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围磁都
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1 J South Med Univ, 206, 36(5): doi /j.issn 基础研究 SPLUNC 王爽, 李文路, 吕丽春 2 3, 姚开泰南方医科大学基础医学院病理学系, 3 肿瘤研究所, 广东广州 5055; 2 中国人民解放军 458 医院病理科, 广东广州摘要 : 目的探讨人 SPLUNC 基因在人体组织中的表达分布特征方法采用原位杂交方法检测人体 37 种组织中 SPLUNC 基因的细胞学定位结果原位杂交结果显示 :SPLUNC 在上腭表皮食管及食管 - 贲门部的鳞状上皮, 鼻咽部气管宫颈部化生的鳞状上皮及食管和肺的鳞状细胞癌中均不表达 ; 在胃粘膜胆囊空肠结肠子宫内膜及腺体和宫颈部的单层柱状上皮细胞中也不表达 ; 主要表达在鼻咽气管和支气管的假复层纤毛柱状上皮中, 且沿呼吸道从上至下, 该基因表达逐渐减弱, 在肺组织中检测不到其表达在腮腺下颌下腺的导管和浆液腺细胞鼻咽和肺等部位的粘膜下浆液腺细胞胃粘膜固有层壁细胞及乳腺小叶和导管上皮中表达 SPLUNC, 但粘液性腺上皮细胞中不表达此外, 在肺胃结肠乳腺子宫内膜和宫颈等部位的腺癌组织中, SPLUNC 基因均呈强阳性表达结论 SPLUNC 基因的表达具有明显的细胞特异性, 其表达分布特征可能与细胞功能有关关键词 :SPLUNC; 原位杂交 ; 鳞状上皮 ; 柱状上皮 ; 浆液性腺体 Expressions of short palate, lung and nasal epithelium clone in different human tissues WANG Shuang, LI Wenlu, LÜ Lichun 2, YAO Kaitai 3 Department of Pathology, 3 Cancer Research Institute, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 5055, China; 2 Department of Pathology, 458 Hospital of PLA, Guangzhou 50602, China Abstract: Objective To examine the expression patterns of short palate, lung and nasal epithelium clone (SPLUNC) gene in human tissues. Methods In situ hybridization was used to detect the expression of SPLUNC gene in 37 different human tissues. Results We found that SPLUNC gene was not expressed in squamous epithelial cells of the palate, epidermis, esophagus, or the esophagus-cardia junction, metaplastic squamous cells in the nasopharynx, trachea, or uterus cervix, or tumor cells of esophageal squamous cell carcinoma or lung squamous cell carcinoma. SPLUNC gene was not expressed in the single layer columnar epithelia cells in the stomach, gallbladder, jejunum, colon, endometrium, or uterus cervix. SPLUNC expression was detected mainly in pseudostratified columnar epithelial cells in the nasopharynx, trachea and bronchi, and was gradually down-regulated from the upper to lower end of the respiratory tract, but was not detected in the lung tissues. SPLUNC expression was detected not only in the duct and serous gland cells in the parotid and submandibular glands, but also in cells of submucosal serous glands in the nasopharynx and lung, but not in the cells of the mucosal glands. The parietal cells of the gastric submucosa and epithelial cells of the lobula and ducts of the mammary glands expressed SPLUNC. The adenocarcinoma cells in the lung, stomach, colon, mammary gland, uterus endometrium and cervix showed strong expressions of SPLUNC gene. Conclusion SPLUNC expression is highly cell-specific in association with the cell functions. Key words: short palate; lung and nasal epithelium clone ; in situ hybridization; squamous epithelial cells; columnar epithelia cells; serous glands 人上腭肺及鼻咽上皮克隆 (palate, lung and nasal epithelium clone, PLUNC) 家族包含 0 个成员, 该家族成员集中位于 20 号染色体上不到 300 kb 的一段狭窄区 [] 域因该家族所有成员蛋白质结构均含杀菌 / 通透性增强蛋白 (bactericidal/permeability-increasing protein, BPI) 结构域, 因此 PLUNC 家族也被称为含 BPI 折叠结构蛋白家族, 据此也推测该家族成员具有中和内毒素及 [2] 杀菌的作用根据蛋白的相对分子质量,PLUNC 家收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 (872242) Supported by National Natural Science Foundation of China(872242). 作者简介 : 王爽, 博士, 副教授, shuangw@26.com 族被分为含有 5 或 6 个外显子的长片段 PLUNC(long plunc, LPLUNC) 和含有 9 个外显子的短片段 PLUNC (short plunc, SPLUNC) 短片段 PLUNC 基因 (SPLUNC) 也被称为 SPURT LUNX NASG 和 BPIFA, 研究发现 SPLUNC 主要表达在鼻咽及呼吸道 [3-5] 的上皮组织中, 在维持气道表面液体容量及压力以及 [6-8] 上呼吸道的炎症应答中可能发挥重要作用目前, 关于 SPLUNC 基因功能的研究主要集中在呼吸系统疾病中, 但其确切生物学功能及其在人体内表达的精确细胞学定位仍不明确, 因此, 本文采用原位杂交的方法, 检测人体内表达 SPLUNC 基因的细胞类型, 为深入揭示 SPLUNC 基因的调控机制和生物学功能提供依据

