肿瘤个体化治疗的检测技术指南

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1 肿 瘤 个 体 化 治 疗 检 测 技 术 指 南 ( 试 行 ) 1

2 前 言 肿 瘤 的 个 体 化 治 疗 基 因 检 测 已 在 临 床 广 泛 应 用, 实 现 肿 瘤 个 体 化 用 药 基 因 检 测 标 准 化 和 规 范 化, 是 一 项 意 义 重 大 的 紧 迫 任 务 本 指 南 从 诊 断 项 目 的 科 学 性 医 学 实 验 室 检 测 方 法 的 准 入 样 本 采 集 至 检 测 报 告 发 出 的 检 测 流 程 实 验 室 质 量 保 证 体 系 四 个 方 面 展 开 了 相 关 论 述, 使 临 床 医 生 能 够 了 解 所 开 展 检 测 项 目 的 临 床 目 的 理 解 检 测 结 果 的 临 床 意 义 及 对 治 疗 的 作 用 ; 医 学 实 验 室 为 患 者 或 临 床 医 护 人 员 提 供 及 时 准 确 的 检 验 报 告, 并 为 其 提 供 与 报 告 相 关 的 咨 询 服 务 检 测 技 术 的 标 准 化 和 实 验 室 准 入 及 质 量 保 证 对 临 床 和 医 学 实 验 室 提 出 了 具 体 的 要 求, 以 最 大 程 度 的 保 证 检 测 结 果 的 准 确 性 本 指 南 是 参 考 现 行 相 关 的 法 规 和 标 准 以 及 当 前 认 知 水 平 下 制 定 的, 随 着 法 规 和 标 准 的 不 断 完 善, 以 及 肿 瘤 个 体 化 治 疗 靶 点 基 因 的 不 断 发 现, 本 技 术 规 范 相 关 内 容 也 将 进 行 适 时 调 整 本 指 南 起 草 单 位 : 中 国 医 学 科 学 院 肿 瘤 医 院 分 子 肿 瘤 学 国 家 重 点 实 验 室 苏 州 生 物 医 药 创 新 中 心, 经 国 家 卫 生 计 生 委 个 体 化 医 学 检 测 技 术 专 家 委 员 会 中 国 抗 癌 协 会 相 关 专 业 委 员 会 中 华 医 学 会 检 验 医 学 分 会 中 华 医 学 会 肿 瘤 学 分 会 的 专 家 修 订 本 指 南 起 草 人 : 詹 启 敏 曾 益 新 王 珏 姬 云 钱 海 利 李 晓 燕 孙 石 磊 2

3 目 录 1. 本 指 南 使 用 范 围 简 介 标 准 术 语 和 基 因 突 变 命 名 标 准 术 语 基 因 突 变 命 名 参 考 序 列 各 类 变 异 分 析 前 质 量 保 证 样 本 类 型 及 获 取 采 样 质 量 的 评 价 样 本 采 集 中 的 防 污 染 样 本 运 送 和 保 存 分 析 中 质 量 保 证 实 验 室 设 计 要 求 检 测 方 法 DNA 提 取 方 法 与 质 量 控 制 RNA 提 取 方 法 与 质 量 控 制 试 剂 的 选 择 储 存 及 使 用 注 意 事 项 核 酸 扩 增 质 量 控 制 设 备 维 护 和 校 准 人 员 培 训 方 法 的 性 能 验 证

4 6. 分 析 后 质 量 保 证 检 测 结 果 的 记 录 失 控 结 果 的 记 录 与 分 析 报 告 及 解 释 记 录 保 留 检 测 后 基 因 咨 询 样 本 ( 及 核 酸 ) 保 留 与 处 理 检 测 与 临 床 数 据 收 集 与 分 析 肿 瘤 个 体 化 医 学 检 测 的 质 量 保 证 标 准 操 作 程 序 质 控 品 室 内 质 量 控 制 室 间 质 量 评 价 PCR 污 染 控 制 附 录 A: 常 见 的 检 测 项 目 A.1 基 因 突 变 检 测 项 目 A.2 基 因 表 达 检 测 项 目 A.3 融 合 基 因 检 测 项 目 A.4 基 因 甲 基 化 检 测 项 目 参 考 文 献 :

