转录组暗物质 ——lncRNA和circRNA解析

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淹任
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1 靶向测序的数据分析及应用技术部

2 AmpliSeq Ampli + Seq

3 AmpliSeq 技术优势人类外显子组只占人类基因组长度的约 1% 由 DNA 变异引起的疾病估计有 85% 以上来自于外显子组区域的变异 WES vs WGS:60M vs 3G 覆盖度更深数据准确性更高, 更简便经济高效

4 AmpliSeq 技术优势 Disease Panel & Gene List 高灵活性 : 可以针对自己感兴趣的基因候选染色体区域或者依赖大量的前期研究成果来进行更具针对性的测序 ; 高可靠性 : 由于测序区域相对较小, 可以通过更高的深度测序保证变异检出的准确性 ; 低费用 : 只针对基因组小部分区域进行测序, 因此测序成本相对较低 ; 高通量 : 更适合大样本量的研究

5 靶向测序流程捕获目标区域测序结果报告 BRAC 高频突变建库 NovelBrain 云平台数据分析

6 靶向富集方式比较杂交靶向富集 PCR 靶向富集杂交靶向富集 PCR 靶向富集共性操作简便, 成本低, 通量高区别捕获均一度稍差, 目标区域边界模糊, 不同区域的结合效率稍有差异灵活选择 : 常规 & 超高多重, 高特异性, 高覆盖范围, 高度测序一致性, 高灵敏度

7 靶向富集方式比较 TSS 基因结构 PCR 捕获杂交捕获

8 Ampliseq 设计 Gene & SNP Target Gene: 7 amplicons Target SNP: 2 amplicons UTR CDS SNP/indel

9 Mutant & Cancer Colon cancer 结直肠癌 96% 的靶向治疗 ( 西妥昔单抗和帕尼单抗 ) 耐药发生与 KRAS,NRAS,BRAF,EGFR 的突变相关 ; EGFR 胞外结构域的变体 (s492r) 提示患者会对西妥昔单抗治疗产生抗性, 对帕尼单抗治疗则不然 ; APC 和 TP53 突变可用于监测肿瘤进展 Breast cancer 乳腺癌是一种异质性的复杂疾病, 不同的亚型有不同的驱动基因和生物标志物 ; ESR1 基因突变可预测激素治疗耐受情况 ; ERBB2 突变与抗 ErbB2 治疗敏感性相关 ; PIK3CA 和 TP53 突变是监测肿瘤进展的重要生物标记物

10 基于 Ion AmpliSeq 技术肿瘤检测试剂盒 Oncomine Cancer Panels DNA 基因突变检测 RNA 表达量 / 融合基因检测 Oncomine Solid Tumor Kits ( 实体瘤,22 DNA+4 RNA) 肿瘤热点突变检测 : 50 个基因肿瘤基因表达检测 :50 个基因 Oncomine TM Focus Assay (52 基因 ) 结肠癌 / 肺癌热点检测 :22 个基因凋亡基因表达检测 :267 个基因 Oncomine TM Comprehensive Assay (143 基因 ) AML 检测 :19 个基因肺癌融合基因检测 :ALK RET ROS1 NTRK Oncomine TM cfdna lung Assay (11 基因 ) 综合肿瘤试剂盒 : 409 个基因全基因表达量检测 :2 万个基因, 包含部分 ncrna 乳腺癌 / 卵巢癌试剂盒 :BRCA1/2 TP53 检测试剂盒 :TP53 全外显子组检测 :2 万个基因

Oncomine 实体肿瘤突变检测试剂盒 Oncomine Solid Tumor Kit 检测 22 个基因的 DNA 水平突变和 4

个和肿瘤密切相关的基因, 这些基因都明确关联肿瘤治疗药物并且有已发表的临床方案证据的支持 Oncomine Comprehensive

能够通过一种简单的流程同时检测 hotspots, SNVs, indels, CNVs, 和 gene fusions

11 Oncomine 实体肿瘤突变检测试剂盒 Oncomine Solid Tumor Kit 检测 22 个基因的 DNA 水平突变和 4 个基因的 RNA 融合肺癌和结肠癌已获得 CE-IVD 机构的认证 Oncomine Focus Assay: 检测 52 个和肿瘤密切相关的基因, 这些基因都明确关联肿瘤治疗药物并且有已发表的临床方案证据的支持 Oncomine Comprehensive Assay: 检测 143 个肿瘤相关基因, 这些基因关联已发布或正在发布的临床试验结果支持全面优化的解决方案, 具有明显优势 : 能够通过一种简单的流程同时检测 hotspots, SNVs, indels, CNVs, 和 gene fusions 每次运行仅需少量样本非常实用临床上珍贵的稀有肿瘤样本简便的操作流程确保快速完成从样本到数据解析仅需要 2 天时间线性自动化数据分析流程 - 摆脱大数据的困扰

