zh_单克隆抗体及其电荷变体的IEX方法开发_2

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1 [ 应用纪要] 单克隆抗体及其电荷变体的IEX方法开发 Paula Hong, Kenneth J. Fountain, Thomas E. Wheat, Damian Morrison 应用优势 确认单克隆抗体电荷变体的稳定方法 简化方法开发过程并提高可重现性 无需额外制备缓冲液 在整个生产过程中监测生物制药电荷 变体的理想方法 简介 在过去20年中 包括单克隆抗体在内的生物治疗药物的应用发展迅 速 要完整地分析和表征这类复杂的大分子物质 我们必须采用正 交分析技术 离子交换色谱(IEX)技术常被用于电荷异质性生物治疗 药物的分析 由于每种蛋白质都具有独特的电荷分布 因此可以通 过改变pH来调节色谱的选择性 但是 使用该方法进行分离通常分 离度不够且缺乏一致性 从而使得方法开发变得更加困难 为了解 决这些问题 我们开发了一种使用纯净溶液和浓缩储备液的溶剂管 理系统 该系统能够混合四种溶剂以制备和调整色谱流动相 并且 结合了高分离度离子交换色谱柱 可用于开发嵌合单克隆抗体中去 赖氨酸变体的分离方法 弱阳离子交换色谱柱使得我们能够在一系 列pH范围内使用多种缓冲液进行方法开发 以实现这些电荷变体的最 佳分离 本文将通过一种分析嵌合抗体的具体方法来阐述这一点 沃特世解决方案 Protein-PakTM Hi Res IEX色谱柱 ACQUITY UPLC H-Class Bio系统 Auto Blend PlusTM技术 关键词 IEX 单克隆抗体 Protein-Pak Hi Res 赖氨酸变体 1

2 实验 样品描述 : 使用 20 mm 的 MES 缓冲液 (ph=6) 制备含 C 端去去赖氨酸变体的嵌合单克隆抗体样品, 浓 度为 1.25 mg/ml 使用羧肽酶 B(CpB)(Worthington Biochemical Corp., 部件号 LS005304) 裂解 C 端赖氨酸, 酶浓度为 1 mg/ml 混合单克隆抗体(1000 µl,1.25 mg/ml) 和 CpB(12.2 µl,1 mg/ml) 分别在预定的时间间隔 (t= 及 20 min) 处取出 100 L 混合物并将其与冰醋酸 (1.7 L) 混合以终止反应 LC 条件 LC 系统 : 检测器 : 波长 : 采样速率 : 过滤时间常数 : 色谱柱 : 柱温 : 样品温度 : 进样体积 : 流速 : 流动相 A: 流动相 B: 流动相 C: 流动相 D: 清除溶剂和清洗溶剂 : 梯度 : 数据管理软件 : 采用 Auto Blend Plus 技术的 ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统配备钛合金流通池的 PDA 检测器 280 nm 20pt/s 正常 Protein-Pak Hi Res IEX CM, 4.6 x 100 mm, 7 µm ( 部件号 ) 30 C 4 C 10 µl 0.5 ml/min 100 mm 磷酸二氢钠, 或 100 mm MES 一水合物 100 mm 磷酸氢二钠, 或 100 mm MES 钠盐 1000 mm 氯化钠 (NaCl) 水 20 mm 磷酸钠,pH 6.0 或 20 mm MES,pH 6.0 流动相 C 在 60 min 内从 0 增加至 10%(pH 如图所示 ) 采用 Auto Blend Plus 技术的 Empower 2 结果与讨论单克隆抗体的电荷异质性可能是由包括 C 端赖氨酸处理在内的多种结构变化造成的 1 当生物治疗药物具有电荷异质性时, 我们通常会对整个生产过程中的电荷变体进行监测以确保对生产过程的控制 在下面的研究中, 我们开发了一种用于确认和定量分析嵌合单克隆抗体药物中 C 端去去赖氨酸变体的 IEX 方法 该方法的开发是通过在弱阳离子交换色谱柱 (Protein-Pak Hi Res CM, 4.6 x 100 mm, 7 µm) 上调节 ph 和离子强度进行的 我们采用了四元溶液混合系统, 使用弱酸 ( 管路 A) 及其同源碱 ( 管路 B) 调节 ph 缓冲液, 并使用氯化钠 (NaCl, 管路 C) 和水 ( 管路 D) 调节缓冲液的离子强度 以上调节均通过 Auto Blend Plus 技术实施, 该技术能够直接将梯度表示为 ph 和离子强度 操作软件可针对所选缓冲液系统根据已知或测得的 pka 自动计算要达到指定 ph 所需的酸碱百分比 AU AU AU AU AU AU AU AU AU AU min ph 6.0 ph 6.4 ph 6.6 ph 6.8 ph 7.0 图 1. 使用 Protein-Pak Hi Res CM 色谱柱和磷酸钠缓冲液分析嵌合抗体及其 C 端去去赖氨酸变体 分离采用了 Auto Blend Plus 技术,pH 范围为 ph 6.0 ph 6.4 ph 6.6 ph 6.8 ph min 图 2. 使用 Protein-Pak Hi Res CM 色谱柱和 MES 缓冲液分析嵌合抗体及其 C 端去去赖氨酸变体 分离采用了 Auto Blend Plus 技术,pH 范围为