5 1. 本 指 南 使 用 范 围 本 指 南 由 国 家 卫 生 计 生 委 个 体 化 医 学 检 测 技 术 专 家 委 员 会 制 定, 是 国 家 卫 生 计 生 委 个 体 化 医 学 检 测 指 南 的 重 要 内 容, 旨 在 为 临 床 分 子 检 测 实 验 室 进 行 肿 瘤 个 体 化 用 药 基 因 的 检 测 提 供 指 导 本 指 南 的 主 要 适 用 对 象 为 开 展 个 体 化 医 学 分 子 检 测 的 医 疗 机 构 临 床 分 子 检 测 实 验 室 2. 简 介 肿 瘤 个 体 化 治 疗 以 疾 病 靶 点 基 因 诊 断 信 息 为 基 础, 以 循 证 医 学 研 究 结 果 为 依 据, 为 患 者 提 供 接 受 正 确 治 疗 方 案 的 依 据, 已 经 成 为 现 代 医 学 发 展 的 趋 势 临 床 研 究 证 实, 通 过 检 测 肿 瘤 患 者 生 物 样 本 中 生 物 标 志 物 的 基 因 突 变 基 因 SNP 分 型 基 因 及 其 蛋 白 表 达 状 态 来 预 测 药 物 疗 效 和 评 价 预 后, 指 导 临 床 个 体 化 治 疗, 能 够 提 高 疗 效, 减 轻 不 良 反 应, 促 进 医 疗 资 源 的 合 理 利 用 3. 标 准 术 语 和 基 因 突 变 命 名 3.1 标 准 术 语 1) 基 因 (Gene): 是 遗 传 物 质 的 最 小 功 能 单 位, 是 指 具 有 一 定 生 物 学 意 义 的 一 段 DNA 2) 突 变 (Mutation): 是 细 胞 中 DNA 核 苷 酸 序 列 发 生 了 稳 定 的 改 变 3) 融 合 基 因 (Fusion gene): 是 指 两 个 基 因 的 全 部 或 一 部 分 的 序 列 相 互 融 合 为 一 个 新 的 基 因 的 过 程 融 合 基 因 的 表 达 产 物 为 融 合 蛋 白 4) 基 因 表 达 (Gene Expression): 是 基 因 中 的 DNA 序 列 生 产 出 蛋 白 质 的 过 程 步 骤 从 DNA 转 录 成 mrna 开 始, 一 直 到 对 于 蛋 白 质 进 行 翻 译 后 修 饰 为 止 5) 基 因 扩 增 (gene amplification): 为 一 特 异 蛋 白 质 编 码 的 基 因 的 拷 贝 数 选 择 性 地 增 加 而 其 他 基 因 并 未 按 比 例 增 加 的 过 程 6)DNA 甲 基 化 (DNA Methylation): 为 DNA 化 学 修 饰 的 一 种 形 式, 将 甲 基 添 加 到 DNA 分 子 上, 例 如 在 胞 嘧 啶 环 的 5' 碳 上 DNA 甲 基 化 能 在 不 改 变 DNA 序 列 的 前 提 下, 将 DNA 甲 基 化 状 态 遗 传 至 下 一 代 细 胞 或 个 体 7) 聚 合 酶 链 反 应 (PCR): 是 一 种 体 外 扩 增 特 异 DNA 片 段 的 技 术 利 用 DNA 在 体 外 摄 氏 高 温 时 变 性 会 变 成 单 链, 低 温 时 引 物 与 单 链 按 碱 基 互 补 配 对 的 原 则 结 合, 再 调 温 度 至 DNA 聚 合 酶 最 适 反 应 温 度,DNA 聚 合 酶 沿 着 磷 酸 到 五 碳 糖 (5'-3') 的 方 向 合 成 互 补 链 1

6 8) 质 控 品 : 是 含 量 或 成 分 已 知 的 处 于 与 实 际 样 本 相 同 的 基 质 中 的 特 性 明 确 的 物 质, 这 种 物 质 通 常 与 其 他 杂 质 混 在 一 起, 专 门 用 于 质 量 控 制 目 的 的 样 本 或 溶 液 3.2 基 因 突 变 命 名 人 类 基 因 组 突 变 学 会 (HGVS) 已 建 立 系 统 的 基 因 突 变 命 名 方 法 具 体 基 因 突 变 命 名 方 法 可 查 阅 网 站 HGVS 基 因 突 变 命 名 指 南 根 据 需 求 不 断 更 新 本 文 以 2011 年 8 月 更 新 版 本 为 准 当 描 述 某 一 序 列 改 变 时, 其 前 缀 表 明 其 参 考 序 列 类 型 例 如 g. 表 示 基 因 组 序 列, c. 表 示 cdna 序 列, m. 表 示 线 粒 体 DNA 序 列, r. 表 示 RNA 序 列, p. 表 示 蛋 白 序 列 在 数 据 库 中 的 收 录 号 以 及 版 本 号 应 当 在 实 验 记 录 报 告 中 列 出, 当 两 种 突 变 在 反 式 (in trans) 中 检 测 到, 则 用 方 括 号 表 示 例 如, CF 突 变 为 杂 合 性 突 变 (508 号 苯 丙 氨 酸 缺 失 和 1303 号 天 冬 酰 胺 被 赖 氨 酸 替 代 ), 则 在 DNA 水 平 规 范 描 述 方 式 为 c.[1521_1523delctt]+[3909c>g] 3.3 参 考 序 列 美 国 国 立 生 物 技 术 信 息 中 心 (NCBI) 收 录 的 参 考 序 列 编 码 具 有 权 威 性 及 唯 一 性 其 中 前 缀 NM_ 表 示 为 mrna 序 列, NP_ 表 示 多 肽 序 列, NG_ 表 示 基 因 组 序 列 基 因 组 参 考 序 列 应 列 出 完 整 基 因 序 列, 包 括 5' 以 及 3' 非 编 码 区 (UTR) 当 使 用 某 段 编 码 DNA 参 考 序 列 描 述 突 变 时, 应 选 择 合 适 的 转 录 体, 且 转 录 体 的 起 始 转 录 点 应 当 明 确, 例 如 选 择 最 常 见 的 转 录 体, 或 者 是 已 知 的 最 大 转 录 体, 或 者 具 有 组 织 特 异 性 的 编 辑 转 录 体 当 某 一 参 考 序 列 具 有 多 种 转 录 方 式 时, 选 择 NCBI 数 据 库 里 注 释 最 全 面 的 版 本 3.4 各 类 变 异 DNA 序 列 变 异 术 语 规 范 DNA 核 苷 酸 用 大 写 字 母 A( 腺 嘌 呤 ) C( 胞 嘧 啶 ) G( 鸟 嘌 呤 ) 以 及 T( 胸 腺 嘧 啶 ) 来 表 示 用 正 链 来 表 示 DNA 序 列 当 DNA 序 列 改 变 时, 以 相 应 核 苷 酸 所 在 位 置 及 相 应 字 母 来 描 述 > 符 号 表 示 从 某 一 变 化 至 另 一 在 描 述 突 变 方 式 时, 数 字 字 母 箭 头 上 标 以 及 下 标 之 间 不 应 出 现 空 格 2

