代谢综合征风险 趋势预测和干预模型的构建 毕华瑞耿明萌李杨龙永康骆锦威指导老师 : 李景治 南方科技大学 摘要 代谢综合征的致病机理复杂, 其早期诊断与治疗是生物医学研究的重大挑战之一 本文通过分析基因型 基因表达水平和疾病之间的关系, 结合生物信息学的知识和方法, 通过对基因组数据和转录组数据进行

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1 代谢综合征风险 趋势预测和干预模型的构建 毕华瑞耿明萌李杨龙永康骆锦威指导老师 : 李景治 南方科技大学 摘要 代谢综合征的致病机理复杂, 其早期诊断与治疗是生物医学研究的重大挑战之一 本文通过分析基因型 基因表达水平和疾病之间的关系, 结合生物信息学的知识和方法, 通过对基因组数据和转录组数据进行分析与挖掘, 找出了代谢综合征基因通路, 构建代谢综合征风险预测模型 本题所给的人类群体数据集可分为基因组数据和转录组数据 : 对于基因组数据, 我们可以得到样本中的不同基因变异频率, 对各基因与患病之间的关系进行分析, 先后进行了基因简单筛选和趋势性基因筛选, 构建并求解基于基因变异频率的模型, 并对差异基因进行分析 ; 对于转录组数据, 利用 GO 功能富集分析 Pathway 显著富集分析, 利用变异系数和 Mann-Kendall 检验等方法处理数据, 通过判断基因表达水平与患病程度之间的关系, 剔除大部分不相关的基因, 构建了基于基因表达量的预测模型 在求解以上模型的过程中, 用到了支持向量机和决策树等数据挖掘的方法, 提高了解决问题的速度和准确性, 克服了样本数较少的缺点, 达到了较高的交叉检验成功率 结合基因调控矩阵, 证明了每个个体的基因交互状态向量中可能含有更多的信息 现有的公开数据库中已经有大量关于生物分子相互作用和基因通路的信息, 我们参考这些数据库并借助题目所给的数据, 先研究了高频变异基因对其他基因表达量的影响 寻找上下游基因, 实现了基于基因通路的预测 同时把之前模型的结果与实际数据库中的结论做对比, 很多理论的结果与实际结论相吻合, 在本文中以胰岛素信号通路中非常重要的 PI3K 基因为例进行说明 由于代谢综合征的成因较为复杂, 本文还构造了 变异基因作用网络 的 2- 范数风险预测模型, 可用于对造成代谢综合征的不同因素的预测 本论文中所提到的方法能够依靠不同的数据, 建立不同的模型, 便于不同模型间的比较, 同时也可以综合多种数据建模 本论文中的绝大多数模型都是基于数据而建立的, 例如根据基因表达量和基因变异位点数据, 其基本思想和方法不仅仅可以用于代谢综合征, 可以应用于更多的疾病 虽然大部分模型是基于数据而建立的, 但是我们同时还用实际科学研究发现和数据驱动的模型结果进行比较, 来用于佐证模型实用性 关键词 : 代谢综合征生物信息学数据挖掘

2 目录 1 问题重述 4 2 问题背景与分析 代谢综合征的定义和诊断 代谢综合征相关的生物学背景 脂肪代谢 (Lipid Metabolism) 胆固醇代谢 (Cholesterol Metabolism) 胰岛素信号通路 (Insulin Signaling Pathway) 代谢综合征相关代谢分子 思路分析 模型假设 8 4 模型建立 8 5 数据处理 数据预处理 数据统计分析 数据库 模型求解与结果分析 模型一 : 基于基因表达量的预测模型 基因简单筛选 趋势性基因筛选 差异基因分析 模型求解 模型二 : 基于基因变异频率的预测模型 基因变异频数统计 高频变异基因分析 模型求解 结果分析 模型三 : 以混合状态进行分类 高频变异基因的查找 高频变异基因对其他基因表达量的影响 寻找上下游基因 基因调控矩阵 结果分析 实例说明 寻找相关基因 模型四 : 基于 变异基因作用网络 的 2- 范数风险预测模型 模型说明 模型应用 结果分析

3 7 模型的评价 改进及推广 模型的评价 模型优点 模型缺点 模型的改进 模型的推广 Appendices 29 A 代谢综合征相关症状 29 A.1 肥胖症 (Obesity) A.2 Ⅱ 型糖尿病 (Type 2 diabetes) A.3 高血压 (Hypertension) 高血糖 (Hyperglucomia) 高血脂 (Hyperlipidemia). 30 A.4 动脉粥样硬化 (Atherosclerosis) A.5 脂肪肝 (Fatty liver) B 数据处理代码 31 B B B B B B B

4 插图 1 脂肪代谢 (Lipid Metabolism) 胆固醇代谢 (Cholesterol Metabolism) 胰岛素信号通路 (Insulin Signaling Pathway) 流程图 组别 0 模型一交叉验证的结果 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 组别 1 模型一交叉验证的结果 组别 1 中方法 1 的混淆矩阵 组别 0 的基因变异频数统计 组别 1 的基因变异频数统计 组别 0 模型二交叉验证的结果 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 组别 1 模型二交叉验证的结果 组别 1 中方法 1 的混淆矩阵 对高频变异基因进行基因富集的结果 FLG 基因变异使部分基因表达量上升 FLG 基因变异使部分基因表达量下降 高频变异基因对其他基因表达影响的随机模拟 调控矩阵 调控矩阵的拓扑结构 调控矩阵 3D 示意图 组别 0 模型三交叉验证的结果 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 组别 0 模型三交叉验证的结果 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 PIK3 对部分基因表达量的影响 二型糖尿病基因通路 协同矩阵 高维空间中的组间分离 高维空间中的组间交叉 患病程度风险量化示意图 与代谢综合征相关的基因 肥胖症 (Obesity) Ⅱ 型糖尿病 (Type 2 diabetes) Ⅱ 型糖尿病 (Type 2 diabetes)

5 1 问题重述 当前的生命科学技术已经使得我们可以解析人类的遗传密码 基因序列 人与人之间基因序列的差异, 即基因变异, 影响着每个人罹患代谢综合疾病的风险高低, 也影响着不同非遗传因素在每个人身上的具体作用效果 这也是为何代谢综合征在具有血缘关系的亲属之间有较高的发病关联的原因 此外, 对人体生理运行动态特征, 如基因的表达 各类小分子含量乃至于与人类紧密关联的微生物菌群的变化等, 目前亦可以定量测量, 从而实现了对人体当前运行状态动态监控 另一方面, 各类自然和社会环境因素 生活方式等因素会对这些指征可能产生短期到长期的影响, 最终形成多种外部表型特征, 目前也可以通过各类移动医疗和健康设备加以记录, 成为医疗及体检机构的临床检测数据 人体作为一个非线性复杂系统, 其慢性疾病, 特别是代谢综合征的发展, 也是一个长期过程 ; 而最终在临床上被诊断为代谢综合征, 已经是这个慢性发展过程的结果 而我们平时所能够采取的健康和疾病预防手段, 通常也只是针对于普适人群的平均推荐, 不一定适合于每一个人 如果我们能够在早期对人体各类从内部到外部的因素进行测量 分析, 可以构建一个早期的趋势预测模型, 并且可以明晰这个复杂系统的具体问题所在, 完成对每个人的个性化预防干预 如果给你一个人类群体 (~100 人 ), 每个人具有较完整的下述生物医学数据 : 1. 临床检测数据 2. 基因组数据 3. 表观基因组数据 4. 转录组数据 5. 蛋白质组数据 6. 代谢组数据 请你基于以上数据完成以下任务 : a) 请参考 NCBI, EBI, DDBJ 等公开数据库中的生物分子相互作用和基因通路信息, 构建人类生命量化的动态模型 ; b) 结合临床检测数据, 哪些因素 ( 数据特征或相互作用网络 ) 是代谢综合征 ( 一种临床诊断结论 ) 的关键通路 ; c) 若给定一个新的人类群体数据集 (~10 人 ), 包含了每个个体的基因组 表观基因组 转录组 蛋白质组和 ( 或 ) 代谢组的部分测量, 请问这些人有多大的代谢综合征风险? 造成他们的代谢综合征风险的主要因素分别是什么? 2.1 代谢综合征的定义和诊断 2 问题背景与分析 自从工业革命以来, 人们生活水平不断提高 但由于人体缺乏对营养过剩的抑制机制以及现代人缺乏良好的生活习惯等种种原因, 代谢综合征 (Metabolic Syndrome, MS) 已经越来越成为人类健康问题的幕后推手 代谢综合征是指在生理 生化 临床 代谢等层面能够直接增加心血管疾病 Ⅱ 型糖尿病 和所有原因的死亡的风险的危险因子聚集现象 与代谢综合征相关的因素有很多, 包括胰岛素抵抗 内脏肥胖 动脉粥样硬化 脂肪肝 血脂异常 内皮功能障碍 遗传易感性 血压升高 高凝状态 慢性应激等 由于代谢综合征产生的因素较多, 不同种族的特点也不同, 目前无一致公认并适用于各种族的 MS 诊断标准, 国际糖尿病联盟 (International Diabetes Federation, IDF) 世界卫生组织 (World Health Organization, WHO) 欧洲胰岛素抵抗研究小组 (European Group 4

