂肪酸 60% 70%, 其次是丙酸占 15% 20%, 丁酸只占 5% 15% 随着日粮中精饲料比例的增加, 非结构性碳水化合物代替了结构性碳水化合物, 由于前者能够快速完全地被消化, 使总的挥发性脂肪酸合成量上升, 但乙酸和丙酸的比例也随之改变, 这是因为非结构性碳水化合物 ( 淀粉单糖等 ) 的发酵通常产生低比例的

8 8 期王洪荣等 : 茶皂素和丝兰皂苷对山羊人工瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响 1717 乙酸和高比例的丙酸 [9] 随日粮精饲料比例的提高, 乙酸和丁酸的产量下降, 丙酸的产量则上升王星凌 [10] 等报道, 淀粉的添加能显著降低乙酸浓度, 显著提高丁酸浓度 McAllan [11] 试验结果表明, 奶牛高精料水平日粮会明显降低瘤胃 ph 和乙酸的浓度, 增加丙酸 [12] 浓度, 但不影响总 VFA 浓度 Merchen 等用高粗料和高精料羯羊日粮做对比试验, 结果表明瘤胃内总 VFA 浓度不受影响 ; 饲喂高精料日粮时乙酸和丁酸的浓度显著降低, 丙酸浓度显著升高与以往报道的结果一致, 本研究也表明, 随日粮精粗比的上升, 丙酸含量呈上升趋势, 乙酸含量及乙酸 / 丙酸比值呈下降趋势其中不添加皂苷的情况下, 精粗比为 40:60 的乙酸和 TVFA 浓度比 20:80 时的高, 原因可能是精粗比为 20:80 时日粮中非结构性碳水化合物含量低, 微生物的活性受到抑制而导致的有研究认为在中等或者偏低的饲养水平条件下, 若日粮中具备充足的氮源, 必须同时提供适宜的易发酵碳水化合物, 才能保证瘤胃内微生物的能量供给并保持其较高的活性, 从而有利于瘤胃内微生物对粗饲料中纤维性物质的发酵与降解, 所以本试验中精粗比为 40:60 的日粮组乙酸和 TVFA 浓度最高皂苷对瘤胃发酵的主要影响表现在瘤胃内产酸模式的改变, 丙酸产量增加而乙酸 / 丙酸降低作为瘤胃原虫的主要发酵终产物, 丙酸的增加要以乙酸和丁酸 [13-17] 产量的下降为代价 Hu 等报道皂苷对原虫的抑制作用导致了丙酸产量的显著增加, 同时也有研究发现皂苷并不能影响丙酸的产量, 其原因可能是不同来源的皂苷动物日粮能够影响皂苷在动物体内的活性, 对瘤胃挥发性脂肪酸产生不同影响 [18] 体外培养发现, 表皂树 (quillaja) 丝兰无患子和田菁提取物对挥发性脂肪酸的总产量没有影响 [19-21] [22], 但 Lila 等研究发现无患子提取物可以增加挥发性脂肪酸的总产量本研究发现, 添加皂苷后乙酸和丁酸的摩尔百分比下降而丙酸上升, 并且乙酸 / 丙酸也呈下降趋势本试验结果也表明, 添加皂苷可以增加 TVFA 产量, 有利于瘤胃发酵, 产生更多的可利用能量满足动物的需要 3.3 不同皂苷和精粗比状态对微生物蛋白产量的影响在高淀粉含量日粮条件下, 瘤胃纤毛虫对维持瘤胃内环境平衡有很重要的作用, 在瘤胃中其重量几乎与细菌相当而纤毛虫生物学效价要高于细菌, 因此纤毛虫对宿主蛋白质营养的贡献也越来越受到人们的 [23-24] 重视 Martin 等已对奶牛瘤胃中细菌和纤毛虫进行了分离, 并分别研究了其营养组成, 两个报道的结果不完全一致但明确不同种类微生物的营养组成对正确估计小肠氨基酸具有极其重要的意义本次试验也将山羊瘤胃中的细菌与原虫分离, 分别测其真蛋白的含量, 主要原因除了瘤胃原虫对瘤胃的重要作用外, 皂苷能有效的抑制原虫的生长, 进而影响瘤胃细菌和原虫蛋白的产量, 对于研究皂苷对瘤胃的调控具有重要意义本试验中, 由于玉米是高能量饲料, 含有大量易消化的碳水化合物, 因此对瘤胃微生物合成 MCP 提供了充足的能源, 随着发酵底物中玉米比例的不断增加, 瘤胃液细菌 (B) 的真蛋白产量随之增加, 而当精粗比为 60:40 时细菌蛋白产量反而下降, 可能是比较低的 ph 影响了细菌的生长 NRC(1996) 指出, 瘤胃液 ph 低于 6.2 时菌体蛋白合成效率将下降 ph 也是原虫生长的主要限制因素, 当日粮中精料的百分比达到 60% 或更高时, 瘤胃内 ph 则会下降这时, 瘤胃原虫浓度迅速下降, 甚至完全消失本试验随着精粗比例的上升, 导致 ph 下降, 原虫 (P) 的真蛋白产量呈现下降的趋势这与 Hungate [25] 的研究结果一致但当精粗比为 40:60 时, 原虫的真蛋白产量最高, 一般情况下, 日粮中粗料含量为 40% 50% 时, 瘤胃内原虫数量最大, 其种类也最丰富不添加皂苷的情况下, 各组 ( 精粗比为 20:80 40:60 50:50 60:40) 的原虫的真蛋白产量高于添加皂苷的各组, 这主要与前面的研究相一致皂苷明显降低了瘤胃原虫的数量, 影响了原虫真蛋白的产量而瘤胃原虫与细菌之间存在着拮抗作用, 添加皂苷降低原虫数量的同时, 减弱了原虫对细菌的吞噬作用, 由此使得细菌数量增加, 因此不加皂苷各组的细菌蛋白产量高于添加皂苷的各组而且本研究发现在微生物蛋白产量上皂苷与精粗比之间不存在互作效应 3.4 添加皂苷和日粮精粗比对体外产气量的影响前人研究表明, 饲料有机物质的消化率与体外培养时的产气量具有高度相关性 [26-27], 产气量高, 饲料在瘤胃内的发酵活动剧烈日粮组成对体外产气量的影响非常明显, 随着底物中精料比例的增加, 其产气量显著提高,A 组 ( 20:80)48 h 累计产气量为 28.9 ml, D 组 (60:40)48 h 累计产气量为 42.2 ml, 差异极显著 (P<0.01) 由于玉米是高能量饲料, 含有大量可消化淀粉, 可在发酵系统中快速发酵, 故显著提高了