7 3.4.2 RNA 序 列 变 异 术 语 规 范 RNA 序 列 以 小 写 字 母 a( 腺 嘌 呤 ) c( 胞 嘧 啶 ) g( 鸟 嘌 呤 ) u( 尿 嘧 啶 ) 进 行 描 述 RNA 序 列 改 变 描 述 方 式 与 DNA 相 类 似 具 体 术 语 可 参 阅 HGVS 网 站 ( 蛋 白 质 序 列 变 异 术 语 规 范 蛋 白 质 序 列 改 变 通 常 以 单 个 字 母 或 三 个 字 母 ( 第 一 个 字 母 大 写 ) 来 描 述 尽 管 单 个 字 母 描 述 氨 基 酸 明 确 无 误, 但 是 由 于 三 联 密 码 子 相 对 于 其 编 码 的 氨 基 酸 存 在 冗 余 性, 具 体 给 出 发 生 突 变 的 三 联 体 密 码 子 可 以 更 清 楚 地 描 述 氨 基 酸 改 变 方 式 例 如, 用 来 描 述 氨 基 酸 的 A( 丙 氨 酸 ) C( 半 胱 氨 酸 ) G( 甘 氨 酸 ) 以 及 T( 苏 氨 酸 ) 可 能 会 与 核 苷 酸 字 母 A( 腺 嘌 呤 ) C( 胞 嘧 啶 ) G( 鸟 嘌 呤 ) 以 及 T( 胸 腺 嘧 啶 ) 相 混 淆 错 义 突 变 及 无 义 变 异 术 语 规 范 由 于 三 联 体 密 码 子 的 简 并 性, 多 个 位 点 核 苷 酸 的 改 变 可 能 不 影 响 最 终 氨 基 酸 序 列 因 此, 应 该 分 别 从 DNA 水 平 和 氨 基 酸 水 平 描 述 突 变 从 DNA 水 平 对 某 一 突 变 位 点 的 描 述 方 式 包 括 碱 基 位 点, 正 常 碱 基, > 符 号, 突 变 碱 基 例 如, 某 一 蛋 白 第 551 号 氨 基 酸 残 基 由 G( 甘 氨 酸 ) 突 变 为 D( 天 冬 氨 酸 ), 从 DNA 水 平 描 述 即 c.1652g>a 在 氨 基 酸 水 平, 由 于 错 义 突 变 的 产 物 以 氨 基 酸 残 基 位 点 以 及 表 示 氨 基 酸 的 单 字 母 或 三 联 体 密 码 子 来 描 述 表 示 方 法 是 野 生 型 的 氨 基 酸 位 点 突 变 氨 基 酸, 三 者 之 间 不 要 有 空 格 例 如,p.Gly551Asp 表 示 该 蛋 白 中 551 号 甘 氨 酸 残 基 (G) 被 天 冬 氨 酸 残 基 (D) 所 代 替 无 义 突 变 表 示 方 法 与 之 相 类 似 需 要 指 出 的 是 X 符 号 代 表 终 止 密 码 子 例 如,p.Gly542X 表 示 542 位 点 的 甘 氨 酸 残 基 被 终 止 密 码 子 所 代 替 缺 失 和 插 入 术 语 规 范 缺 失 和 插 入 突 变 分 别 用 前 缀 del 和 ins 来 表 示, 并 注 明 突 变 位 点 以 及 碱 基 例 如,c.441delA 表 示 在 该 DNA 序 列 中 441 号 位 点 发 生 A 碱 基 缺 失 c.241_243delatc 表 示 在 该 DNA 序 列 中 从 241 号 到 243 号 缺 失 ATC 三 个 碱 基 在 蛋 白 水 平, 上 述 突 变 描 述 方 式 为 p.ile24del, 表 示 该 蛋 白 质 中 第 24 号 的 异 亮 氨 酸 残 基 发 生 缺 失 indels 则 表 示 该 段 序 列 缺 失 的 同 时 有 片 段 插 入 例 如, 3

8 234_239delAATTCGinsTA( 或 者 234_239delinsTA) 表 示 该 DNA 序 列 234 至 239 号 位 点 缺 失 AATTCG 六 个 碱 基, 同 时 该 段 位 点 被 新 插 入 的 TA 碱 基 所 替 代 移 码 突 变 术 语 规 范 移 码 突 变 用 fs 符 号 来 表 示 fs*# 则 用 于 进 一 步 描 述 突 变 类 型 例 如, p.his62profs*21 表 示 该 蛋 白 发 生 移 码 突 变, 第 62 号 氨 基 酸 由 组 氨 酸 突 变 为 脯 氨 酸 并 产 生 新 的 阅 读 框 架, 终 止 于 第 62 号 密 码 子 下 游 21 号 密 码 子 处 该 突 变 也 可 简 要 描 述 为 p.his62fs, 即 该 蛋 白 从 第 62 号 密 码 子 发 生 移 码 突 变 碱 基 重 复 序 列 HGVS 推 荐, 核 苷 酸 重 复 序 列 基 因 多 态 性 描 述 时 通 常 以 一 个 重 复 序 列 为 单 元, 后 面 加 上 [ 重 复 的 次 数 ], 如 CGG[55] 当 重 复 序 列 的 次 数 在 一 个 范 围 之 内 时, 需 要 在 小 括 号 () 中 标 注 出 可 能 的 最 少 的 和 最 高 的 重 复 次 数, 如 某 个 人 HTT 基 因 中 发 现 有 12 个 和 15 个 CAG 重 复, 基 因 水 平 的 表 示 如 下 : c.52cag[12]+[15], 蛋 白 水 平 则 表 示 为 :p.gln18[12]+[15] HTT 基 因 的 重 复 序 列 范 围 则 描 述 为 :c.52cag(27_35) 或 p.gln18(27_35) 遗 传 药 理 学 基 因 型 术 语 规 范 最 广 泛 使 用 的 命 名 法 描 述 遗 传 药 理 学 基 因 型 不 同 于 其 他 遗 传 学 基 因 检 测, 例 如 代 谢 相 关 基 因 细 胞 色 素 p450 家 族, 人 类 细 胞 色 素 P450(CYP) 等 位 基 因 命 名 委 员 会 ( 推 荐 用 * 命 名, 见 图 1 在 该 系 统 中, 最 常 见 的 等 位 基 因 被 指 定 为 * 1 图 1. 细 胞 色 素 P4502D6 等 位 基 因 命 名 规 范 其 他 对 于 更 复 杂 的 突 变, 可 参 考 HGVS( 建 议 的 命 名 规 则, 解 决 其 他 复 杂 的 变 异 的 命 名 4