6 for the Study of Insulin Resistance, EGIR) 全美胆固醇教育计划 (National Cholesterol Education Program, NCEP) 美国心脏协会 (American Heart Association, AHA) 等机构组织先后提出了不同的诊断标准 2.2 代谢综合征相关的生物学背景 代谢综合征主要涉及人体物质能量代谢过程, 人体细胞的能量摄取主要通过脂肪和糖代谢进行 物质代谢涉及到人体各个水平物质的动态平衡, 血糖平衡是维持人体内稳态的关键, 而胰岛素和胰高血糖素精确地控制着人体内血糖水平 自然地, 胰岛素的信号通路也成为了调节内稳态的重要机制 脂肪代谢 (Lipid Metabolism) 脂肪代谢 (Lipid Metabolism) 涉及到人体的胆固醇 (Cholesterol) 高密度脂蛋白 (HDL) 血脂 (Plasma lipid) 等含量水平, 其代谢过程如如图 1 所示 脂肪类物质从小肠吸收通过淋巴管形成乳糜微滴, 在血管组织中通过甘油三酯水解形成甘油和脂肪酸运输到脂肪组织分解利用, 部分多余乳糜微滴将流入肝脏在组装 从肝脏分泌的极低密度脂蛋白 VLDL 通过毛细血管水解形成 IDL 中密度脂蛋白,IDL 经过脂蛋白脂肪酶作用形成低密度脂蛋白 LDL,LDL 由 APOB 基因表达合成 周围组织细胞将摄取 LDL, 作为能量来源, 最终以 HDL 高密度脂蛋白的形式将多余脂肪排出, 运送至肝脏回收利用 肝脏作为其中最重要的调控器官, 调节脂肪摄入 运输 代谢等各项生理过程 脂肪代谢异常将引起血脂异常 高血压 脂肪肝等症状 胆固醇代谢 (Cholesterol Metabolism) 图 1: 脂肪代谢 (Lipid Metabolism) 胆固醇的代谢直接涉及血液胆固醇的含量变化, 高血液胆固醇将引起血管肥厚堵塞以至于破裂出血 胆固醇代谢 (Cholesterol Metabolism) 的过程如图 2 所示, 细胞以胞吞方式摄取 LDL, 经过溶酶体酶解形成胆固醇脂滴, 胆固醇分子经过内质网加工高尔基体组装重新形成 LDL 受体,LDL 受体蛋白由 LRP1B 基因编码 同时胆固醇代谢异常也会引起心血管疾病 (Cardiovascular disease), 例如冠心病 动脉粥样硬化 5

7 图 2: 胆固醇代谢 (Cholesterol Metabolism) 胰岛素信号通路 (Insulin Signaling Pathway) 图 3: 胰岛素信号通路 (Insulin Signaling Pathway) 胰岛素是人体调节血液葡萄糖含量的重要激素, 对人体的物质能量代谢平衡有重要的作用 胰岛素的信号通路影响脂肪酸合成 糖酵解和糖异生 细胞分裂分化凋亡 蛋白质合成 胰岛素的异常代谢引起各种类型的糖尿病 胰岛素信号通路 (Insulin Signaling Pathway) 如图 3 所示, 胰岛素分子与细胞膜表面的胰岛素受体蛋白 INSR 结合引 6

8 起 IRS 基因编码的胰岛素受体底物 IRS 磷酸化,IRS 促进 PI3KCA 基因合成磷脂酰肌醇 -3- 激酶 PI3K, 进而促进 IPCEF1 基因表达使三磷酸肌醇 PIP3 的含量升高 同时 INSR 引起下游蛋白 SHC 磷酸化, 通过促进 GRB2 SC6 Ras Raf 基因表达翻译, 引起 MEK1/2 蛋白的磷酸化, 进而磷酸化 MAPK4 基因编码的 ERK1/2 蛋白 2.3 代谢综合征相关代谢分子 自由脂肪酸分子 (FFA) 高水平的 FFA 可能导致肝脂肪的积累从而导致脂肪肝, 同时 FFA 可以通过抑制胰岛素介导的葡萄糖的摄取, 而导致胰岛素抵抗, 继而损害胰岛 B 细胞的功能 此外 FFA 还会增加纤维蛋白原和 PAI-1 的产生 在健康的个体中, 胰岛素刺激胰岛素受体底物 (IRS)-1 允许其结合并激活 PI3K 活性, 从而激活葡萄糖转运蛋白 GLUT4, 增加对葡萄糖的吸收, 但是血浆中高的 FFA 水平能够激活蛋白激酶 C(PKC)-theta, 通过一个丝氨酸 - 苏氨酸激酶级联, 减弱胰岛素刺激的 IRS-1 的酪氨酸磷酸化 TNF-α : 诱导脂肪细胞的凋亡, 通过抑制 IRS-1 通路从而促进胰岛素抵抗, 但是 TNFα 如何抑制 IRS-1 通路的机制目前还不太清楚 它能加剧 FFA 的释放, 诱发动脉粥样硬化血脂异常 血浆中 TNF-α 浓度和体重, 腰围, 甘油三酯 (TGs) 呈正相关的关系, 和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 呈负相关的关系 CRP 水平的升高和腰围的增加, 胰岛素抗性, 和高血糖相关联 此外, 已经证明, CRP 水平可以独立地预测 CVD 发生的概率, 而不管个体是否患有或者患有何种程度的代谢综合征 IL-6 是由脂肪组织和骨骼肌组织释放的, 它同时具有炎性和抗炎作用 在大脑的多个区域, 如下丘脑有 IL-6 的受体, 用来控制食欲和能量的摄入 它不仅可以损害细胞对胰岛素的敏感性, 也是肝产生 CRP 的主要决定因素 它被证明和二型糖尿病的程度呈正相关而和与 HDL-C 是呈负相关的 PAI-1 通过抑制组织纤溶酶原激活剂 (tpa) 发挥其效果, 因此被认为是一个障纤溶和动脉粥样硬化的一个标记, 增加血管内血栓和有害心血管的风险 脂联素 (Adiponectin) 调节糖脂代谢, 提高胰岛素敏感性, 调节食物摄入量和体重, 防止慢性炎征 它抑制肝脏酶和肝内源性葡葡萄糖异生酶和肝脏内源性葡萄糖产生的速率 它增加了肌肉的葡萄糖转运和脂肪酸的氧化, 它能从多个方面的抗动脉粥样硬化, 其中包括内皮细胞的活化, 降低巨噬细胞转化成泡沫细胞的转化率, 抑制平滑肌细胞的增殖和动脉重塑来抑制粥样硬化斑块的发展 脂联素的是与 CVD 危险因子的呈负相关的, 比如血压,LDL-C 和 TGs 此外,Fumeron 等人得出结论, 低脂联素血征与胰岛素抵抗, 高胰岛素血征, 患二型糖尿病的概率相关, 并且独立于脂肪含量 脂联素作为抗炎因子, 它与 HDL-C 呈相关, 和体重, 腰围,TGs, 空腹胰岛素, 胰岛素抵抗 (HOMA- 稳态模型评估 ),BMI 和血压呈负相关 它还与 TNF-α 形成拮抗作用 2.4 思路分析 问题的第一问需要参考公开数据库中的生物分子相互作用和基因通路信息, 构建人类生命量化的动态模型 不同的数据库有不同的特点, 我们选择合适的数据库进行分析 问题的第二问要求结合临床检测数据, 判断哪些因素是代谢综合征的关键通路 原始数据较为繁杂, 需要进行预处理, 清除异常数据和重复数据, 并纠正数据中的错误 7

