Optimization of midazolam dosage as CYP3A probe substrate and its pharmacokinetics in rats QIN Xiao-ling 1,2, DUAN Wen-hai 1,2, XUE Xin-ping 2, CHEN X
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1 CYP3A 探针底物咪达唑仑在大鼠体内的非线性药动学过程及剂量优化 覃小玲 1,2 1,2, 段文海, 薛新平 2 3 2, 陈孝, 黄民, 毕惠嫦 (1. 广东食品药品职业学院, 广东广州 ;2. 中山大学药学院药物代谢与药动学实验室, 广东广州 ;3. 中山大学附属第一医院, 广东广州 ) 2* 摘要 : 本文通过考察灌胃给予不同剂量咪达唑仑在大鼠体内的药动学变化, 从而确定咪达唑仑作为 CYP3A 探针药在大鼠体内的最佳剂量范围 雄性 SD 大鼠分别灌胃给予 和 20 mg kg -1 的咪达唑仑, 在预定的时间点从右颈静脉插管处取血, 血样处理后进行 LC-MS/MS 分析 结果表明, 在 1~5 mg kg -1 剂量范围内, 咪达唑仑及代谢物 1 - 羟基咪达唑仑在大鼠体内的 C max 及 AUC 随着剂量的增加而呈线性增长 (r > 0.99), 但当咪达唑仑的剂量达到 15 mg kg -1 时, 咪达唑仑在大鼠体内的血药浓度呈非线性增加 咪达唑仑的 AUC/Dose 值在 1~10 mg kg -1 剂量内, 未见显著性差异 (P>0.05); 但 15 及 20 mg kg -1 剂量组的 AUC/Dose 值与 1 mg kg -1 剂量组的相比存在统计学差异 (P<0.05) 在 10~20 mg kg -1 剂量内, 由于咪达唑仑的镇静作用, 实验过程中大鼠处于昏睡状态 ( 无翻转现象 ) 因此, 咪达唑仑作为 CYP3A 探针药时, 建议其大鼠灌胃剂量在 1~5 mg kg -1 内为宜 关键词 : 咪达唑仑 ; 细胞色素 P450 3A; 药代动力学 ; 剂量优化 ; 探针底物 中图分类号 :R943 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 广东食品药品职业学院自然科学基金资助项目 (2014YZ008). 通讯作者 :Tel: ,Fax: , bihchang@mail.sysu.edu.cn 1
2 Optimization of midazolam dosage as CYP3A probe substrate and its pharmacokinetics in rats QIN Xiao-ling 1,2, DUAN Wen-hai 1,2, XUE Xin-ping 2, CHEN Xiao 3, HUANG Min 2, Bi Hui-chang 2 * (1. Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou , China; 2. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou , China; 3. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou , China) Abstract: The study aimed to evaluate the pharmacokinetics of midazolam (MDZ) after different oral dosage to rats, and determine the optimum oral dosage of MDZ used as CYP3A probe substrate in vivo. Male Sprague-Dawley rats were received a single oral dosages of MDZ at 1, 2, 5, 10, 15 or 20 mg kg -1. Plasma concentrations of MDZ and its major metabolite 1-hydroxyl midazolam (1-OH MDZ) at different time points were determined using a validated LC-MS/MS method. Pharmacokinetic parameters were calculated using non-compartmental model. The C max, AUC 0-t and AUC 0- of MDZ and 1-OH MDZ were linearly increased over the dose range of 1-5 mg kg -1 (r>0.99), but not at the dose of 15 or 20 mg kg -1. The AUC/Dose at 1-10 mg kg -1 were no significant different, but that of 15 or 20 mg kg -1 were