9 1718 中国农业科学 44 卷 48 h 的体外产气量, 说明底物组成对体外产气量的大小及产气速度起绝对作用从体外产气的动态变化和 48 h 累计产气来看, 皂苷的添加可以促进培养液的发酵, 提高体外产气量而当底物中精料比例大于等于 50% 时, 皂苷会对发酵产生不利影响, 从而有降低体外产气量的趋势叶均 [1] 安也通过研究发现, 添加茶皂素组的产气量均高于空白组因此将适量茶皂素或茶籽饼添加于低精料日粮中, 可能有利于提高反刍动物对饲料的利用效率及其生产性能本研究也发现在体外 48 h 累计产气量上皂苷与精粗比之间存在互作效应 (P<0.01) 3.5 添加皂苷和日粮精粗比对纤维降解菌的影响瘤胃细菌在纤维物质消化中占主导地位, 瘤胃内主要的纤维分解细菌有产琥珀酸拟杆菌, 黄化瘤胃球菌, 白色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌胡明研究表明, 添加苜蓿皂苷 8 16 g d -1, 显著提高了绵羊瘤胃 3 种纤维分解菌 ( 产琥珀酸拟杆菌黄化瘤胃球菌及白色瘤胃球菌 ) 占总细菌数的相对百分比 [28] 张霞研究表明, 鲜沙葱和提取物能够提高瘤胃纤维分解细菌产琥珀酸丝状杆菌白色瘤胃球菌相对数量, 但对黄化 [29] 瘤胃球菌相对数量没有显著影响目前, 关于茶皂素和丝兰皂苷对瘤胃纤维降解菌影响的报道很少本试验结果表明, 随着日粮中精料比例的提高, 瘤胃 3 种纤维分解菌, 尤其是产琥珀酸拟杆菌和白色瘤胃球菌的数量有逐渐减少的趋势, 而添加混合皂苷又会使 3 种纤维菌的数量有增加的趋势, 其原因可能是皂苷对原虫的抑制作用影响了原虫对细菌的吞噬作用, 导致瘤胃中细菌总量增加, 从而使纤维降解菌的数量也随之增加, 其数量的增加势必有助于改善纤维饲料在瘤胃内的发酵和降解 4 结论添加茶皂素和丝兰皂苷混合物有降低瘤胃液中原虫总数和 ph 的趋势, 并能够降低原虫真蛋白产量而提高细菌真蛋白产量添加皂苷可有提高白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌的相对数量的趋势茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵模式和瘤胃内纤维降解菌变化有一定影响, 其作用效果受培养底物精粗比的显著影响 References [1] 叶均安. 茶皂素对瘤胃原虫的抑制效果. 中国饲料, 2001, 2: Ye J A. Inhibiting effects of tea saponins on protozoa count in the rumen of sheep. China Feed, 2001, 2: (in Chinese) [2] 苑文珠, 刘建新, 叶均安. 茶皂素作为瘤胃发酵调控剂的研究. 饲料博览, 2002, 9: 4-5. Yuan W Z, Liu J X, Ye J A. A study on tea saponins employed to manipulate the rumen fermentation. Feed Archives, 2002, 9: 4-5. (in Chinese) [3] Alexander N, Hristov. Effects of yucca schidigera on ruminal fermentation and nutrient digestion in heifers. Journal of Animal Science, 1999, 77: [4] Valdez F R, Bush L J, Goetsch A L, Owens F N. Effect of steroidal saponins on ruminal fermentation and on production of lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 1986, 69: [5] 李国祥, 王梦芝, 李世霞. 丝兰提取物对山羊瘤胃发酵参数原虫密度及甲烷产量的影响. 