68 J South Med Univ, 206, 36(5): 67-62 http://www.j-smu.com 材料和

2 68 J South Med Univ, 206, 36(5): 材料和方法. 材料.. 组织标本收集 2003~2005 年间南方医院和中国人民解放军第 458 医院病理科存档的上腭颌下腺腮腺鼻咽慢性炎气管支气管食管肺胃空肠结肠胆囊前列腺子宫内膜及相应肿瘤组织的石蜡标本, 每种组织选取 5 例不同的病例全部组织标本经 0% 中性福尔马林液固定, 常规石蜡包埋,4 μm 厚切片, 保存备用..2 试剂敏感性加强型原位杂交试剂盒 (MK030) 购自武汉博士德生物工程有限公司 ;DAB 显色试剂盒 (DAB-003) 购自福建迈新生物技术开发有限公司.2 方法.2. 探针设计采用 Primer 5.0 软件设计, 序列为 : 5'-TGTGAGAGATAAGCAGGAGAG-3', 由上海英俊生物公司合成并进行地高辛标记.2.2 原位杂交按试剂盒操作说明进行将石蜡切片常规二甲苯脱蜡至水, 用新鲜配制的 0.5%H 2O 2/ 甲醇溶液处理切片 30 min, 来灭活内源性过氧化物酶 ; 然后将 3% 柠檬酸稀释的胃蛋白酶滴加于切片上,37 消化 30 min 以暴露 mrna 核酸片段 ; 湿盒底部加入 20% 甘油 20 ml, 每张切片上滴加预杂交液,37 孵育 4 h 进行预杂交 ; 滴加 20 μl 杂交液 ( 探针浓度为 8 μg/ml) 于 40 杂交过夜用 37 左右的 2 SSC 0.5 SSC 和 0.2 SSC 液体分别洗涤切片次 ; 切片经封闭液封闭后, 加生物素化鼠抗地高辛液体于 37 孵育 60 min 进行标记 ; 经 SABC-POD 孵育后, 滴加生物素过氧化物酶于 37 孵育 30 min, 用新鲜配置的 DAB 溶液进行显色 ; 苏木素复染, 二甲苯透明后, 中性树胶封固实验中以无探针的预杂交液作为阴性对照.2.3 原位杂交结果判定根据染色结果, 以无色为阴 [9] 性, 以棕黄色或棕褐色为阳性信号 2 结果 2. 鳞状上皮中 SPLUNC 基因的表达原位杂交检测结果显示 : 在上腭表皮鼻咽部化生的鳞状上皮气管部化生的鳞状上皮食管及食管 - 贲门部的鳞状上皮宫颈部化生的鳞状上皮组织中, 全部病例均不表达 SPLUNC 基因 ( 图 A~H) 上腭处的棕色信号定位在鳞状上皮上部的角化层, 为非特异性染色此外, 在选取的食管和肺的鳞状细胞癌组织中, 全部肿瘤细胞也不表达 SPLUNC 基因 ( 图 I J) D E F G H I J 图原位杂交检测 SPLUNC 基因在鳞状上皮细胞及鳞状细胞癌中的表达 Fig. Identification of SPLUNC gene expression in squamous epithelium and squamous cell carcinoma by in situ hybridization. A: Palate (Original magnification: 200); B: Epidermis ( 200); C, D: Metaplastic squamous epithelium in nasopharynx ( 200); E: Metaplastic squamous epithelium in trachea ( 200); F: Metaplastic squamous epithelium in cervix ( 200); G: Esophagus ( 00); H: Junction of esophagus with cardia of stomach ( 200); I: Squamous cell carcinoma of esophagus ( 00); J: Squamous cell carcinoma of lung ( 200).