9 处理后的数据主要包含基因表达量信息和基因变异信息, 可以用统计和机器学习的方法解决 但是由于本题中的样本数量不足, 需要选用对数据要求较少的方法 问题的第三问要求对新给定的人类群体数据集, 给出这些人的代谢综合征的风险并给出主要的风险因素 基于第二问建立的模型, 可以结合数据去预测 由于大多数与疾病相关的变异并不能改变一个基因的功能, 只能改变基因的表达水平, 将基因组数据和转录组数据结合, 才能更好实现对全基因组数据转录水平的估算 由于本题中所给数据的种类较少, 需要对用简化的模型实现对代谢综合征的影响因素的预测 在 MATLAB 的工具箱中, 包含了多种分类器, 包括决策树 (Decision Trees) 判别分析 (Discriminant Analysis) Logistic 回归 (Logistic Regression) 支持向量机 (Support Vector Machines) 最近邻分类器 (Nearest Neighbor Classifiers) 集成分类器 (Nearest Neighbor Classifiers) 等 支持向量机在解决小样本 非线性和高维模式识别问题中表现出许多特有的优势 决策树也是一种常见的分类方法, 在经过给定的数据集的训练之后, 可以对新示例进行分类, 易于理解和实现 我们可以利用这些方法对数据进行初步的分析处理, 随后挖掘出更多的生物学含义 1. 假设基因测序的结果是正确的 3 模型假设 2. 假设每一个个体的高频基因患病程度中蕴含着其患病信息 3. 假设同一个基因不同方式的变异具有相同的效果, 即对于不同的变异位点坐标 变异碱基 变异类型, 只要他们变异所在的基因相同就会产生同样的效果 4. 假设被筛选出的异常数据不是正常数据 5. 假设不同的个体生活环境相同 4 模型建立 生物体是一个耗散结构, 也是一个多层次的信息网络, 其内部存在大量的相互作用和反馈循环 题目中已经给出了人类群体的生物医学数据, 通过机器学习的相关方法, 可以找出变异基因 基因表达量和患病程度之间的关系, 从而完成对代谢综合征的风险和趋势的预测 在题目所提供的 RNA-seq 基因表达文件中, 每一个患者的数据都有超过 2 万个基因 基于生物学和统计学知识, 可以过滤出无用的基因 减少数据量, 进而根据基因的表达量信息对患者的患病程度分类 对于筛选后的基因, 利用机器学习的方法对其进行分类, 建立基于基因表达的模型的, 得到代谢综合征的患病程度和基因表达量的关系 在题目提供的变异位点信息中, 由于变异分类和变异类型过于复杂, 我们可以只考虑对基因发生变异的次数的统计, 选出高频变异基因 同样运用机器学习的方法, 建立基于基因变异次数的模型, 寻找基因变异与代谢综合征的关系 综合考虑基因表达量和基因变异次数, 建立综合模型, 通过临床数据来预测代谢综合症的患病程度和主要影响因素 现在的生物学已经有不少对于代谢综合征的研究, 本题所得到的实验结果可以是其他科学研究的数据做对比 流程图如下 : 8

10 图 4: 流程图 5 数据处理 5.1 数据预处理在题目的原始数据中, 有些错误较为明显, 需要进行简单的处理, 如 : (1) 在 sample.exp.0 中, 出现两个 54 号数据 处理方式 : 直接删除 9

11 (2) 在 sample.exp.0 中, 无样本 205 号表达量数据 处理方式 : 删除 (3) 在 sample.exp.1 中, 表达量数据异常 处理方式 : 删除 (4) 在 sample.var.0 和 sample.var.1 中, 数据大量重复 处理方式 : 删除 对上述数据进行预处理之后, 提高了数据处理的质量, 使得结果更准确 5.2 数据统计分析 本题所给的数据主要包含了患者的患病程度 变异位点信息和基因表达信息 但是也有性别信息和组别信息, 在进行数据处理之前, 为了考虑组别和性别两个因素是否会对患病情况产生影响, 我们利用统计学检验方法 可重复双因素方差分析, 进行检验, 结果如表 1 表 2 和表 3 所示 : 表 1: 方差分析一 Source SS df MS F Prob>F Columns Rows Interaction Error Total 表 2: 方差分析二 Source SS df MS F Prob>F Columns Rows Interaction Error Total 表 3: 方差分析三 Source SS df MS F Prob>F Columns Rows Interaction Error Total 从方差分析结果可以看出, 我们不能得出性别因素对患病结果有显著影响 ; 不能得出样本因素对患病结果有显著影响 ; 但是, 我们可以从 P-value 看出, 样本因素与性别因素会产生交叉影响 因此, 在处理数据时, 我们首先分别分样本处理, 再分别分性别处理, 最后分析并比较结果 5.3 数据库 生物分子相互作用和基因通路信息需要从公开的数据库中选择, 需要对比不同数据库的特点, 获取更多有用的信息 10

12 GWAS 数据库通过 GWAS 全基因组关联分析数据库可查找代谢综合征相关的单核苷酸多态性 (SNPs), 并将 reported genes 整理成表, 用做关键基因的筛选匹配 NCBI/DDBJ/EBI/GeneCards/Uniprot 数据库 NCBI DDBJ EBI GeneCards 和 Uniprot 数据库共享基因和蛋白质信息 我们通过这三个数据库搜索查找从数据中得出的关键基因, 找出这些基因的功能及相互作用 Gene Ontology 数据库 Gene Ontology 数据库可以通过基因富集分析得出相关的细胞组分 分子功能和生物过程 富集的基因由病患样本的差异表达基因筛选和变异基因筛选得出 KEGG 数据库 KEGG 数据库可以查找跟代谢综合征相关的基因通路和代谢机理 6.1 模型一 : 基于基因表达量的预测模型 基因简单筛选 6 模型求解与结果分析 在题目所给的两批样本的基因表达量信息分别储存在 sample.exp.0 文件和 sample.exp.1 文件中 对于不同批次不同类型的病人, 对其基因分开进行处理 对于同一批的样本的第 i 个基因, 记其全体为 G i, 记该 G i 的标准差为 σ i 均值为 µ i, 则该类型样本的变异系数 v i 可由下式求得 : v i = σ i µ i (1) 变异系数是概率分布离散程度的一个归一化量度, 消除了测量尺度和量纲的影响, 反应了数据离散程度的绝对值 在同一批次中表达量变化小的基因意味着此基因对于患病情况影响小将这些基因去除掉, 因此筛选时作以 0.1 为阈值 当基因的表达量过少时,RNA 无法翻译足够多的多肽来合成蛋白质, 且当平均值接近于 0 的时候, 微小的扰动也会对变异系数产生巨大影响, 因此造成精确度不足, 因此取 µ i > 5 进行筛选 由于测量时存在误差, 每一组 G i 的样本数目较少, 异常值可能会对该组数据的均值产生较大的影响, 为了过滤掉存在异常值的基因, 以 µ i + 3σ i 作为条件再次进行筛选 经过这两次筛选后, 对同一组别不同的患病类型的剩余的基因取交集得到初步筛选的结果 : 组别 0(samlple.exp.0) 中还剩下 个基因, 组别 1(sample.exp.1) 中还剩下 个基因 在之前的筛选中, 剔除了有较大异常值影响该组基因表达量平均值的情况 对于同一批样本不同类型的第 j 个基因的表达量的平均值 ( 每个基因共 11 个值, 对应着 11 种不同的患病程度 ), 记其平均值 µ j, 标准差为 σ j, 类似的, 定义该类型样本的变异系数为 v j v j = σ j µ j (2) 为了筛选出在不同患病程度下表达量有较大差异而在同一患病程度下基因表达量稳定的基因, 以 v i > 0.5 为条件再次进行筛选 在组别 0(sample.exp.0) 中得到 1723 个基因, 在组别 1(sample.exp.1) 中得到 1682 个基因, 其中既在组别 1 中出现又在组别 0 中出现的基因为 1214 个 在此基础上, 通过变异基因和数据跳跃分析对备选基因进行筛选可得到代谢综合症的关键通路 11