9 4. 分 析 前 质 量 保 证 4.1 样 本 类 型 及 获 取 新 鲜 组 织 ( 包 括 手 术 和 活 检 组 织 ) 肿 瘤 新 鲜 冷 冻 材 料 可 提 取 出 最 高 品 质 的 DNA RNA 在 手 术 现 场 取 样 的 情 况 也 比 较 多, 但 需 要 在 显 微 镜 下 确 认 肿 瘤 细 胞 含 量 周 围 炎 症 严 重 的 肿 瘤 黏 液 产 生 过 高 的 肿 瘤 病 变 中 心 广 泛 纤 维 化 的 肿 瘤 细 胞 不 能 采 集, 以 免 产 生 假 阴 性 结 果 切 割 后 取 其 中 一 半, 并 利 用 另 一 半 切 面 制 作 组 织 标 本, 然 后 进 行 确 认 手 术 切 除 的 组 织 样 本 理 想 的 保 存 方 法 是 迅 速 置 于 液 氮 中, 然 后 保 存 于 液 氮 罐 或 -80 冰 箱, 这 一 过 程 应 在 手 术 样 本 离 体 后 30 分 钟 内 完 成 由 于 组 织 样 本 通 常 需 先 进 行 病 理 学 分 析, 在 分 析 完 成 后 应 尽 早 将 组 织 样 本 置 于 稳 定 剂 中, 避 免 核 酸 降 解 石 蜡 包 埋 组 织 (formalin-fixed paraffin-embedded,ffpe) 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 手 术 切 除 样 本, 按 病 理 学 操 作 规 范 进 行 取 材 制 作 石 蜡 切 片 时, 切 取 5 片 连 续 切 片, 其 中 1 片 进 行 HE 染 色, 确 认 肿 瘤 细 胞 的 含 量 在 高 灵 敏 度 检 测 方 法 中, 可 考 虑 使 用 活 检 标 本 DNA 容 易 受 固 定 的 影 响, 长 时 间 (1 周 以 上 ) 浸 泡 在 福 尔 马 林 中 的 样 本 的 DNA 会 被 片 段 化, 不 能 检 出 突 变 活 检 材 料 的 固 定 时 间 一 般 是 24 小 时, 对 于 穿 刺 等 活 检 样 本, 固 定 时 间 控 制 在 6~24 小 时 为 佳 胸 腹 水 等 细 胞 学 样 本 用 胸 腹 水 中 的 肿 瘤 细 胞 用 于 基 因 检 测 时, 必 须 确 认 肿 瘤 细 胞, 穿 刺 获 得 胸 腹 水 样 本 提 交 给 细 胞 病 理 检 查 之 后, 剩 余 液 体 冷 藏 / 冷 冻 保 存, 也 可 在 含 有 细 胞 成 分 的 离 心 沉 淀 中 加 入 含 有 蛋 白 质 变 性 剂 的 缓 冲 液 (AL 缓 冲 液,Qiagen 公 司 ) 等 室 温 保 存 由 于 细 胞 学 样 本 的 肿 瘤 细 胞 含 量 较 低, 因 此 必 须 使 用 高 灵 敏 度 检 测 方 法 血 浆 样 本 循 环 DNA(circulating free DNA,cfDNA) 是 存 在 于 血 浆 中 的 游 离 DNA, 肿 瘤 来 源 的 DNA 占 血 浆 游 离 DNA 的 比 例 在 不 同 肿 瘤 及 病 例 中 相 差 悬 殊 (0.01~93%), 从 而 限 制 了 外 周 血 在 肿 瘤 分 子 检 测 时 的 应 用 目 前 已 有 多 篇 文 献 证 实 可 利 用 从 血 浆 游 离 DNA 检 出 突 变, 但 需 要 使 用 ARMS 法 等 灵 敏 度 非 常 高 的 检 测 方 法 5

10 采 集 外 周 血 提 取 血 浆 游 离 DNA 进 行 检 测, 取 样 时 应 使 用 一 次 性 密 闭 EDTA 抗 凝 真 空 采 血 管, 采 集 6~10ml 全 血, 冷 藏 运 输,6 小 时 内 分 离 血 浆, 提 取 游 离 DNA, 保 存 到 -80 冰 箱 中, 并 避 免 反 复 冻 融 如 外 周 血 需 长 时 间 运 输, 建 议 用 商 品 化 的 游 离 DNA 样 本 保 存 管, 在 常 温 条 件 下,cfDNA 在 全 血 中 可 稳 定 保 存 7 天 4.2 采 样 质 量 的 评 价 肿 瘤 细 胞 是 否 存 在, 是 开 展 肿 瘤 个 体 化 治 疗 基 因 检 测 的 重 要 前 提 如 果 要 确 认 肿 瘤 细 胞 存 在, 与 病 理 诊 断 医 生 密 切 合 作 是 非 常 必 要 的 采 样 评 价 内 容 包 括 : 细 胞 组 成 肿 瘤 细 胞 的 数 量, 是 否 按 照 要 求 进 行 处 理 与 运 输 评 价 方 法 包 括 肉 眼 观 察 显 微 镜 下 观 察 和 浓 度 分 析 等 肿 瘤 组 织 切 片 等 应 经 病 理 医 师 审 阅, 取 一 张 切 片 HE 染 色 后 显 微 镜 下 观 察, 确 保 肿 瘤 细 胞 存 在, 并 记 录 肿 瘤 组 织 含 量, 标 注 肿 瘤 细 胞 密 集 区 域 4.3 样 本 采 集 中 的 防 污 染 样 本 采 集 最 好 采 用 一 次 性 材 料, 不 用 处 理 便 可 直 接 使 用 ; 制 备 不 同 患 者 病 理 切 片 样 本 时, 需 更 换 新 刀 片, 并 清 除 操 作 器 皿 上 先 前 样 本 的 残 留 ; 采 集 中 要 特 别 注 意 防 止 污 染, 防 止 混 入 操 作 者 的 毛 发 表 皮 细 胞 痰 液 等 ; 如 使 用 玻 璃 器 皿, 必 须 经 高 压 灭 菌, 以 使 可 能 存 在 的 DNase 失 活 ; 如 提 取 RNA 样 品, 必 须 采 用 RNase 抑 制 剂 措 施 和 无 RNase 材 料 4.4 样 本 运 送 和 保 存 原 则 上 按 照 个 体 化 医 学 检 测 质 量 保 证 指 南 要 求 进 行 实 验 室 应 建 立 详 细 的 样 本 运 送 标 准 操 作 规 程 (SOP), 对 临 床 医 生 提 供 样 本 采 集 手 册, 要 求 物 流 人 员 填 写 相 关 运 送 记 录 表, 确 保 运 送 过 程 中 样 本 的 安 全 性 和 过 程 的 可 控 性 需 要 转 送 的 样 本 : 用 于 RNA 检 测 的 样 本, 如 果 未 经 稳 定 化 处 理, 则 必 须 速 冻 后, 放 在 干 冰 中 运 送 经 过 适 当 稳 定 化 处 理 的 样 本 可 在 常 温 下 运 送, 如 用 于 DNA 扩 增 检 测 的 EDTA 抗 凝 全 血 样 本 及 用 于 RNA 扩 增 检 测 的 经 稳 定 化 处 理 的 样 本 6