3 我们对比了两种常见的阳离子交换缓冲液 磷酸钠和 MES((N- 吗啉 )- 乙磺酸 ), 研究了这两种缓冲液系统的 ph 效应 ( 图 1 和图 2) 在 ph 的范围内测试了单一的盐浓度梯度 ( 在 60 min 内 mm NaCl) 在磷酸钠缓冲液系统中, 单克隆抗体 () 和 C 端去赖氨酸变体的分离度随 ph 变化而改变 在高 ph 条件下嵌合抗体和去赖氨酸变体会更早地洗脱出来 这是典型的阳离子交换色谱洗脱结果, 蛋白质的总正电荷随 ph 升高而减少, 因此分析物能够在较低的离子强度下被洗脱出来 未被敲除的品种 () 在 3.4 min(ph 6.8 时 ) 至 29.0 min(ph 6.0 时 ) 的保留时间范围内洗脱 ( 表 1), 与该范围对应的 NaCl 浓度范围为 4 mm(ph 6.8 时 ) 至 68 mm(ph 6.0 时 ) ( 表 2) 含 1 个 C 端赖氨酸的变体 () 的抗体也具有类似的趋势 但是, 在相同条件下, 含 2 个 C 端赖氨酸的变体 () 在保留时间和 NaCl 浓度方面的变动则较小 由于变体在 ph 升高时表现出了保留性的差异, 因此与 ph 较低时相比, 当 ph 为 6.8 时, 和 变体之间能够达到更高的分离度 ( 图 1) 流动相 ph 为 7 时, 抗体和电荷变体几乎没有保留 我们使用 MES 缓冲液系统进行相同的研究, 其结果也证实缓冲液组成的确会影响 IEX 分离 与磷酸钠缓冲液系统相似, 在高 ph 条件下, 抗体和电荷变体的保留时间更短 但是,pH 对分离度的影响并不显著 ( 图 2) 总的来说, 与磷酸钠缓冲液系统相比,MES 缓冲液将导致分析物的洗脱时间更长 通过 MES 缓冲液改变 ph 将改变分析物的保留时间, 但选择性不会发生明显变化 这两种缓冲液在保留性方面的差异可归因于缓冲液系统的离子强度不同 MES 缓冲液 保留时间 (min) 磷酸盐缓冲液 ph 表 1. 在 ph 范围内分别使用 MES 和磷酸钠缓冲液系统分离嵌合抗体 () 及其 C 端去赖氨酸变体 ( 和 ) 的保留时间 MES 缓冲液 浓度 (mm) 磷酸盐缓冲液 ph 表 2. 在 ph 范围内分别使用 MES 和磷酸钠缓冲液系统分离嵌合抗体 () 及其 C 端去赖氨酸变体 ( 和 ) 的保留时间所对应的 NaCl 浓度 ( 单位 mm) NaCl 浓度的计算基于 1 min 的梯度保持时间以及 ml 的梯度延迟体积 缓冲液的离子强度取决于氯化钠和缓冲剂所提供的离子总量 对于本实验所用的两种缓冲剂来说, 这一差异主要取决于钠离子的总量 磷酸钠缓冲液系统结合了磷酸盐的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠形式 因此, 当弱酸及其同源碱所占的比例相等时, 该缓冲液可提供三种形式的钠离子 相反,MES 缓冲液系统由 MES 的弱酸形式及其同源钠碱组成 当 MES 缓冲液系统中酸和碱的比例相同时, 该缓冲液可提供与同源碱等摩尔量 (10 mm) 的钠离子 因此, 当 NaCl 的离子强度保持不变, 且两种缓冲剂的浓度和 ph 相同时, 由于磷酸盐缓冲液系统中存在更多的钠离子, 其离子强度会比 MES 缓冲液更大 从离子数量的角度来说,pH 为 6.0 时, 磷酸钠缓冲液系统可为流动相额外提供 22.7 mm 的钠离子, 而 MES 缓冲液系统可额外提供的钠离子仅为 8.9 mm 两种缓冲液所能贡献的离子数量的差异导致抗体和 C 端去赖氨酸变体在磷酸钠缓冲液中更早地被洗脱出来 ( 表 1) 3