significantly higher. No significant sedative reaction was observed in all the rats of dosage 1-5 mg kg -1, however loss of righting reflex was observed in rats receiving dosage of mg kg -1. In conclusion, the optimized oral dose of MDZ was 1-5 mg kg -1 when MDZ is used as the CYP3A probe substrate in rats. Key words: Midazolam; CYP3A; pharmacokinetics; dosage optimization; probe substrate 2
3 细胞色素 P450 酶系 (cytochrome P450,CYP450) 在体内药物代谢中起着 至关重要的作用 临床上, 有 90% 以上的药物经过 CYP450 酶 ( 包括 CYP1A CYP2B CYP2C CYP2D 和 CYP3A ) 代谢, 其中约 50% 的药物经 CYP3A 代 谢 [1, 2] 近年来, 几种 CYP3A 的底物常被用来作为 探针 研究其他药物或食 物等对 CYP3A 活性的影响 最常用的有 14C 红霉素 [3, 4] 咪达唑仑 [5-8] 阿芬太 [9, 尼 10] [11] 硝苯地平等 咪达唑仑, 一种短效的苯二氮䓬类镇静催眠药物, 口服 后主要大部分经 CYP3A 代谢 ( 其代谢产物主要为 1 - 羟基咪达唑仑, 小部分为 4 - 羟基咪达唑仑及 1,4- 羟基咪达唑仑 ), 并且不是 P-gp 的底物, 因此咪达唑仑 是体内及体外研究药物或食物对 CYP3A 活性影响的理想探针之一 [12-14] 咪达唑仑作为 CYP3A 体内探针药时, 其给药剂量应该如何选择呢? 目前尚 [15] 未见有相关报道 Xue 等曾报道常用的护肝中药制剂五酯片 ( 华中五味子的 乙醇提取物制剂 ) 对低剂量及高剂量环孢素 A( 为 CYP3A 及 P-gp 的底物 ) 的影 响, 结果表明五酯片对降低剂量环孢素 A 的血药浓度及药代动力学参数影响更 为显著 可见, 探针药浓度的选择有可能会影响实验结果 因此, 本研究旨在考 察不同剂量咪达唑仑在大鼠体内的药动学及大鼠生理状态变化, 从而确定咪达唑 仑作为大鼠体内 CYP3A 探针药时的最佳剂量范围 实验材料与方法 药品与试剂 咪达唑仑 (midazolam, MDZ,5 mg 1 ml/ 支, 江苏恩华 药业股份有限公司, 批号 : ); 肝素钠注射液 ( 常州千红生化制药股份 有限公司, 批号 :090625);PE 插管 (Polythene 0.98 mmod, 浙江安莱科技有 限公司 ), 实验中所用试剂均为色谱纯 实验动物 清洁级雄性 Sprague-Dawley(SD) 大鼠 24 只,200~240 g, 由 中山大学实验动物中心提供 ( 合格证号 :SCXK( 粤 ) ), 于 SPF 级环境饲养, 动物室内温度 20~25 相对湿度 40%~70% 换气次数 10~15 次 /h, 保持 12 h 光照循环 ; 期间自由饮水进食, 提供实验室标准动物饲料, 符合我国 实验动物管理条例 和 医学实验动物管理实施细则 实验前禁食 12 h, 自由饮水 3
4 灌胃给予不同剂量的咪达唑仑在大鼠体内的药动学研究 SD 大鼠在给药 前一天行右颈静脉插管手术 [16-18] 大鼠用乙醚轻度麻醉后, 剃毛, 暴露右颈术野, 作一约 5 mm 切口 钝性分离出右颈静脉, 结扎远心端后作一小切口, 插入外径为 0.98 mm, 内径为 0.56 mm 的 PE 管后结扎固定, 导管经颈背部皮下穿出, 确保血流通畅后, 固定于后背上, 术后恢复 12 h 后用于实验, 给药前 12 h 禁食 将手术后的大鼠随机分成 6 组, 分别灌胃给予不同剂量的咪达唑仑 ( 和 20 mg kg -1 ), 并于给药前 (0 h) 给药后 和 4 h 从右颈静脉插管处取血约 0.25 ml, 取血后即从插管处补充同体积的肝素化生理盐水 ( 含 50 U ml -1 肝素的生理盐水 ), 所取血样 r min -1 离心 10 min, 立即精密吸取上清 100 μl 置 2 ml EP 管中, 置 -80 保存 血样按我们建立的 LC-MS/MS 方法检测血浆中咪达唑仑 1 - 羟基咪达唑仑的浓度 [19], 并用 PKPP 药动学软件包计算药代动力学参数 [16-18] 统计学分析 采用方差分析及非参数检验,P < 0.05 有统计学意义 数据 处理软件为 SAS 8.1(SAS Ver.8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 统计学软件 结果 1 咪达唑仑在大鼠体内的药动学参数单次灌胃不同剂量咪达唑仑在大鼠体内的药动学的影响药时曲线图见图 1, 药动学参数的改变见表 1 4