2 柱状上皮中 SPLUNC 基因的表达在选取的鼻咽部和气管的假复层纤毛柱状上皮细胞中,

2C); 在肺组织中其表达水平显著下降, 在肺泡上皮细胞中 SPLUNC 基因完全不表达

2K L) D E F G H I J K IL 图 2 原位杂交检测 SPLUNC

2 Identification of SPLUNC gene expression in

A and B: Pseudostratified ciliated columnar

in bronchus ( 200); D: Pulmonary alveoli

Gallbladder ( 400); G: Jejunum ( 200); H:

Endometrium ( 200); K: Proliferative phase of

3 J South Med Univ, 206, 36(5): 柱状上皮中 SPLUNC 基因的表达在选取的鼻咽部和气管的假复层纤毛柱状上皮细胞中, 全部病例均显示有 SPLUNC 基因的表达 ( 图 2A B), 阳性信号定位在柱状上皮的胞浆内 SPLUNC 在支气管部的假复层纤毛柱状上皮细胞中也有表达, 但与气管中的表达的程度相比有所减弱 ( 图 2C); 在肺组织中其表达水平显著下降, 在肺泡上皮细胞中 SPLUNC 基因完全不表达 ( 图 2D) 在胃胆囊空肠结肠的粘膜层以及子宫内膜和宫颈部的单层柱状上皮中均不表达 SPLUNC( 图 2E~J) 此外, 无论是在增生期样子宫内膜还是分泌期样子宫内膜组织中,SPLUNC 均呈阴性表达 ( 图 2K L) D E F G H I J K IL 图 2 原位杂交检测 SPLUNC 在柱状上皮细胞中的表达 Fig.2 Identification of SPLUNC gene expression in columnar epithelium by in situ hybridization. A and B: Pseudostratified ciliated columnar epithelium in nasopharynx and trachea (Original magnification: 400); C: Pseudostratified ciliated columnar epithelium in bronchus ( 200); D: Pulmonary alveoli epithelium ( 200); E: Stomach ( 200); F: Gallbladder ( 400); G: Jejunum ( 200); H: Colon ( 200); I: Cervix ( 200); G: Endometrium ( 200); K: Proliferative phase of endometrium ( 400); L: Secretory phase of endometrium ( 400). 2.3 腺上皮中 SPLUNC 基因的表达在腮腺和颌下腺组织中,SPLUNC 在腺导管上皮和浆液性腺细胞中也有阳性表达, 而颌下腺的粘液腺细胞不表达 SPLUNC 基因 ( 图 3A B) 在鼻咽部和肺的腺体中,SPLUNC 表达的阳性信号也定位在浆液性腺体腺泡细胞中 ( 图 3C) 胃粘膜固有层中胃底腺

A: Parotid gland (Original magnification:

Submucosal gland of nasopharynx ( 400); D:

4 Identification of SPLUNC gene expression

adenocarcinoma ( 400); C: Adenocarcinoma of

4 620 J South Med Univ, 206, 36(5): 的壁细胞也存在 SPLUNC 的阳性表达 ( 图 3D) 乳腺小叶的腺泡和导管中均表达 SPLUNC, 但在前列腺的腺体中却不表达 SPLUNC 基因 ( 图 3E F) 此外, 在肺胃结肠乳腺子宫内膜和宫颈等部位的腺癌组织中, 也证实有 SPLUNC 基因的阳性表达 ( 图 4) D E F 图 3 原位杂交检测 SPLUNC 基因在腺上皮细胞中的表达 Fig.3 Identification of SPLUNC gene expression in glandular epithelium by in situ hybridization. A: Parotid gland (Original magnification: 200); B: Submandibular gland ( 400); C: Submucosal gland of nasopharynx ( 400); D: Stomach ( 200); E: Mammary gland ( 200); F: prostate ( 200). D E FI 图 4 原位杂交检测 SPLUNC 基因在腺癌中的表达 Fig.4 Identification of SPLUNC gene expression in well-differentiated adencarcinoma tissue by in situ hybridization. A: Adenocarcinoma of lung (Original magnification: 200); B: Gastric adenocarcinoma ( 400); C: Adenocarcinoma of colon ( 200); D: Breast cancer ( 200); E: Endometrialadenocarcinoma ( 400); F: Adenocarcinoma of uterine cervix ( 200). 3 讨论一个基因在某一生理过程中的表达变化往往对其功能有重要提示作用已有多个研究小组采用 cdna 微阵列杂交或 RT-PCR 方法对 SPLUNC 基因的表达水平进行了研究, 并在此基础上推测了 SPLUNC 基因的功能 [0-] 但这些报道所选用的研究材料均为组织块 (block), 组织