13 6.1.2 趋势性基因筛选 对于初步筛选基因, 即在组别 0(samlple.exp.0) 中的 个基因和组别 1(sample.exp.1) 中的 个基因进行趋势性基因筛选 我们采用 mann-kendall 趋势分析方法, 此检验方法是非参数方法, 不需要样本遵从一定的分布 sample.info.txt 文件中有两批样本中病人的患病程度的信息, 在该文件中病人被划分为 11 种类型 (I IA IB II IIA IIB III IIIA IIIB IV IVA) 对于同一个样本病患 ( 即 sample.exp.0 和 sample.exp.1 中的每一列 ) 按照对应患病程度深浅按照由轻到重进行排序, 并将其表达量记为 (X 1,X 2,,X n ), 在本题中 n = 11 在 Mann-Kendall 检验中, 原假设是该序列数据是 n 个独立的随机变量同分布的样本 检验的统计量为 S, 可以由下面的式子计算 : 即对于 m > n: 若 (X j X k ) > 0, 则 Sgn(X j X k ) = 1; 若 (X j X k ) > 0, 则 Sgn(X j X k ) = 0; 若 (X j X k ) > 0, 则 Sgn(X j X k ) = 1 S 为正态分布, 均值为 0, 其方差可由下式计算 : S = Σ n 1 k=1 Σn j=k+1 Sgn(X j X k ) (3) Var(S) = n(n 1)(2n + 5) 18 当 n>10 时, 标准正态系统变量可分为下面的几种情况计算 : 如果 S = 0, 则表示分类该基因的表达量在患病情况中没有趋势 如果 S > 0, 则 Z = S + 1 Var(S) (5) (4) 如果 S > 0, 则 Z = S 1 Var(S) (6) 定义显著性水平 α=0.05, 由于 S 符合标准正态分布, 将正态分布的 位点 1.96 作为筛选阈值 如果 Z > 1.96, 则将认定该基因具有趋势 进一步将最终筛选出的具有表达量趋势性的基因在生物数据库中进行查找验证, 得到与代谢综合症具有重大关联的基因 差异基因分析 在基因简单筛选中 : 经过第一步, 组别 0(samlple.exp.0) 中还剩下 个基因 组别 1(sample.exp.1) 中还剩下 个基因 ; 经过第二步, 组别 0(sample.exp.0) 中还剩下 3446 个基因 在组别 1(sample.exp.1) 中还剩下 3319 个基因 在第二步中剔除的基因中找出存在表达量之间差异大于 1000 倍的基因, 即 µ i1 µ i2 min(µ i1,µ i2 ) > 1000 且表达量数值 µ i1 > 10 的基因, 在组别 1(sample.exp.1) 中得到 118 个异常基因, 组别 0(sample.exp.0) 中得到 128 个异常基因 这些表达量异常值可能由于该病患的对应基因产生突变或者与此基因调控关系的基因产生了变异, 对于这些基因进行单独分析 模型求解 针对筛选出的具有根据患病程度加深具有趋势性变化的基因, 并以此基因为分类模型输入, 患病程度为标签, 利用决策树和支持向量机的相关算法进行分类, 在 MATLAB 中进行交叉验证的结果如图 5 和图 7 所示, 这几种方法的差异并不明显 对于组别 0 和组 12

14 别 1 各选取了一个混淆矩阵, 如图 6 和 8 所示 从图中可以看出, 本模型的预测结果一般 图 5: 组别 0 模型一交叉验证的结果 图 6: 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 图 7: 组别 1 模型一交叉验证的结果 图 8: 组别 1 中方法 1 的混淆矩阵 6.2 模型二 : 基于基因变异频率的预测模型 基因变异频数统计 在本题所提供的变异位点文件中包含变异位点坐标 变异碱基 变异类型 变异所在基因和变异对基因的功能影响, 对于同一个基因不同方式的变异, 可能会产生不同的效果 在本题中, 为了简化计算过程, 我们假设同一个基因不同方式的变异具有相同的效果, 即只统计该基因的变异的次数, 对于组别 0 和组别 1, 统计结果如图 9 和图 10 所示 从图中可以看出, 大部分基因变异的次数较低, 与代谢综合征相关的基因发生变异的可能性要高于与代谢综合征无关的基因 13

15 图 9: 组别 0 的基因变异频数统计 高频变异基因分析 图 10: 组别 1 的基因变异频数统计 对于不同的组别, 我们分别对变异基因进行频数统计, 并选出各个组别变异频率最高的前 20 个基因, 结果见表 4 和表 5 表 4: 组别 0 的基因变异频数变异最高的 20 个基因 TTN MUC16 TP53 RYR2 CSMD3 PIK3CA LRP1B USH2A ZFHX4 FLG SYNE1 PCLO SPTA1 XIRP2 HMCN1 MUC17 CSMD1 OBSCN ANK2 MLL3 表 5: 组别 1 的基因变异频数变异最高的 20 个基因 TTN TP53 MUC16 VHL CSMD3 FLG LRP1B RYR2 FAT1 PBRM1 ZFHX4 MALAT1 TRIP11 NEB RYR3 AHNAK2 USH2A LAMA4 PIK3CA DMD 模型求解 在获得高频变异基因的基础上, 我们通过合并样本信息文件 (sample.inf.txt) 与变异位点文件 (sample.var.0, sample.var.1), 我们将每一个个体高频变异基因的变异个数与其患病程度联系起来 我们假设每一个个体的高频基因患病程度中蕴含着其患病信息, 因此, 我们以 20 个高频基因为其特征描述, 以患病程度分为 4 个层次 ) 为标签, 利用决 14

16 策树和支持向量机的相关算法进行分类, 利用 MATLAB 进行交叉验证的结果如图 11 对于不同的方法, 我们可以求出其混淆矩阵, 例如图 12 为方法 1 复杂决策树的混淆矩阵 : 图 11: 组别 0 模型二交叉验证的结果 图 12: 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 类似的, 我们可以对组别 1 进行分析, 结果如图 13 和图 14 所示 : 图 13: 组别 1 模型二交叉验证的结果 图 14: 组别 1 中方法 1 的混淆矩阵 结果分析 在数据量看, 虽然分类标签量小 (4 个 ), 但是由于样本个体实在太小, 因此, 机器学习算法较难准确获得每个标签的特征, 这会导致准确率较低 从预测准确率上看, 三种算法预测准确率都较低, 其中, 高斯核的支持向量机算法准确率较高, 结合三个算法的特点分析, 我们认为这与基因和患病程度之间的有非线性关系有关 ; 从混淆矩阵看, 错误比较集中在预测为 stage1 部分, 我们可以因此推断, 由于 stage1 的患病程度较轻, 特征不如患病程度重的明显, 因此更容易将样本误分到 stage1 比较组别 0 与组别 1 的结果, 我们可以发现, 从高频变异基因上看, 组别 0 与组别 1 表现较为一致 6.3 模型三 : 以混合状态进行分类 高频变异基因的查找 在图 9 和图 10 中, 我们已经对两个基因变异文件 (sample.var.0 和 sample.var.1) 做频数统计的处理 为了探索高频变异基因对于其他基因表达量的影响, 每个样本选取即变异频率在样本中超过 12% 的基因, 即前 24 个基因 为了使每个样本的基因频率不要太 15