5 Figure 1 Plasma concentration-time profiles of midazolam (MDZ, A) and 1-OH MDZ (B) after oral administration of different doses of MDZ in rats. n=4, x ± s 2 咪达唑仑在大鼠体内的药动学参数比值分析 在 1~5 mg kg -1 剂量内, 咪达唑仑及 1 - 羟基咪达唑仑在大鼠体内的 C max AUC 0-4h 及 AUC 0- 随着剂量的增加而呈线性增长 (r>0.99)( 图 2), 但当咪达唑仑 的剂量为 15~20 mg kg -1 时, 咪达唑仑在大鼠体内的血药浓度呈非线性增加 以 1 mg kg -1 组的 C max 为基准, 各剂量组的 C max 除以 1 mg kg -1 组的 C max 值, 得到 的比值为 1.0: 1.9: 7.5: 20.5: 37.9: 67.0, 而各组间给药剂量的比值为 1: 2: 5: 10: 15: 20, 表明在 1~5 mg kg -1 剂量内咪达唑仑的 C max 与其给药剂量成比例增加 将 1~5 mg kg -1 剂量内咪达唑仑的 C max AUC 0-4h 与灌胃给药剂量进行线性回归, 得到的 r 值分别为 及 , 而其代谢产物 1 - 羟基咪达唑仑的 C max AUC 0-4h 对 给药剂量进行线性回归后, 其 r 值分别为 及 9988( 图 2) 5
6 Figure 2 Linear regression profiles of C max and AUC of MDZ (A) and 1-OH MDZ (B) after oral administration of 1, 2, 5 mg kg -1 dose of MDZ in rats 和 20 mg kg -1 剂量组咪达唑仑的 AUC/Dose 值依次分别为 10.2± ± ± ± ±20.6 (P<0.05) 和 30.8±12.0 (P<0.05) ( 表 1) 在 1~10 mg kg -1 剂量内, 咪达唑仑的 AUC/Dose 值未见显著性差异 (P>0.05); 但 15 和 20 mg kg -1 这两个剂量组上述药动学参数与 1 mg kg -1 剂量 组相比存在统计学差异 (P<0.05) 1~20 mg kg -1 剂量组间咪达唑仑的 t max 及 MRT 无统计学差异 (P>0.05) 讨论 体内实验时, 相关代谢酶探针药物的剂量往往会影响相应的实验结果, 因此有必要明确药物代谢酶的探针药物用于体内研究时所用的适宜剂量, 以有效灵敏地反映化合物对该代谢酶的作用 本实验考察并确定咪达唑仑作为大鼠体内 CYP3A 探针底物使用时的最佳剂量范围, 对研究药物或食物与 CYP3A 代谢酶的相互作用有着重要意义 本实验通过评价单次灌胃给予不同剂量的 CYP3A 经典探针药 咪达唑仑的药动学变化 生理变化从而优化其给药剂量范围 实验结果表明 :1~5 mg kg -1 6
7 剂量内咪达唑仑及其代谢物 1 - 羟基咪达唑仑的血药浓度呈线性增加 (r>0.99); 而 当剂量增加至 15~20 mg kg -1 时, 咪达唑仑的血药浓度呈非线性增加 咪达唑仑高 剂量组 (15~20 mg kg -1 ) 这种非线性药动学过程提示 : 灌胃给予高剂量的咪达唑 仑, 很可能由于瞬时浓度太高, 远远超过了肠道及肝脏 CYP3A 对咪达唑仑的代 谢能力, 使得其首过效应减小, 从而使得高剂量 (15~20 mg kg -1 ) 咪达唑仑的血 药浓度 ( 等剂量化后 ) 远远高于其低剂量 (1~5 mg kg -1 ) 给药时的血药浓度 此 [20] 外, 有文献使用 10 mg kg -1 的咪达唑仑作为 CYP3A 的抑制剂考察其对沙奎那韦 (saquinavir) 药动学的影响, 提示 10 mg kg -1 的咪达唑仑对 CYP3A 有抑制作用 因此, 当咪达唑仑作为体内 CYP3A 的探针药物时, 若其给药剂量大于 10 mg kg -1, 很可能由于瞬时酶饱和作用及咪达唑仑的自身抑制作用从而掩盖了抑制剂对 CYP3A 的部分抑制作用 据以往文献报道, 当选取咪达唑仑做为探针底物研究药物对大鼠体内 CYP3A 酶活性影响时,15~20 mg kg -1 为研究者经常选择的咪达唑仑剂量范围 [5-8] 但是, 当作者研究中药制剂五酯片对 CYP3A 的作用机制时, 结果显示五酯片仅 使高剂量咪达唑仑 (CYP3A 底物, 给药剂量为 15 mg kg -1 ) 及地高辛 (P-gp 底物, 给药剂量为 0.25 mg kg -1 ) 的 AUC 升高 34% 及 49%, 明显低于作者之前的研究结果 : 五酯片可使他克莫司 (CYP3A 及 P-gp 的底物 ) 血药浓度升高 2 倍 [17] 此外, 在实 验当中我们观察到当咪达唑仑的灌胃给药剂量达到 10 mg kg -1 时, 由于其强的镇 静作用, 实验过程中大鼠处于昏睡状态 ( 大鼠无翻转现象 ), 提示高剂量的咪达 唑仑有可能也会影响大鼠的生理状态进而影响大鼠体内的 CYP3A 的活性 考虑 到高浓度的咪达唑仑 ( 大于 10 mg kg -1 ) 可能对 CYP3A 活性存在抑制作用 酶饱 和现象及可能改变大鼠生理状态, 从而掩盖了五酯片对 CYP3A 的部分抑制作用 因此, 作者对咪达唑仑的剂量进行了优化, 进一步考察了五酯片对低剂量咪达唑 仑 ( 给药剂量为 2 mg kg -1 ) 药动学的影响, 结果表明五酯片使低剂量咪达唑仑的 AUC 升高 112% 这一结果进一步提示 : 高剂量的咪达唑仑可能由于其镇静作用 改变了大鼠的生理状态及对 CYP3A 酶存在瞬时酶饱和现象 自身抑制作用, 从 而减弱了五酯片对 CYP3A 的抑制作用 在动物体内研究药物相互作用时, 许多因素如底物及底物剂量的选择会影 响到实验结果的准确性 比如, 高剂量的咪达唑仑可能会影响酶的活性及改变动 7