5 J South Med Univ, 206, 36(5): 块是由各种类型的上皮细胞成纤维细胞以及炎细胞等多种细胞成份构成的混杂体, 因此, 从组织块中提取的 RNA 所进行的后续研究不能特异地展示某一类型细胞中的表 [2] 达情况, 不可避免地会导致结果存在误差虽然 Zhou [3] 等通过自制抗体, 结合免疫组织化学方法检测了 SPLUNC 蛋白的组织学分布模式, 但由于受组织材料选材的限制, 研究结果也存在一定的局限性因此, 我们收集了人体 37 种组织, 采用原位杂交的方法, 检测 SPLUNC 基因的表达情况, 以期能更全面而准确的分析 SPLUNC 基因在人体主要上皮组织中的表达分布特征本研究结果发现, 在鼻咽气管部的假复层纤毛柱状上皮表达 SPLUNC, 在支气管的假复层纤毛柱状上皮中也有一定程度的 SPLUNC 表达, 但较气管中的表达减弱 ; 在肺泡中检测不到 SPLUNC 的表达, 这些研究 [4] 结果与以往的研究结论相一致此外, 我们发现在唾液腺乳腺等部位的导管上皮和浆液性腺上皮细胞以及胃固有层中的壁细胞中也存在 SPLUNC 的表达, 而粘液腺细胞不表达 SPLUNC 基因, 说明 SPLUNC 的表达可能与这些腺上皮的蛋白质分泌功能有关我们还发现在上腭和食管被覆的鳞状上皮细胞中不表达 SPLUNC 基因, 甚至在鼻咽气管和宫颈部鳞状上皮化生的细胞, 以及食管和肺鳞状细胞癌的肿瘤细胞中也不表达 SPLUNC, 说明 SPLUNC 表达具有明显的细胞特异性, 其特异地表达在呼吸道假复层纤毛柱状上皮以及导管上皮和浆液性腺上皮中, 而不表达于鳞状细胞起源的组织,SPLUNC 在不同类型细胞中的表达差异可能与该类型细胞的特定功能有关, 这一结果提示 SPLUNC 基因的表达可能是一个与分化有关的基因, 它的正确表达受到复杂而精密的调控程序控制, 转录调控机制的研究将对其功能的全面揭示具有重要意义, 值得深入研究然而, 既往采用组织块进行研究的结果显示,SPLUNC 在鼻咽部鼻咽癌及肺鳞癌中 [5-6] 均有所表达, 与我们的研究结论不一致 ; 由于我们的研究证实鼻咽和肺等部位粘膜下的浆液腺细胞中也存在 SPLUNC 的阳性表达, 我们推测这些研究结论的差异可能是由组织块中混杂的腺体等其他组织成分造成的, 因此, 采用原位杂交或免疫组化方法能更加准确地研究基因 / 蛋白的表达分布特征, 避免组织块中多种细胞成份混杂所导致的误差出现除此之外, 我们还发现, 在胃粘膜肠粘膜宫颈及子宫内膜等部位的单层柱状上皮也不表达 SPLUNC, 而在胃结肠宫颈及子宫内膜等腺癌组织中 SPLUNC 呈阳性表达, 这提示 SPLUNC 很可能是这些肿瘤的潜在标志物之一, 具有潜在的诊断价值, 值得进一步研究总之, 我们通过原位杂交的方法对 SPLUNC 基因的表达进行了精确的细胞学定位研究, 为进一步探讨该基因的表达调控机制和生物学功能奠定了良好的基础, 也为肿瘤的诊断和治疗提供了新的理论依据参考文献 : [] Bingle CD, Leclair EE, Havard S, et al. Phylogenetic and evolutionary analysis of the PLUNC gene family[j]. Protein Science, 2004, 3(2): [2] Beamer LJ. Structure of human BPI (bactericidal/permeabilityincreasing protein) and implications for related proteins [J]. Biochem Soc Trans, 2003, 3(Pt 4): [3]Garcia-Caballero A, Rasmussen JE, Gaillard E, et al. SPLUNC regulates airway surface liquid volume by protecting ENaC from proteolytic cleavage[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 06(27): [4] Gakhar L, Bartlett JA, Penterman JA, et al. PLUNC is a novel airway surfactant protein with Anti-Biofilm activity[j]. PLoS One, 200, 5(2): e9098. [5] Mcgillivary G, Bakaletz LO. The multifunctional host defense peptide SPLUNC is critical for homeostasis of the mammalian upper airway[j]. PLoS One, 200, 5(0): e3224. [6] Bingle L, Barnes FA, Cross SS, et al. Differential epithelial expression of the putative