11 5. 分 析 中 质 量 保 证 5.1 实 验 室 设 计 要 求 原 则 上 按 照 个 体 化 医 学 检 测 质 量 保 证 指 南 要 求 进 行 在 符 合 国 家 卫 生 计 生 委 要 求 的 个 体 化 医 学 检 测 实 验 室 和 通 过 审 核 验 收 的 临 床 基 因 扩 增 检 验 实 验 室 完 成 5.2 检 测 方 法 Sanger 测 序 法 技 术 原 理 Sanger 测 序 法 即 双 脱 氧 链 终 止 法 (Chain Termination Method), 利 用 一 种 DNA 聚 合 酶 来 延 伸 结 合 在 待 定 序 列 模 板 上 的 引 物 直 到 掺 入 一 种 链 终 止 核 苷 酸 为 止 每 一 次 序 列 测 定 由 一 套 四 个 单 独 的 反 应 构 成, 每 个 反 应 含 有 所 有 四 种 脱 氧 核 苷 酸 三 磷 酸 (dntp), 并 混 入 限 量 的 一 种 不 同 的 双 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 (ddntp) 由 于 ddntp 缺 乏 延 伸 所 需 要 的 3-OH 基 团, 使 延 长 的 寡 聚 核 苷 酸 选 择 性 地 在 G A T 或 C 处 终 止 终 止 点 由 反 应 中 相 应 的 双 脱 氧 而 定 每 一 种 dntps 和 ddntps 的 相 对 浓 度 可 以 调 整, 使 反 应 得 到 一 组 长 几 百 至 几 千 碱 基 的 链 终 止 产 物 它 们 具 有 共 同 的 起 始 点, 但 终 止 在 不 同 的 的 核 苷 酸 上, 可 通 过 高 分 辨 率 变 性 凝 胶 电 泳 分 离 大 小 不 同 的 片 段, 凝 胶 处 理 后 可 用 X- 光 胶 片 放 射 自 显 影 或 非 同 位 素 标 记 进 行 检 测 技 术 特 点 该 方 法 是 DNA 序 列 分 析 的 经 典 方 法, 最 直 接 的 可 检 测 已 知 和 未 知 突 变 的 一 种 方 法 由 于 该 方 法 可 直 接 读 取 DNA 的 序 列, 因 此 被 认 为 是 基 因 分 型 的 金 标 准 主 要 优 点 : 测 序 长 度 较 长, 可 发 现 新 的 变 异 位 点, 包 括 一 些 新 的 少 见 的 突 变 形 式 及 突 变 的 确 切 类 型, 如 点 突 变 片 段 缺 失 局 限 性 : 灵 敏 度 不 高, 突 变 等 位 基 因 需 要 超 过 20% 才 能 检 出 对 样 本 中 肿 瘤 细 胞 的 含 量 和 比 例 要 求 较 高, 一 般 要 求 肿 瘤 细 胞 含 量 不 低 于 50%, 如 果 肿 瘤 细 胞 比 例 低 于 50%, 则 假 阴 性 出 现 的 概 率 会 显 著 增 加 ; 不 适 用 于 活 检 或 细 胞 学 样 本 焦 磷 酸 测 序 法 (Pyrosequencing) 技 术 原 理 7