8 物的生理状态从而掩盖化合物对 CYP3A 的抑制作用 因此, 要充分考虑药物剂量对机体各方面因素的影响, 选择不影响机体的生理状况而又能满足含量测定需要的最佳剂量或剂量范围, 以更好地考察及区分抑制剂或诱导剂对药物代谢酶的作用及其作用的强弱 综上, 当选用咪达唑仑作为 CYP3A 探针药在大鼠体内研究药物相互作用时, 建议咪达唑仑的灌胃剂量设计在 1~5 mg kg -1 内 References [1] Guengerich FP. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1999, 39: [2] Shimada T, Yamazaki H, Mimura M, et al. Interindividual variations in human liver cytochrome P-450 enzymes involved in the oxidation of drugs, carcinogens and toxic chemicals: studies with liver microsomes of 30 Japanese and 30 Caucasians [J]. J Pharmacol Exp Ther, 1994, 270: [3] Paine MF, Wagner DA, Hoffmaster KA, et al. Cytochrome P450 3A4 and P-glycoprotein mediate the interaction between an oral erythromycin breath test and rifampin [J]. Clin Pharmacol Ther, 2002, 72: [4] Salvat C, Mouly S, Rizzo-Padoin N, et al. The [14C-N-methyl]-erythromycin breath test dosimetry complies with the French regulations for radiation safety [J]. Fundam Clin Pharmacol, 2003, 17: [5] Kurosawa S, Uchida S, Ito Y, et al. Effect of ursodeoxycholic acid on the pharmacokinetics of midazolam and CYP3A in the liver and intestine of rats [J]. Xenobiotica, 2009, 39: [6] Lai L, Hao H, Wang Q, et al. Effects of short-term and long-term pretreatment of Schisandra lignans on regulating hepatic and intestinal CYP3A in rats [J]. Drug Metab Dispos, 2009, 37: [7] Matsuda K, Nishimura Y, Kurata N, et al. Effects of continuous ingestion of 8
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11 附表 Table 1 Pharmacokinetic parameters of MDZ and 1-OH MDZ after oral administration of different doses of MDZ in rats. n=4, x ± s. *P<0.05 vs AUC 0-4h /Dose of MDZ at 1 mg kg -1 Dose / mg kg -1 Parameters of MDZ and 1-OH MDZ C max /ng ml -1 t max / h t 1/2 / h MRT / h AUC 0-4h AUC 0- / /ng h ml -1 ng h ml -1 AUC 0-4h/Dose of MDZ MDZ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±20.6* ± ± ± ± ± ± ±12.0* 1-OH MDZ 1 3.3± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±3.8 11
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