17 低, 这 24 个基因在另外一个样本中超过 5% 的频率才被选取 ( 如基因 A 在组别 0 中频率排在前 24 位, 但是在组别 1 中频率低于 5% 不会被选取 ) 此外, 如果这个基因在两个样本中的变异频率都超过 10% 也会被选取 我们得到了 29 个的基因列表 ( 见表 6) 表 6: 29 个高频变异基因 XIRP2 AHNAK2 ANK2 APOB ARID1A CSMD1 CSMD3 DMD FAT1 FLG HMCN1 LRP1B MALAT1 MLL3 MUC16 MUC17 NEB OBSCN PCLO PIK3CA RYR2 RYR3 SPTA1 SYNE1 TP53 TTN USH2A VHL ZFHX 高频变异基因对其他基因表达量的影响 我们通过 NCBI 和 EBI 数据库分析查找变异次数频率较高的 29 个基因, 有 17 个基因跟代谢综合征相关 例如,PIK3CA 基因是编码 PI3K 蛋白的基因, 该基因调控 IRS-1 底物水平从而调控胰岛素信号通路 ;NEB 基因翻译的蛋白与细胞骨架相关而且是 2 型糖尿病和缺血性心力衰竭中的关键基因 ;CSMD1 基因维持血糖平衡的相关基因, 同时也是潜在的肿瘤抑制因子 ;APOB 和 LRP1B 基因是编码 LDL 和 LDL 受体蛋白的关键基因, 在脂肪运输代谢过程中起到重要作用 ;VHL 基因参与蛋白质泛素化过程, 该基因编码的蛋白能够结合 RNA 聚合酶调控氧化代谢相关基因的转录过程 ;TP53 基因是肿瘤抑制基因, 调控许多细胞活动包括细胞周期 衰老 DNA 修复 代谢水平调节等 通过 Gene Ontology 数据库对 29 个基因进行基因富集, 找到了相关的生物过程如下图所示 : 图 15: 对高频变异基因进行基因富集的结果 由图中发现, 突变频率较高的基因与心脏肌肉收缩 肌肉细胞分化以及心脏细胞收缩调控 ( 钙离子通道 ) 行为相关, 可能与冠心病 动脉粥样硬化疾病相关 得到变异频数较高的变异基因后, 我们用 perl 对于每个基因, 我们在基因变异文件中找到相应的病人编号, 并且从筛选出的基因表达文件 ample.var.0 和 sample.var.1 中找到相应的病人编号, 并且保存到同一个文件中, 剩下的没有此基因变异的病人编号保存到 16

18 另一个文件中 每个变异频率较高的基因都产生了阳性和阴性基因两个文件, 所有在两个样本中总共有 29*2*2 个文件 我们对这些文件中的每一行的基因表达量的均值并且取对数, 然后用阴性的数值减去阳性的数值, 在每个样本中得到 29 个变异频率较高的基因对我们筛选出的重要基因的表达量的影响 图 16 和图 17 为 exp.0.diff.flg 文件 (FLG 为 29 个高频变异基因之一 ) 的前后两部分截图 第一列为基因名称, 第二列为阴性病人 ( 相对应基因没有变异, 这里指 FLG 没有变异 ) 基因表达量的均值取 2 为底的对数, 第三列为对应的阳性病人的数据 ( 处理方法与第二列相同 ), 最后一列为第二列减去第三列的差, 正值表明这个基因的变异之后, 使得第一列的基因表达量下降, 即若此基因正常, 对应基因的表达量比基因变异时更强 负值表明这个基因变异之后第一列的基因表达量上升了, 即若此基因正常, 对应基因的表达量比不让基因变异时强 图 16: FLG 基因变异使部分基因表达量上升 图 17: FLG 基因变异使部分基因表达量下降 为了消除随机性的影响, 我们用哈希表随机给阴性和阳性分配病人编号, 并且对对称 ( 阴性和阳性病人一样多 ) 和不对称 ( 阴性和阳性最多差别 3 倍 ) 都做了多次随机模拟, 发现每次排在两端的基因都不一样, 而且最大值不会超过 0.9 图 18 为某次随机模拟截图 17

19 6.3.3 寻找上下游基因 图 18: 高频变异基因对其他基因表达影响的随机模拟 我们选取阈值为 -1 和 1( 即表达量受基因变异的影响大于两倍 ), 对于在 -1 和 1 范围内的基因, 我们认为高频变异的基因对于这些基因的表达量没有显著影响, 赋予他们数值 0, 对于超过 1 的基因, 赋值 1, 低于 -1 的基因, 赋值 -1 用 perl 把这 29 个变异基因联系起来, 每一行为一个变异基因, 每一列为一个我们筛选出来的重要基因, 生成一个只有 0,1 和 -1 的矩阵 如果有一列基因全部为 0, 那么表明, 这个基因的表达量不会受到这 29 个变异基因的影响, 我们将会删除这些基因 这样, 对于组别 0, 我们得到 254 个相关基因, 对于样本 1, 我们得到 312 个相关基因 因而达到下图中组别 0 的 (matrix.0) 调控矩阵 : 基因调控矩阵 图 19: 调控矩阵 在前文中, 我们已经找到了 20 个高频基因, 通过算法分析最终得出突变高频基因与差异表达基因的调控关系, 其中突变高频基因对差异表达基因分别有促进 (+) 和抑制 (-) 作用 他们总共促进或抑制了 114 个基因, 调控矩阵的拓扑结构如下图 : 18

20 图 20: 调控矩阵的拓扑结构 将这 114 个基因作为一个 的列表 T 对于每个高频基因, 如该基因对于 T 中的某个基因为促进则记该位点为 1, 抑制则记该位点为 -1, 无影响则记为 0, 得到一个 的行向量记为 T 1 总共 20 个行向量按照高频基因排序合并为 的矩阵 M, 此矩阵代表了高频基因对于其它基因的调控情况 将每个人的高频基因变异情况作为一个行向量, 记为 P, 其中, 此人的 20 个高频基因中对应的基因变异次数, 没变异则记为 0. 将这个行向量与矩阵相乘 (P M) 得到此人的基因交互状态向量记为 M1 基因调控矩阵的示意图如图 21: 结果分析 图 21: 调控矩阵 3D 示意图 在基于调控矩阵的基础上, 我们将变异基因数据与调控矩阵相结合, 得到每个个体的基因交互状态向量 M1 在本论文中, 我们认为 M1 状态中每个 stage 的信息可能增强, 同时也可能会使其模式更加紊乱 我们以每个个体 M1 状态为输入, 以样本个体患病程度为标签, 仍然使用复杂树 线性核支持向量机 高斯核支持向量机进行分类, 其结果要稍好于模型一和模型二的结果 19

21 图 22: 组别 0 模型三交叉验证的结果 图 23: 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 图 24: 组别 0 模型三交叉验证的结果 图 25: 组别 0 中方法 1 的混淆矩阵 实例说明 从 29 个高频基因中, 我们选择了胰岛素信号通路中非常关键的蛋白激酶的 PI3K 来举例说明, 在文件中的基因名为 PI3K, 下图是 PIK3CA 对部分基因表达量有重要影响的截图 20