12 焦 磷 酸 测 序 技 术 是 由 4 种 酶 催 化 的 同 一 反 应 体 系 中 的 酶 级 联 化 学 发 光 反 应 当 测 序 引 物 与 模 板 DNA 退 火 后, 在 DNA 聚 合 酶 ATP 硫 酸 化 酶 荧 光 素 酶 和 三 磷 酸 腺 苷 双 磷 酸 酶 等 4 种 不 同 酶 的 协 同 作 用 下, 将 引 物 上 每 一 个 dntp 聚 合 时 释 放 的 焦 磷 酸 基 团 (PPi) 与 一 次 荧 光 信 号 的 释 放 偶 联 起 来, 通 过 检 测 荧 光 的 释 放 和 强 度, 达 到 实 时 测 定 DNA 序 列 和 定 量 分 析 序 列 变 化 的 目 的 技 术 特 点 焦 磷 酸 测 序 技 术 是 一 种 新 型 的 酶 联 级 联 测 序 技 术, 其 重 复 性 和 精 确 性 可 与 Sanger 测 序 相 媲 美, 而 测 序 速 度 则 大 大 提 高, 非 常 适 合 对 已 知 的 短 序 列 进 行 重 测 序 分 析 主 要 优 点 : 检 测 灵 敏 度 为 10%, 相 对 Sanger 测 序 法 高, 对 体 细 胞 突 变 和 甲 基 化 等 可 实 现 定 量 检 测 ; 分 型 准 确 可 靠, 通 量 较 高, 实 验 设 计 灵 活, 可 发 现 新 的 突 变 或 遗 传 变 异 局 限 性 : 测 序 长 度 较 短, 不 能 对 长 片 段 进 行 分 析 检 测 灵 敏 度 中 等, 难 以 检 出 低 于 10% 的 突 变 不 适 用 于 活 检 或 细 胞 学 样 本 新 一 代 测 序 (next generation sequencing,ngs) 技 术 原 理 NGS 又 称 大 规 模 平 行 测 序 (MPS), 包 含 多 种 可 以 一 次 性 产 生 大 量 数 字 化 基 因 序 列 的 测 序 技 术, 是 继 Sanger 测 序 的 革 命 性 进 步, 采 用 平 行 测 序 的 理 念, 能 够 同 时 对 上 百 万 甚 至 数 十 亿 个 DNA 分 子 进 行 测 序, 实 现 了 大 规 模 高 通 量 测 序 的 目 标 不 同 厂 家 的 产 品 测 序 原 理 不 同, 主 要 分 为 边 合 成 边 测 序 (Sequencing by synthesis,sbs) 基 于 DNA 簇 和 可 逆 性 末 端 终 结 (Reversible Terminator) 大 规 模 平 行 测 序 4 色 荧 光 标 记 寡 核 苷 酸 的 连 续 连 接 反 应 测 序 和 半 导 体 芯 片 测 序 技 术 特 点 高 通 量 测 序 技 术 不 仅 可 以 进 行 大 规 模 基 因 组 测 序, 还 可 用 于 基 因 表 达 分 析 非 编 码 小 分 子 RNA 的 鉴 定 转 录 因 子 靶 基 因 的 筛 选 和 DNA 甲 基 化 等 相 关 研 究 主 要 优 点 : 高 通 量 测 序 技 术 有 三 大 优 点 是 传 统 Sanger 测 序 法 所 不 具 备 的 第 一, 它 利 用 芯 片 进 行 测 序, 可 以 在 数 百 万 个 点 上 同 时 阅 读 测 序 第 二, 高 通 量 测 序 技 术 有 定 量 功 能, 样 品 中 DNA 被 测 序 的 次 数 反 映 了 样 品 中 这 种 DNA 的 丰 度 8

13 第 三 利 用 传 统 Sanger 测 序 法 完 成 的 人 类 基 因 组 计 划 总 计 耗 资 27 亿 美 元, 而 现 在 利 用 高 通 量 测 序 技 术 进 行 人 类 基 因 组 测 序, 测 序 成 本 只 需 1 千 美 金 局 限 性 : 检 测 灵 敏 度 和 测 序 深 度 相 关, 一 般 来 说,NGS 在 肿 瘤 体 细 胞 突 变 检 测 时, 检 测 灵 敏 度 为 10%; 已 知 的 与 肿 瘤 相 关 驱 动 基 因 数 量 有 限, 疾 病 表 型 和 基 因 型 的 关 系 还 有 赖 于 生 物 信 息 的 解 读, 目 前 NGS 应 用 于 肿 瘤 细 胞 突 变 检 测 的 标 准 化 和 质 量 控 制 尚 未 形 成 共 识 扩 增 阻 滞 突 变 系 统 (ARMS)-PCR 法 技 术 原 理 扩 增 阻 碍 突 变 系 统 (amplification refractory mutation system, ARMS) 是 PCR 技 术 应 用 的 发 展, 也 称 等 位 基 因 特 性 PCR(allele-specific PCR,AS-PCR) 等, 用 于 对 已 知 突 变 基 因 进 行 检 测 该 法 通 过 设 计 两 个 5` 端 引 物, 一 个 与 正 常 DNA 互 补, 一 个 与 突 变 DNA 互 补, 对 于 纯 合 性 突 变, 分 别 加 入 这 两 种 引 物 及 3` 端 引 物 进 行 两 个 平 行 PCR, 只 有 与 突 变 DNA 完 互 补 的 引 物 才 可 延 伸 并 得 到 PCR 扩 增 产 物 如 果 错 配 位 于 引 物 的 3` 端 则 导 致 PCR 不 能 延 伸 技 术 特 点 ARMS-PCR 是 目 前 实 验 室 常 用 的 基 因 突 变 检 测 方 法 主 要 优 点 :ARMS-PCR 法 检 测 灵 敏 度 高, 可 检 测 肿 瘤 细 胞 中 突 变 比 例 为 1% 甚 至 更 低 的 突 变 基 因 局 限 性 : 只 能 检 测 已 知 的 突 变 类 型, 不 能 发 现 一 些 新 的 未 知 的 突 变 ; 如 果 检 测 的 突 变 位 点 或 类 型 较 多, 则 随 着 引 物 数 目 增 加 出 现 非 特 异 性 结 合 的 概 率 也 相 应 增 加 ; 当 检 测 位 点 较 多 时, 对 DNA 样 本 量 的 需 求 增 加 高 分 辨 率 熔 解 曲 线 (HRM) 法 技 术 原 理 高 分 辨 率 熔 解 曲 线 (high-resolution melting,hrm) 是 一 种 基 于 PCR 新 型 技 术, 用 于 检 测 基 因 变 异 包 括 未 知 的 基 因 变 异 单 核 苷 酸 多 态 性 以 及 基 因 甲 基 化 HRM 是 基 于 在 加 热 过 程 中 双 链 变 性 为 单 链 的 原 则 DNA 双 链 体 的 熔 解 温 度 差 异 反 应 了 基 因 的 变 异 双 链 DNA 片 段 在 其 特 定 的 温 度 熔 解, 熔 解 的 温 度 由 片 段 的 CG 含 量 序 列 组 成 长 度 以 及 一 个 和 多 个 杂 合 碱 基 决 定 用 DNA 嵌 合 的 染 料 可 以 看 到 任 何 双 链 片 段 的 熔 解 峰 图, 在 有 荧 光 嵌 合 染 料 的 情 况 下 PCR 扩 增 片 段, 9