饲料工业, 2008, 26(18): Li G X, Wang M Z, Li S X. Effects of yucca schidigera on ruminal fermentation, protozoa counts and methanogenesis in the rumen of goats. Journal of Feed Industry, 2008, 26(18): (in Chinese) [6] Girard. Fermentations in rumen stimulatinn cultures receivinn yucca extra supplementation. Journal of Animal Science, 1991, 9(suppl.): [7] Satoshi K, Kobayashi Y. Development and use of competitive PCR assays for the rumen cellulolytic bacteria: Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus and Ruminococcus favefaciens. FEMS Microbiology Letters, 2001, 204: [8] Yang W Z, Beauchemin K A, Rode L M. Barley processing, forage: concentrate, and forage length effects on chewing and digesta passage in Lactating Cows. Journal of Dairy Science, 2001, 84: [9] 石燕, 施福顺. 营养与饲喂. 北京 : 中国农业大学出版社, Shi Y, Shi F S. Nutrition and Feeding. Beijing: China Agricultural University Press, (in Chinese) [10] 王星凌, 朱承满, 李世英, 柳尧波, 任素芬. 运用 Rusitec 系统研究不同碳水化合物对麦秸消化率的影响机理. 山东农业科学, 2002, 1: Wang X L, Zhu C M, Li S Y,Liu Y B, Ren S F. The effect of different carbohydrate supplements on wheat straw digestibility by using Rusitec. Shandong Agricultural Sciences, 2002, 1: (in Chinese) [11] McAllan A B. Rumen fermentation characteristics and duodenal nutrient flow in lactating cows receiving two types of grass silage with two levels of concentrates. Animal Feed Science and Technology, 1994, 46: [12] Merchen N R, Firkins J L, Berger L L. Effect of intake and forage level on ruminal turnover rates, bacterial protein synthesis and duodenal amino acid flows in sheep. Journal of Animal Science, 1986,

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288 华北农学报 28 卷 1 8 Tab. 1 1 The substrate and fermentation reaction equation of methane-producing bacteria Substrate H 2 CO 2 Hydrogen and Carbon diox

288 华北农学报 28 卷 1 8 Tab. 1 1 The substrate and fermentation reaction equation of methane-producing bacteria Substrate H 2 CO 2 Hydrogen and Carbon diox 华北农学报 2013,28 ( 增刊 ) : 2 8 7-2 92 1 2 1 2 1 1. 130012 2. 410128 S852. 2 A 1000-7091 2013-0287 - 06 The Effect and Mechanism of Action of Plant Extract on Methane Emission of Ruminant YU Miao 1 2 ZHONG