innate immune molecule SPLUNC in Cystic Fibrosis[J]. Respir Res, 2007, 8: 79. [7] Tsou YA, Lin CD, Chen HC, et al. Interleukin-3 inhibits Lipopolysaccharide-Induced BPIFA expression in nasal epithelial cells[j]. PLoS One, 205, 0(2): e [8] Leeming GH, Kipar A, Hughes DJ, et al. Gammaherpesvirus infection modulates the temporal and spatial expression of SCGBA (CCSP) and BPIFA (SPLUNC) in the respiratory tract [J]. Lab Invest, 205, 95(6): [9] 徐小艳, 刘红伟, 姜黄, 等. 联合检测细胞蜡块中的 napsin A 和甲状腺转录因子 - 有助于肺腺癌胸水的诊断 [J]. 南方医科大学学报, 205, 35(): [0]Bingle CD, Bingle L. Characterisation of the human plunc gene, a gene product with an upper airways and nasopharyngeal restricted expression pattern[j]. Biochim Biophys Acta, 2000, 493(3): []Zhang B, Nie X, Xiao B, et al. Identification of tissue-specific genes in nasopharyngeal epithelial tissue and differentially expressed genes in nasopharyngeal carcinoma by suppression subtractive hybridization and cdna microarray[j]. Genes Chromosomes Cancer, 2003, 38(): [2]Donnem T, Lonvik K, Eklo K, et al. Independent and tissuespecific prognostic impact of mir-26 in nonsmall cell lung cancer: coexpression with vascular endothelial growth factor-a predicts poor survival[j]. Cancer, 20, 7(4): [3]Zhou HD, Fan SQ, Zhao J, et al. Tissue distribution of the secretory protein, SPLUNC, in the human fetus[j]. Histochem Cell Biol, 2006, 25(3): [4] Di YP, Harper R, Zhao Y, et al. Molecular cloning and characterization of spurt, a human novel gene that is retinoic acid-inducible and encodes a secretory protein specific in upper respiratory tracts[j]. J Biol Chem, 2003, 278(2): [5] 何志巍, 谢鹭, 许亮国, 等. 一个与人鼻咽癌相关新基因的克隆 [J]. 科学通报, 2000, 45(): [6]Iwao K, Watanabe T, Fujiwara Y, et al. Isolation of a novel human lung-specific gene, LUNX, a potential molecular marker for detection of micrometastasis in non-small-cell lung cancer[j]. Inte J Cancer, 200, 9(4): ( 编辑 : 经媛 )

第猿猿卷第愿期 20 员猿年愿月张媛媛等院肥胖与雌激素的相互关系及其对子宫的作用研究原员远员原素等多种原因有关袁对于女性而言绝经后雌激素水平下降是更年期肥胖

第猿猿卷第愿期 20 员猿年愿月张媛媛等院肥胖与雌激素的相互关系及其对子宫的作用研究原员远员原素等多种原因有关袁对于女性而言绝经后雌激素水平下降是更年期肥胖原员远原南京医科大学学报渊自然科学版冤 ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING 渊 Natural Science 冤第猿猿卷第愿期 20 员猿年愿月肥胖与雌激素的相互关系及其对子宫的作用研究张媛媛袁张日华袁薛一袁刘梦兰袁黄琼袁