14 扩 增 后 的 产 物 通 过 一 个 快 速 的 可 控 的 加 热 处 理 开 始 熔 解 荧 光 水 平 在 升 温 的 过 程 中 实 时 监 测, 染 料 随 着 双 链 DNA 的 熔 解, 荧 光 信 号 逐 渐 减 少 技 术 特 点 由 于 HRM 分 析 不 受 碱 基 突 变 位 点 和 种 类 的 限 制, 可 用 于 突 变 扫 描 基 因 分 型 序 列 匹 配 DNA 甲 基 化 等 方 面 的 研 究 主 要 优 点 : 检 测 灵 敏 度 1%, 特 异 性 高, 重 复 性 好 ; 封 闭 体 系, 减 少 污 染 的 可 能 性 ; 扩 增 和 检 测 同 时 进 行, 无 需 PCR 后 进 行 处 理 局 限 性 : 通 过 熔 解 曲 线 的 图 不 能 判 断 某 一 特 异 性 的 变 异 体, 下 游 分 析 中 检 测 需 要 有 测 序 等 补 充 数 字 PCR(Digital PCR) 技 术 原 理 数 字 PCR 是 一 种 核 酸 分 子 绝 对 定 量 技 术 相 较 于 qpcr, 数 字 PCR 能 够 直 接 数 出 DNA 分 子 的 个 数, 对 起 始 样 品 绝 对 定 量 通 过 将 一 个 样 本 分 成 几 万 到 几 百 万 份, 分 配 到 不 同 的 反 应 单 元, 每 个 单 元 包 含 一 个 或 多 个 拷 贝 的 目 标 分 子 ( DNA 模 板 ), 在 每 个 反 应 单 元 中 分 别 对 目 标 分 子 进 行 PCR 扩 增, 扩 增 结 束 后 对 各 个 反 应 单 元 的 荧 光 信 号 进 行 统 计 学 分 析 数 字 PCR 技 术 不 断 发 展,Bio-Rad LIFE Technologies Fluidigm 及 RainDance 等 厂 家 相 继 推 出 技 术 较 为 成 熟 的 数 字 PCR 产 品 技 术 特 点 数 字 PCR 目 前 的 应 用 包 括 : 稀 有 等 位 基 因 检 测 基 因 表 达 绝 对 定 量 核 酸 标 准 品 绝 对 定 量 二 代 测 序 文 库 绝 对 定 量 等 主 要 优 点 : 灵 敏 度 可 达 0.001~0.0001%, 高 特 异 性, 可 检 测 复 杂 背 景 下 的 靶 标 序 列 ; 可 高 度 耐 受 PCR 反 应 抑 制 剂 ; 不 必 依 赖 对 照 品 或 标 准 品, 可 对 目 标 拷 贝 数 直 接 进 行 精 确 的 鉴 定, 分 析 微 小 的 浓 度 差 异 ; 实 验 数 据 分 析 便 捷, 每 个 微 滴 的 检 测 结 果 以 阴 性 阳 性 判 读, 数 据 分 析 自 动 化 ; 可 统 计 突 变 率, 通 过 统 计 分 析 可 得 出 靶 点 的 突 变 率 局 限 性 : 数 字 PCR 仪 通 量 较 低, 目 前 通 常 能 检 测 的 信 号 为 FAM 和 HEX 一 般 单 个 反 应 2 重 反 应 效 果 最 佳 ; 数 字 PCR 优 点 是 灵 敏 度 高, 但 是 对 于 DNA 浓 度 大 的 样 本 处 理 就 没 有 优 势, 而 且 核 酸 浓 度 高 时, 每 个 微 滴 里 面 包 含 的 拷 贝 数 不 10

15 符 合 泊 松 分 布 ; 数 字 PCR 虽 然 不 依 赖 标 准 曲 线, 但 是 每 次 反 应 之 间 存 在 差 异, 短 期 内 不 能 代 替 qpcr, 也 不 能 代 替 其 他 金 标 准 而 作 为 首 选 方 法 QX200 等 数 字 PCR 仪 目 前 仅 用 于 科 研 用 途, 数 字 PCR 走 向 临 床 检 验 还 需 要 一 段 时 间 荧 光 原 位 杂 交 (FISH) 技 术 原 理 荧 光 原 位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 是 通 过 荧 光 标 记 的 DNA 探 针 与 细 胞 核 内 的 DNA 靶 序 列 杂 交, 并 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 分 析 其 结 果 的 一 种 分 子 细 胞 遗 传 学 技 术 它 的 基 本 原 理 是 : 如 果 被 检 测 的 染 色 体 或 DNA 纤 维 切 片 上 的 靶 DNA 与 所 用 的 核 酸 探 针 是 同 源 互 补 的, 二 者 经 变 性 - 退 火 - 复 性, 即 可 形 成 靶 DNA 与 核 酸 探 针 的 杂 交 体 将 核 酸 探 针 的 某 一 种 核 苷 酸 标 记 上 报 告 分 子 如 生 物 素 地 高 辛, 可 利 用 该 报 告 分 子 与 荧 光 素 标 记 的 特 异 亲 和 素 之 间 的 免 疫 化 学 反 应, 经 荧 光 检 测 体 系 在 镜 下 对 待 测 DNA 进 行 定 性 定 量 或 相 对 定 位 分 析 技 术 特 点 FISH 主 要 可 对 基 因 缺 失 基 因 融 合 基 因 扩 增 进 行 检 测 主 要 优 点 : 可 多 种 荧 光 标 记, 显 示 DNA 片 段 及 基 因 之 间 的 相 对 位 置 与 方 向, 空 间 定 位 精 确 ; 灵 敏 特 异 性 好, 可 同 时 分 析 分 裂 期 和 间 期 的 多 个 细 胞, 并 进 行 定 量 ; 可 以 检 测 隐 匿 或 微 小 的 染 色 体 畸 变 及 复 杂 核 型 局 限 性 :FISH 检 测 对 操 作 和 判 读 技 术 要 求 较 高, 诊 断 医 师 必 须 经 过 严 格 的 FISH 操 作 和 结 果 判 读 培 训, 只 有 经 FISH 操 作 经 验 丰 富 的 医 师 判 定 的 结 果 才 具 有 可 靠 性 ; 目 前 FISH 检 测 的 成 本 昂 贵 通 量 低 免 疫 组 化 (IHC) 技 术 原 理 免 疫 组 化 (Immunohistochemistry,IHC) 分 析 利 用 抗 体 和 抗 原 之 间 的 结 合 的 高 度 特 异 性, 借 助 于 组 织 化 学 的 方 法 将 抗 原 抗 体 结 合 的 部 位 和 强 度 显 示 出 来, 以 其 达 到 对 组 织 或 细 胞 中 的 相 应 抗 原 进 行 定 性 定 位 或 定 量 的 研 究 技 术 特 点 IHC 作 为 筛 查 工 具 优 于 FISH, 具 有 经 济 快 捷 的 优 点, 尤 其 适 用 于 大 量 样 本 的 检 测 分 析 影 响 IHC 结 果 的 因 素 主 要 包 括 抗 体 的 选 择 检 测 前 组 织 的 固 定, 观 察 者 解 释 方 面 的 差 别 等 11