12 Oncomine :Oncomine Focus Assay Hotspot genes, n=35 Copy Number Variants, n=19 Fusion drivers, n=23 AKT1 ALK AR BRAF CDK4 CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 ERBB3 ERBB4 ESR1 FGFR2 FGFR3 GNA11 GNAQ HRAS IDH1 IDH2 JAK1 JAK2 JAK3 KIT KRAS MAP2K1 MAP2K2 MET MTOR NRAS PDGFRA PIK3CA RAF1 RET ROS1 SMO DNA Panel ALK AR BRAF CCND1 CDK4 CDK6 EGFR ERBB2 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4 KIT KRAS MET MYC MYCN PDGFRA PIK3CA ABL1 AKT3 ALK AXL BRAF ERG ETV1 ETV4 ETV5 EGFR ERBB2 FGFR1 RNA Panel FGFR2 FGFR3 MET NTRK1 NTRK2 NTRK3 PDGFRA PPARG RAF1 RET ROS1 Note: 52 genes total Italic: Not members of OCP150 for that aberration class Hotspot, CNV, Fusion, Hotspot + CNV, Hotspot + CNV + Fusion, Hotspot + Fusion, CNV+ Fusion

13 Core Genes in Cancer BRAF BRAF 基因编码 B-raf 蛋白, 是一个激酶, 位于 7 号染色体上 BRAF 蛋白激活后导致 MEK/ERK 的激活, 使细胞不进入凋亡程序 BRAF 蛋白的完全活化需要 T598 和 S601 两个位点的磷酸化但是如果 BRAF 发生 V600E 突变, 那么无需 T598 和 S601 两个位点的磷酸化,BRAF 就已获得持续的活性, 并刺激细胞进入分裂周期抑制剂, 维罗非尼 (Vemurafenib) 和索拉菲尼 (Sorafenib) 是获 FDA 批准的 BRAF V600E 突变肿瘤的靶向药物 ERBB2( 也称 HER2) 全名 :Receptor tyrosine-protein kinase erbb-2, 又称 HER2, human epidermal growth factor receptor 2 位于第 17 号染色体的长臂功能 :ERBB2 参与 MAPK PI3K/Akt PKC STAT 等一系列的信号通路与肿瘤的关系 : 乳腺癌中 30% 有 ERBB2 的突变与治疗药物的关系 : 赫赛汀 (Herceptin, 曲妥珠单抗 ) 是对针对 ERBB2 的靶向药物, 另外帕妥珠单抗 (Pertuzumab) 也是针对 ERBB2 的药物基因检测 : 赫赛汀十分昂贵, 而且有心脏毒性, 所以用赫赛汀之前应做 ERBB2 的基因检测, ERBB2 基因表达升高的拷贝数增加的病人, 赫赛汀的治疗效果会更好 ABL1 全名 :Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ABL1 基因位于第 9 号染色体上临床作用 : 当 BRA 基因与 ABL1 基因型成 BRA-ABL1 融合基因的时候, 新的 BRA- ABL1 融合蛋白就会使细胞的增生脱离细胞因子的控制, 细胞癌化 BRA-ABL1 融合基因是慢性粒细胞性白血病的一个重要病因治疗药物 : 依马替尼 ( Imatinib mesylate) 是针对 BRA-ABL1 融合基因的抑制剂, 也是治疗此种癌症的靶向治疗药物

14 肿瘤研究相关产品选择

15 Primer Design

16 Primer Design

17 Primer Design

18 Primer Design

19 Ampliseq 数据量计算 S5 Ion 530 Chip 数据量 :14M reads Amplicons:207 Depth:1000X 可测样本数 : *1000*67 14,000,000

20 建库及测序流程

21 Data Analysis 原始数据样式 (FASTQ) FASTQ 数据四行描述过滤标准去除短序列 (<50bp) 去除低质量序列标准 :Moderate( 适用于高质量的 FASTQ 序列 ) 同时满足 :1 质量值小于 10 低于 10%; 2 质量值小于 13 低于 14%; 3 质量值小于 20 低于 30%