22 图 26: PIK3 对部分基因表达量的影响 从前面 30 个基因我们看到, 在胰岛素信号通路中的基因如 IRS4,MAPK4(ERK), IPCEF1(PIP3), 还有肿瘤坏死因子家族等与代谢综合征相关的基因都受到了 PIK3CA 变异的影响,PIK3CA 的变异使得他们的表达量都上升 肿瘤坏死因子诱导脂肪细胞的凋亡, 通过抑制 IRS1 通路从而促进胰岛素抵抗 第六位为 IRS4 基因,IRS4 的主要作用是抑制 IRS1 和 IRS2 的功能, 和肿瘤坏死因子一样是抑制 IRS1 通路, 而 IRS1/2 的酪氨酸磷酸化激活磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K) 和 Ras-MAPK 信号通路, 二者分别介导胰岛素的能量代谢和生长调节反应 如图 27 对于第 8 位的 MAPK4, 其编码的蛋白 ERK 和之前的肿瘤坏死因子,IRS4 表现为协同作用, 抑制 IRS1 通路 第 12 位为 CRP,CRP 为 C 反应蛋白, 炎症刺激肝脏合成的急性蛋白, 其水平的升高和腰围的增加, 胰岛素抗性, 和高血糖相关联 第 14 位的 HGMA2 在脂肪形成和间质分化中起作用, 在大量的癌症病人中发现高水平的 HGMA2, 特别是和粘液样脂肪肉瘤病人相关 虽然通过此方法, 找到的基因并不一定都是与高频变异基因相关的基因 但是生物体是一个复杂的回路, 不排除可能通过 DNA 与 DNA,DNA 与蛋白质, 蛋白质与蛋白质相互作用间接影响 我们可以通过此方法可以知道, 一个基因的变异会使得很多的基因受直接或间接受到影响 此外, 还可以通过此方法, 寻找一些目前还没有研究透彻的基因通路 21

23 6.3.7 寻找相关基因 图 27: 二型糖尿病基因通路 在生物过程中, 有些基因的有具有相似的功能, 而且共同起作用, 我们对调控矩阵中第一列中的 29 个基因做两两分析, 如果两个基因在 254 或 312 的个基因列表中有超过 10% 的作用相同, 即对超过 10% 的基因有相同的调控作用, 同时为 1 或者 -1 我们认为这两个基因可能有协同作用, 赋予这两个基因值为 1, 意为有可能协同, 若没有, 则为 0 这样我们就得到 29*29 的只有 0 和 1 的协同矩阵 如下图 : 图 28: 协同矩阵 通过对比 NCBI 和 EBI 数据库, 寻找具有协同作用的基因是否在生物意义上具有共同作用 经发现 APOB 基因和 LRP1B 基因,VHL 基因和 CSMD1 基因有共同的作用 因为 APOB 基因编码 LDL 低密度脂蛋白表达, 而 LRP1B 基因编码 LDL 受体蛋白表达, 当 LDL 含量增加, 受体蛋白含量也相应增加, 两者共同完成吸收过多的 LDL 的作用 而 VHL 基因 22

24 和 CSMD1 基因共同抑制基因的表达, 因为 VHL 基因和 CSMD1 均为肿瘤抑制因子, 对于癌症增殖有相同的抑制作用 6.4 模型四 : 基于 变异基因作用网络 的 2- 范数风险预测模型 模型说明 在之前的三个预测模型中, 在已知个体患病的情况下, 我们利用分类模型对其患病状态进行预测, 但以上模型均不能反映未知个体处于各个阶段的的概率 基于此, 我们提出一个基于 变异基因作用网络 的 2- 范数风险预测模型 由于我们未获得健康个体样本, 我们依旧在该个体患病前提下, 预测其处于某阶段的风险, 进一步根据所有变量中对 2- 范数贡献最大的属性找出主要影响因素 理想情况下, 每个 Stage( 患病程度 ) 所对应的基因交互状态向量 M1 在高维空间中应该组内相聚, 组间相离 ( 如图 29); 但根据预测模型三, 由于预测精度较低, 说明 Stage 组间分离效果不是很明显, 呈现出一定的交叉区域 ( 如图 30) 图 29: 高维空间中的组间分离 图 30: 高维空间中的组间交叉 为了简化计算, 我们暂时忽略不同 Stage 之间的交叉区域, 从而我们可以通过样本计算每个 Stage 的中心 当获得新未知个体数据时, 我们通过其与四个中心点的距离去量化患病程度风险 23

25 图 31: 患病程度风险量化示意图 例如, 处于 Stage I 的概率 P 1 可由下述式子计算 : 模型应用 P 1 = 1 s1 1 s1 + 1 s2 + 1 s3 + 1 s4 c (7) 根据前文中所得基因变异状态向量 M1 以及 M1 临近的中心点, 比较其在不同维度 ( 基因 ) 的范数成分, 并由此排序, 取成分最小的几个维度, 因此获得影响导致此状态 M1 患病的主要基因 ; 基于此, 再根据前文所得基因通路与数据库信息找出主要基因对应的代谢综合症症状, 从而确定导致此病患表现型因素 表 7 是从组别 0 的数据中提取的病患 ( 患病程度为 unknown) 的预测分析 24

26 表 7: 对病患的预测分析 某 M1 StageI 中心 范数成分 HPN MGAT4A SLC47A ECHDC SEMA3F LRIG AMOT CDH PVRL ECM ERGIC KIF4B HMGA MFSD2B CDCA CRYL CYFIP MARK ORC1L DFNB 患病程度风险预测 : 通过 变异基因作用网络 的 2- 范数风险预测模型我们得到一个基因列表, 我们通过预测得知, 该病人患 Stage1 的风险较大 基因作用网络 : 从本预测模型得出的与 Stage1 密切相关的基因当中, 有至少一半以上的基因都与代谢综合征相关, 在 NCBI EBI 数据库中搜寻范数成分小于 0.08 的相关基因 ( 共 12 个基因 ), 最终找出有 8 个与 Stage 相关的基因, 如图 32 25

27 图 32: 与代谢综合征相关的基因 例如, 范数成分最低的 HPN 基因与胰腺癌密切相关, 该基因表达翻译丝氨酸蛋白酶, 该蛋白对细胞增殖和细胞形态维持作用有重要作用 ;MGAT4T 基因表达翻译糖基转移酶, 该酶参与葡糖糖转运蛋白 GLUT2 的糖基化过程, 对于葡萄糖运输有重要作用 ; 此外 HPN AMOT CDH2 等基因均与前列腺癌变相关 综上, 通过图中基因信息得知, 该病患的代谢综合征风险与葡萄糖代谢紊乱和胰腺功能损伤前列腺细胞异常等因素密切相关 结果分析 由于我们未获得表观基因组数据 蛋白质组数据 代谢组数据, 并且在转录组数据 基因组数据中并无健康个体数据, 我们无法得知健康个体的基因变异以及表达情况, 也就无法获得基因交互状态向量 M1, 从而无法预测未知个体患病与不患病风险 但在本风险模型中, 添加健康群体信息, 即可预测个体患病与不患病风险 ; 由于样本个体太少, 每个 Stage 群体聚类效果交叉, 无法准确地得到 Stage 中心数据, 因此可能导致潜在的误差 ; 若提高样本数量, 获得更准确的中心数据, 可以提高预测的准确率 ; 在进一步完善模型时, 我们可以进一步将交叉区域与非交叉区域单独分析, 更加准确地描述患病状态 ; 在划分群组时, 忽略了每个 Stage 中 A 型 B 型的差别, 在进一步研究中, 可以将群组细分为 12 个群组, 从而获得更加精确的风险预测 26

28 7.1 模型的评价 模型优点 7 模型的评价 改进及推广 对于不同的数据, 可以建立不同的模型, 进行对不同模型的进行比较 能够用实际科学研究发现来用于佐证模型有效 模型缺点 没有充分利用给定的数据, 对于疾病的划分不够细致 样本数量不够多, 没有直接用生命科学的研究成果来建模 所用方法普适性高, 便于推广 7.2 模型的改进 在变异文件中, 本文中的模型只用到了变异所在基因的信息 但是文件中还包含位点坐标, 变异碱基, 变异类型, 可以根据这些信息进行更为细致的讨论 构建更为复杂的模型 7.3 模型的推广 本文最后的模型是 2- 范数风险预测模型, 使用不同的范数可能会获得更多样的结果 本论文中的绝大多数模型都是基于数据而建立的, 例如根据基因表达量和基因变异, 其基本思想和方法不仅仅可以用于代谢综合征, 可以应用于更多的疾病 27