4 随着 ph 升高, 与仅能提供 17.8 mm 钠离子的 MES 缓冲液系统相比, 磷酸钠能够提供更多碱形式的钠离子 (ph = 7 时 32.3 mm), 因此, 当 NaCl 浓度一定时, 磷酸钠缓冲液的离子强度更大, 从而进一步导致其保留时间将随 ph 变化而发生更大的改变 ( 表 1) 我们还使用该分离方法进行了峰的确认 为了确认 C 端去赖氨酸变体, 按照之前已发表的方 2,3 案使用羧肽酶 B 处理抗体生物治疗药物, 然后使用 ph 为 6.6 的 MES 缓冲液系统进行分离 除了能够分析洗脱出的较小酸性或碱性变体外, 使用这样的缓冲液条件还可分离抗体和 C 端去赖氨酸变体 我们对反应进行了 20 min 的监测, 在预定的时间点取出等量的样品并将其与乙酸混合以终止反应 对反应的时间进程研究证明了 IEX 方法的重现性以及 和 形态向 形态的转变 在时间进程研究中, 所有主要成分的保留时间 RSD 均小于 0.1%( 表 3) 我们还通过分析峰面积百分比确认了 和 变体向 抗体的转变 在反应的前 2.5 min, 最后洗脱的峰 () 的峰面积百分比下降最为明显 ( 图 3) 在同一时间段内, 和 的峰面积百分比均有所增加 ( 图 3 和图 4) 随后的时间点分析结果表明, 的峰面积百分比继续增加, 而 和 变体的峰面积百分比则持续降低, 并且在 20 min 处几乎检测不到这两种物质 ( 图 3) 这些结果都证明了 和 向 抗体的转变 t = 0 min AU AU t = 2.5 min AU t = 20 min min 图 3. 在 ph 为 6.6 的 MES 缓冲液中使用羧肽酶 B 处理嵌合抗体 20 min 在 以及 20 min 处的分析结果证实了 C 端去赖氨酸变体的存在 4

5 磷酸盐缓冲液 保留时间 (min) N/A N/A N/A 平均值 标准差 %RSD 表 3. 嵌合抗体及其 C 端去赖氨酸变体 IEX 分离的保留时间重现性 使用羧肽酶 B 处理样品, 并按照设定的时间间隔取样进行分析 峰面积 % min 图 4. 使用羧肽酶 B 处理样品的 20 min 内, 不同时间点处嵌合抗体 () 及其 C 端去赖氨酸变体 ( 和 ) 的分析结果 由于存在其它变体, 总的峰面积百分比不等于 100% 5

6 结论为了确保工艺稳定性和实施质量控制, 我们通常都会在整个生产过程中监测生物治疗类单克隆抗体及其 C 端去赖氨酸变体 对于这些电荷变体,Protein-Pak Hi Res CM 色谱柱是分析和确认嵌合抗体及其 C 端去赖氨酸变体的一个有用工具 使用该色谱柱, 结合 ACQUITY H-Class Bio 系统以及 Auto Blend Plus 技术, 可大大简化 ph 筛选过程和多个缓冲液系统的评估过程 嵌合抗体的分析方法开发研究表明, 磷酸钠缓冲液的 ph 会对分析结果产生显著影响, 而该影响在一定程度上取决于缓冲剂的离子强度 相反,MES 缓冲液系统 ph 的改变几乎不会影响分离 四元溶剂混合系统以及 Auto Blend Plus 技术大大简化了我们所进行的所有筛选研究 通过对比分离结果, 我们最终得到了一种可用于分析和确认单克隆抗体及其 C 端去赖氨酸变体的稳定分析方法 参考文献 1. Vlasak,J and Ionescu, Hereterogeneity of Monoclonal Anibodies Revelealed by Charge-Sensitive Methods. Curr. Pham. BioTech., 2008, Walker JM and Winder J S C Terminal Sequence Analysis woith Carboxypeptidase Y. from Protein Protocols Handbook, Ed Walker, JM. Huamna Press Ince, Totowa, NJ. 3. Chen N, Nguyen M, Jacobsen F, Ouyang, J. CEX- HPLC and Imaged cief of Antibodies with Engineered and Upaired Cysteines: from Multiple Main Peaks to One Peak. APPS, Nov 2008 实际应用解决方案 Auto Blend Plus 教程 IEX 技术简报 参考文献 ZH 扫一扫, 关注沃特世微信 Waters,The Science of What s Possible ACQUITY UPLC Auto-Blend Plus Empower 是沃特世公司的注册商标 Protein-Pak 是沃特世公司的商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 2011 年沃特世公司中国印刷 2011 年 3 月 ZH KK-PDF (400)

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