22 Mapping Mapping 算法 :TMapper

23 SNP Annotation Chromosome Start_Position Reference_Allele Tumor_Seq_Allele2 Hugo_Symbol_FJL Strand_FJL Variant_Classification_FJL Variant_Type_FJL HGVSp_FJL HGVSp_Short_FJL chr A G OR4F5 + Missense_Mutation SNP p.thr141ala p.t141a chr G C NOC2L + Splice_Region SNP chr A C NOC2L + Splice_Region SNP chr G C PLEKHN1 + Missense_Mutation SNP p.arg487pro p.r487p chr C T AGRN + Splice_Region SNP chr T C TAS1R3 + Missense_Mutation SNP p.cys757arg p.c757r chr T C MIB2 + Missense_Mutation SNP p.met102thr p.m102t chr G A PANK4 + Missense_Mutation SNP p.ala547val p.a547v chr T C MMEL1 + Splice_Region SNP chr T C PRDM16 + Missense_Mutation SNP p.ser533pro p.s533p chr T C CEP104 + Splice_Region SNP chr G C C1orf174 + Missense_Mutation SNP p.thr53arg p.t53r chr A G CHD5 + Missense_Mutation SNP p.ser1539pro p.s1539p chr C T NOL9 + Splice_Region SNP chr A C NOL9 + Missense_Mutation SNP p.ser58ala p.s58a chr A G TAS1R1 + Missense_Mutation SNP p.lys347glu p.k347e chr T C PER3 + Missense_Mutation SNP p.leu827pro p.l827p chr A C CA6 + Missense_Mutation SNP p.met68leu p.m68l chr C A MASP2 + Missense_Mutation SNP p.asp371tyr p.d371y chr G C PTCHD2 + Missense_Mutation SNP p.gly661ala p.g661a chr C T MAD2L2 + Splice_Site SNP

24 数据分析流程 RAW Data 5'UTR CDS 3'UTR Clean Reads BWA Mapping SNP Calling SNP Annotation 1000 Genome ExAC COSMIC dbsnp OMIM ClinVar

25 靶向测序案例分析黑色素瘤实验设计靶向测序及分析突变基因功能验证

26 靶向测序案例分析黑色素瘤实验设计靶向测序及分析 Sample: melanoma tumors matched germline (peripheral blood) 突变基因功能验证 Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 207 amplicons

27 靶向测序案例分析黑色素瘤实验设计靶向测序及分析突变基因功能验证

28 靶向测序案例分析黑色素瘤实验设计靶向测序及分析突变基因功能验证

29 靶向测序案例分析黑色素瘤实验设计靶向测序及分析突变基因功能验证

30 靶向测序案例 ctdna J Clin Oncol Feb 20;32(6):

31 ctdna Tag 法原理 Unique Molecular Tagging Software Unique Molecular Tag * * * * * * ctdna Amplicons on the Oncomine cfdna assays contain unique tags, like a fingerprint These fingerprints enable our software to call somatic mutations at 0.1% LOD while removing many false positives

32 ctdna 检测流程 Amplicons 6600 families 5-6 amplicons/family

33 ctdna-family

34 ctdna 分析流程, 错误率

35 ctdna 所需测序数据量 5*6600 family*190 Site/0.5=12.54M reads/sample 6 samples/run 33,000 X/site

36 分析思路外周血 Raw Data Database 比对血浆 FastQC 筛选合适药物提取 cfdna 分 family 出具结果报告加 Tag SNP calling 扩增 family Cut off family SNP 上机测序统计低频突变

37 结果报告

38 NovelBrain 云计算支持

39 NovelBrain 云 Pipeline 支持

40 NovelBrain 云 Report 支持

关于我们公司简介, 资质上海烈冰生物医药科技有限公司 (NovelBio Bio- Pharm

41 关于我们公司简介, 资质上海烈冰生物医药科技有限公司 (NovelBio Bio- Pharm Technology Co.,Ltd) 是一家以生命科学研究与应用开发为发展方向的高新技术企业, 专注于新一代高通量测序技术和生物信息学分析的应用开发和推广截止 2016 年, 中国超过 370 个顶尖科研机构医院和医药企业的 1000 多项重要项目得益于烈冰的先进分析平台和高度定制化数据解决方案烈冰科技总部位于上海市漕河泾浦江高科技园区, 拥有大量优秀的生命科学大数据 IT 管理方面的全职员工公司于 2016 年被评为上海市高新技术企业, 承担多项国家创新基金项目, 拥有多项自主专利技术及软件著作权

关于我们高分文献成果发表文章 Liu Z, et al. Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeys overexpressing MeCP2. Nature.