29 参考文献 [1] 张学工. 关于统计学习理论与支持向量机 [J]. 自动化学报, 2000, 26(01): [2] 丁世飞, 齐丙娟, 谭红艳. 支持向量机理论与算法研究综述 [J]. 电子科技大学学报, 2011, 40(01):2-10. [3] Matej Oresic, Antonio Vidal-Puig. A Systems Biology Approach to Study Metabolic Syndrome[M] [4] Kaur J. A comprehensive review on metabolic syndrome [J]. Cardiology research and practice, 2014, [5].Kahn R, Buse J, Ferrannini E, et al. The metabolic syndrome: time for a critical appraisal Joint statement from the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes[J]. Diabetes care, 2005, 28(9): [6] Alberti K G M M, Zimmet P Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Provisional report of a WHO consultation[j]. Diabetic medicine, 1998, 15(7): [7] Wang G. Raison d etre of insulin resistance: the adjustable threshold hypothesis[j]. Journal of The Royal Society Interface, 2014, 11(101): [8] Wang G. Singularity analysis of the AKT signaling pathway reveals connections between cancer and metabolic diseases[j]. Physical biology, 2010, 7(4): [9] Neel J V. Diabetes mellitus: a thrifty genotype rendered detrimental by progress? [J]. American journal of human genetics, 1962, 14(4): 353 [10] Hales C N, Barker D J P. Type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus: the thrifty phenotype hypothesis[j]. Diabetologia, 1992, 35(7):

30 附录 A.1 肥胖症 (Obesity) A 代谢综合征相关症状 肥胖症是由于人体摄入过多脂肪类物质, 经过长期积累无法代谢造成的 肥胖症会增加胃 肝脏和脂肪组织的氧化代谢压力, 最终引起胰岛素抵抗的血脂障碍和高血压等代谢综合征症状 低高密度脂蛋白 (HDL) 水平是肥胖症的重要判断依据 ( 临床标准 : 男性 <40mg/dL, 女性 <50mg/dL), 中心性肥胖是判断代谢综合征重要的标准之一 ( 临床标准 : 男性腰围 102 厘米, 女性腰围 88 厘米 ), 由肥胖引起代谢综合征的过程如图 33 所示 A.2 Ⅱ 型糖尿病 (Type 2 diabetes) 图 33: 肥胖症 (Obesity) Ⅱ 型糖尿病大多由肥胖 衰老以及不良的生活习惯造成的各个组织细胞对胰岛素的抵抗作用 组织细胞对织细胞胰岛素抵抗将引起肝脏产生过多葡萄糖代谢产物 肌肉组织减少葡萄糖摄入以及脂肪组织向血液分泌过多的自由脂肪酸分子 (Free Fatty Acid) 在早期阶段,beta 细胞将分泌大量胰岛素补偿胰岛素抵抗作用, 即到时血液胰岛素水平极高 ; 当补偿作用失效, 糖分无法被组织细胞摄入, 从而造成高血糖, 同时高血糖和高脂肪酸水平将引起严重的细胞损伤及病变 90% 的糖尿病患者均为 Ⅱ 型糖尿病患者 29

31 图 34: Ⅱ 型糖尿病 (Type 2 diabetes) A.3 高血压 (Hypertension) 高血糖 (Hyperglucomia) 高血脂 (Hyperlipidemia) 血液中的血压 血糖 血脂值是临床判断代谢综合征的主要依据 高血压主要由于血管壁的胆固醇沉积导致的血管堵塞血压增高, 高血糖主要由于糖尿病引起的血糖含量增高, 高血脂是由于脂肪代谢异常导致血液脂肪类含量过高 A.4 动脉粥样硬化 (Atherosclerosis) 动脉粥样硬化是由于脂肪代谢异常导致大量白细胞在血管壁中聚集沉积血液中过量的胆固醇和甘油三酯造成血管堵塞的一种症状, 其原理如图所示 30

32 A.5 脂肪肝 (Fatty liver) 图 35: Ⅱ 型糖尿病 (Type 2 diabetes) 糖尿病 高血压 肥胖 脂肪代谢紊乱和酒精过量摄入均是导致脂肪肝的重要因素 脂肪组织在肝脏大量富集将严重影响肝脏的正常功能, 从而引起一系列的疾病 B.1 #! / u s r / b i n / p e r l w B 数据处理代码 open LIST, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / gene. l i s t ; while ( <LIST >) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; open VAR, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. v a r. 0 ; p o s i t i v e ; while ( <VAR>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; i f ( $var [ 0 ] eq $ d a t a [ 0 ] && $var [ 1 1 ] ne 54) { $ v ar [ 1 1 ] ; 31

33 c l o s e VAR; open EXP, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. i m p o r t a n t. 0 ; my $probe = <EXP>; chomp $probe ; = s p l i t / \ t /, $probe ; f o r ( my $ i =0; $i <= $# Probe ; $ i ++) { i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq p o s i t i v e ) { $ i ; e l s e { $ i ; open Pos, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 0. pos.. $ d a t a [ 0 ] ; open Neg, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 0. neg.. $ d a t a [ 0 ] ; p r i n t Pos " $Probe [ 0 ] \ t " ; f o r e a c h my $item (@Po) { p r i n t Pos " $Probe [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item (@Ne) { p r i n t Neg " $Probe [ $item ] \ t " ; while ( <EXP>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; p r i n t Pos " \ n$exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t Neg " \ n " ; f o r e a c h my $item (@Po) { p r i n t Pos " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item (@Ne) { p r i n t Neg " $exp [ $item ] \ t " ; c l o s e EXP ; B.2 #! / u s r / b i n / p e r l w open EXP, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. exp. 1 ; open INFO, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. i n f. t x t ; 32

34 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; while ( <INFO>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; i f ( $ d a t a [ 3 ] eq 1 ) { i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e I ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e IA ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e IB ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e I I ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e IIA ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e IIB ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e I I I ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e I I I A ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e I I I B ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e IV ) { $ d a t a [ 0 ] ; 33

35 e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq S t a g e IVA ) { $ d a t a [ 0 ] ; e l s i f ( $ d a t a [ 2 ] eq. ) { $ d a t a [ 0 ] ; my $probe = <EXP>; chomp $probe ; c l o s e EXP ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; = s p l i t / \ t /, $probe ; f o r ( my $ i =0; $i <= $# Probe ; $ i ++) { i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; 34

36 e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq { $ i ; e l s i f ( grep { $Probe [ $ i ] eq ) { $ i ; open EXP, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. exp. 1 ; open SI, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. I. 1 ; open SIA, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. IA. 1 ; open SIB, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. IB. 1 ; open SII, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. I I. 1 ; open SIIA, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. IIA. 1 ; open SIIB, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. IIB. 1 ; open S I I I, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. I I I. 1 ; open SIIIA, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. I I I A. 1 ; open SIIIB, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. I I I B. 1 ; open SIV, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. IV. 1 ; open SIVA, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. IVA. 1 ; open UNKNOWN, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. unknown. 1 ; while ( <EXP>) { = s p l i t / \ t / ; p r i n t SI " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t SIA " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t SIB " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t S I I " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t SIIA " $exp [ 0 ] \ t " ; 35

37 p r i n t SIIB " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t S I I I " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t SIIIA " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t S I I I B " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t SIV " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t SIVA " $exp [ 0 ] \ t " ; p r i n t UNKNOWN " $exp [ 0 ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t SI " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item (@PIA) { p r i n t SIA " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item (@PIB) { p r i n t SIB " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t S I I " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t SIIA " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t SIIB " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t S I I I " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t SIIIA " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t S I I I B " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item (@PIV) { p r i n t SIV " $exp [ $item ] \ t " ; 36