Genome Biol. 2017 Feb 1;18(1):13. (IF=9.202) Zhang E, et al.

squamous cell carcinoma. Nucleic Acids Res. 2016 Dec 11. (IF=11.313) Xu C, et al.

47) Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circhipk3 that regulates cell growth by sponging multiple mirnas. Nat Commun.

Mutation in CSA creates a new photoperiod-sensitive genic male sterile line applicable for hybrid rice seed production. Proc Natl Acad Sci U S A.

SP1-induced upregulation of the long noncoding RNA TINCR regulates cell proliferation and apoptosis byaffecting KLF2 mrna stability in gastric cancer.

42 关于我们高分文献成果发表文章 Liu Z, et al. Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeys overexpressing MeCP2. Nature Feb 4;530(7588): (IF=41.456) Gao Y, et al. Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced offtarget effects. Genome Biol Feb 1;18(1):13. (IF=9.202) Zhang E, et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma. Nucleic Acids Res Dec 11. (IF=11.313) Xu C, et al. Long non-coding rna gas5 control human embryonic stem cell self renewal by maintaining nodal signaling. Nat Commun. DOI: /ncomms (IF=11.47) Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circhipk3 that regulates cell growth by sponging multiple mirnas. Nat Commun Apr 6;7: (IF=11.47) Zhang H, et al. Mutation in CSA creates a new photoperiod-sensitive genic male sterile line applicable for hybrid rice seed production. Proc Natl Acad Sci U S A Jan 2;110(1): (IF=9.674) Xu T, et al. SP1-induced upregulation of the long noncoding RNA TINCR regulates cell proliferation and apoptosis byaffecting KLF2 mrna stability in gastric cancer. Oncogene Nov 5;34(45): (IF=8.459) Wang F, et al. Alternative splicing of the androgen receptor in polycystic ovary syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A Apr 14;112(15): (IF=9.681) Liu R, et al. DNMT1-microRNA126 epigenetic circuit contributes to esophageal squamous cell carcinoma growth via ADAM9-EGFR-AKT signaling. Clin Cancer Res Feb 15;21(4): (IF=8.193) Sun S, et al. Targeting the c-met/fzd8 signaling axis eliminates patient-derived cancer stem-like cells in head and neck squamous carcinomas. Cancer Res Dec 15;74(24): (IF=9.284)

43 关于我们实验平台烈冰拥有强大的实验平台, 拥有各种型号测序平台 :IonProton,Hi-Seq4000, MiSeq,PGM,Ion Torrent S5, 安捷伦 2200, QuantStudioQ6 等

44 软件著作权已获得软件著作权 11 项, 其中成功开发疾病关联分析平台 DNA 突变自动化定位系统基因信息查询系统

45 算法开发我们具备解决国际难题的能力我们具备没有现成算法下自主开发算法的能力我们具备基于云计算技术的生物大数据价值挖掘能力

46 技术支持

ALK 全名 :Anaplastic lymphoma kinase, 位于 2 号染色体上功能 :ALK 在神经发育过程中起重要作用, 是正调控元件与肿瘤的关系 :EML4-ALK 融合基因占非小细胞肺癌中的 3

ALK 全名 :Anaplastic lymphoma kinase, 位于 2 号染色体上功能 :ALK 在神经发育过程中起重要作用, 是正调控元件与肿瘤的关系 :EML4-ALK 融合基因占非小细胞肺癌中的 3 基因列表 : 选自 Life 公司出品的 Cancer Panel 中的 50 个基因资料来源 : 陈巍学基因的博客 ABL1 全名 :Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ABL1 基因位于第 9 号染色体上临床作用 : 当 BRA 基因与 ABL1 基因型成