38 f o r e a c h my $item (@PIVA) { p r i n t SIVA " $exp [ $item ] \ t " ; f o r e a c h my $item ) { p r i n t UNKNOWN " $exp [ $item ] \ t " ; p r i n t SI " \ n " ; p r i n t SIA " \ n " ; p r i n t SIB " \ n " ; p r i n t S I I " \ n " ; p r i n t SIIA " \ n " ; p r i n t SIIB " \ n " ; p r i n t S I I I " \ n " ; p r i n t SIIIA " \ n " ; p r i n t S I I I B " \ n " ; p r i n t SIV " \ n " ; p r i n t SIVA " \ n " ; p r i n t UNKNOWN " \ n " p r i n t \ n@piiia \ n " ; B.3 #! / u s r / b i n / p e r l w open FILE, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. v a r. 1 ; open FRE, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / v a r. f r e. 1 ; <FILE >; my %hash ; while ( <FILE >) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; $hash { $ d a t a [ 0 ] + + ; f o r e a c h my $keys ( s o r t { $hash { $b<=> $hash { $a keys %hash ) { p r i n t FRE " $keys \ t $ h a s h { $keys \ n " ; B.4 open LIST, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / gene. l i s t ; while ( <LIST >) { 37

39 chomp ; = s p l i t / \ t / ; open POS, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 0. pos.. $ d a t a [ 0 ] ; open NEG, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 0. neg.. $ d a t a [ 0 ] ; open LOG, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 0. d i f f.. $ d a t a [ 0 ] ; <NEG>; <POS>; my %hash ; while ( <NEG>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; my $gene = s h i f ; my $ l i n e = <POS>; chomp $ l i n e ; = s p l i t / \ t /, $ l i n e ; s h i f ; my $pos = &Average ) ; my $neg = &Average ) ; my $ d i f f = $neg $pos ; = ( $neg, $pos, $ d i f f ) ; my $ d a t a _ r e f = ; $hash { $gene = $ d a t a _ r e f ; f o r e a c h my $keys ( s o r t { $hash { $b >[2] <=> $hash { $a >[2] keys %hash ) { my $ d a t a = $hash { $keys ; p r i n t LOG " $keys \ t $ d a t a >[0]\ t $ d a t a >[1]\ t $ d a t a >[2]\ n " ; sub Average { my $sum = 0 ; f o r e a c h my $item (@_) { $sum += $item ; 38

40 my $ a v e r a g e = $sum / ( $#_ +1) ; i f ( $ a v e r a g e == 0) { return 1; my $log = l o g ( $ a v e r a g e ) / l o g ( 2 ) ; B.5 #! / u s r / b i n / p e r l w open LIST, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / gene. l i s t ; open MAT, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / m a t r i x. 0 ; my %m a t r i x 0 ; my %m a t r i x 1 ; while ( <LIST >) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; open LOG0, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 0. d i f f.. $ d a t a [ 0 ] ; open LOG1, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / exp. 1. d i f f.. $ d a t a [ 0 ] ; my %hash0 ; while ( <LOG0>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; i f ( $gene0 [ 3 ] > 1 ) { $hash0 { $gene0 [ 0 ] = 1 ; e l s i f ( $gene0 [3] < 1) { $hash0 { $gene0 [ 0 ] = 1; e l s e { $hash0 { $gene0 [ 0 ] = 0 ; my %hash1 ; while ( <LOG1>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; i f ( $gene1 [ 3 ] > 1 ) { $hash1 { $gene1 [ 0 ] = 1 ; e l s i f ( $gene1 [3] < 1) { 39

41 $hash1 { $gene1 [ 0 ] = 1; e l s e { $hash1 { $gene1 [ 0 ] = 0 ; $ m a t r i x 0 { $ d a t a [ 0 ] = \%hash0 ; $ m a t r i x 1 { $ d a t a [ 0 ] = \%hash1 ; my $ h a s h 0 _ r e f = $ m a t r i x 0 {"TTN" ; f o r e a c h my $key0 ( keys %$ h a s h 0 _ r e f ) { my $ i =0 ; f o r e a c h my $key ( keys %m a t r i x 0 ) { my $ r e f = $ m a t r i x 0 { $key ; $ i += abs ( $ r e f >{$key0 ) ; f o r e a c h my $key ( keys %m a t r i x 0 ) { i f ( $ i ==0) { my $ r e f = $ m a t r i x 0 { $key ; d e l e t e $ r e f >{$key0 ; p r i n t MAT " \ t " ; f o r e a c h my $key0 ( s o r t keys %$ h a s h 0 _ r e f ) { p r i n t MAT " $key0 \ t " ; p r i n t MAT " \ n " ; f o r e a c h my $key ( s o r t keys %m a t r i x 0 ) { p r i n t MAT " $key \ t " ; my $ h a s h 0 _ r e f = $ m a t r i x 0 { $key ; f o r e a c h my $key0 ( s o r t keys %$ h a s h 0 _ r e f ) { p r i n t MAT " $ h a s h 0 _ r e f >{$key0 \ t " ; p r i n t MAT " \ n " ; 40

42 B.6 #! / u s r / b i n / p e r l w open FRE1, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / v a r. p e r. 1 ; open FRE0, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / v a r. p e r. 0 ; open LIST, > >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / gene. l i s t 2 ; my %hash ; while ( <FRE0>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; $hash { $ d a t a [ 0 ] = $ d a t a [ 2 ] ; my $ i = 0 ; my %hash2 ; while ( <FRE1>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; $hash2 { $ d a t a [ 0 ] = $ d a t a [ 2 ] ; $ i ++; l a s t i f ( $i >10) ; my %hash3 ; f o r e a c h my $key ( keys %hash2 ) { i f ( $hash2 { $key >0.123 && $hash { $key >0.05) { $hash3 { $key = $hash { $key + $hash2 { $key ; f o r e a c h my $key ( s o r t { $hash3 { $b<=> $hash3 { $a keys %hash3 ) { p r i n t LIST " $key \ t $ h a s h { $key \ t $ h a s h 2 { $key \ t $ h a s h 3 { $key \ n " ; B.7 #! / u s r / b i n / p e r l w open FILE, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. v a r. 1 ; open FILE2, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. v a r. 1 ; open INFO, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / sample. i n f. t x t ; open TAG, >/ media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / v a r. t a g. 1 ; 41

43 my %i n f o ; while ( <INFO>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; $ i n f o { $ d a t a [ 0 ] = $ d a t a [ 2 ] ; open MERGE, / media / j a y d e n /My F i l e s / f o r m a t / m a t r i x. 0 ; <MERGE>; ; while ( <MERGE>) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; $ d a t a [ 0 ] ; <FILE >; <FILE >; <FILE2 >; my %hash ; f o r e a c h my $item ) { $hash { $item = 0 ; while ( <FILE >) { chomp ; = s p l i t / \ t / ; my $ l i n e = <FILE2 >; chomp $ l i n e ; = s p l i t / \ t /, $ l i n e ; i f ( $ d a t a [ 1 1 ] eq $ d a t a 2 [ 1 1 ] ) { f o r e a c h my $item ) { = s p l i t / \ _ /, $item ; i f ( $ d a t a [ 0 ] =~ / ^ $head [ 0 ] / ) { $hash { $item ++; e l s e { p r i n t TAG " $ d a t a 2 [ 1 1 ] " ; f o r e a c h my $keys ( s o r t ( keys %hash ) ) { p r i n t TAG " \ t $ k e y s " ; p r i n t TAG " \ n " ; p r i n t TAG " $ i n f o { $ d a t a 2 [ 1 1 ] " ; f o r e a c h my $keys ( s o r t ( keys %hash ) ) { 42

44 p r i n t TAG " \ t $ h a s h { $keys " ; p r i n t TAG " \ n " ; undef %hash ; f o r e a c h my $item ) { $hash { $item = 0 ; 43