16 5.2.9 荧 光 定 量 逆 转 录 PCR(Q-RT-PCR) 技 术 原 理 逆 转 录 PCR ( reverse transcription PCR ) 或 者 称 反 转 录 PCR(reverse transcription-pcr, RT-PCR), 是 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR) 的 一 种 广 泛 应 用 的 变 形 由 一 条 RNA 单 链 转 录 为 互 补 DNA(cDNA) 称 作 逆 转 录, 由 依 赖 RNA 的 DNA 聚 合 酶 ( 逆 转 录 酶 ) 来 完 成 随 后,DNA 的 另 一 条 链 通 过 脱 氧 核 苷 酸 引 物 和 依 赖 DNA 的 DNA 聚 合 酶 完 成, 随 每 个 循 环 倍 增, 即 通 常 的 PCR 原 先 的 RNA 模 板 被 RNA 酶 H 降 解, 留 下 互 补 DNA 技 术 特 点 荧 光 定 量 PCR 是 检 测 拷 贝 数 变 化 的 一 种 快 速 且 经 济 的 技 术 方 法, 该 方 法 技 术 可 用 于 RNA 表 达 水 平 检 测 该 技 术 主 要 优 点 是 检 测 快 速 通 量 高 灵 敏 度 好, 主 要 不 足 是 对 肿 瘤 组 织 提 取 RNA 的 质 量 要 求 较 高, 在 检 测 基 因 表 达 量 时 判 读 标 准 尚 未 统 一 FISH IHC 和 Q-RT-PCR 三 种 方 法 在 检 测 ALK 基 因 重 排 时 的 优 缺 点 分 析 见 表 1 表 1:FISH IHC 和 Q-RT-PCR 检 测 ALK 基 因 重 排 的 优 缺 点 比 较 IHC FISH Q-RT-PCR 检 测 对 象 蛋 白 DNA RNA 特 异 性 发 现 的 融 合 类 型 已 知 未 知 已 知 未 知 已 知 通 量 费 用 检 测 方 法 选 择 策 略 实 验 室 应 优 选 国 际 和 国 内 金 标 准 的 检 测 方 法, 同 类 方 法 中 优 先 选 择 结 果 稳 定 性 重 复 性 好 特 异 性 高 的 技 术, 同 时 也 应 考 虑 样 本 量, 检 测 项 目 的 多 少 等, 综 合 选 择 合 适 的 方 法 由 于 肿 瘤 组 织 的 异 质 性, 检 测 的 组 织 样 本 中 混 有 大 量 正 常 组 织 石 蜡 样 本 提 取 的 DNA 质 量 和 数 量 有 限, 就 检 测 灵 敏 度 而 言, 目 前 ARMS-PCR> 焦 磷 酸 测 序 >Sanger 测 序 12

17 在 检 测 肿 瘤 基 因 突 变 时, 不 能 一 味 追 求 检 测 方 法 的 灵 敏 度, 灵 敏 度 高 的 检 测 方 法 对 整 个 实 验 过 程 中 的 质 控 要 求 更 为 严 格, 需 防 止 因 污 染 而 产 生 假 阳 性 在 肿 瘤 靶 基 因 表 达 检 测 时, 由 于 肿 瘤 样 本 的 不 可 再 生 性, 需 谨 慎 选 择 使 用 的 方 法, 如 选 用 荧 光 定 量 PCR 要 求 提 取 的 总 RNA 量 达 1µg 以 上, 如 果 肿 瘤 组 织 过 小, 提 取 的 RNA 量 可 能 达 不 到 检 测 要 求, 此 时 应 考 虑 选 用 对 样 本 量 要 求 低 的 检 测 方 法 检 测 项 目 本 指 南 根 据 检 测 靶 分 子 (DNA 或 RNA) 类 型 及 基 因 表 达 调 控 机 制 类 型 的 不 同, 将 肿 瘤 个 体 化 治 疗 检 测 项 目 分 为 基 因 突 变 基 因 表 达 融 合 基 因 基 因 甲 基 化 检 测 四 个 类 型 所 述 检 测 项 目 均 为 目 前 在 肿 瘤 临 床 诊 疗 中, 经 过 严 格 的 循 证 医 学 实 验, 且 具 有 明 确 的 临 床 应 用 价 值, 详 见 附 录 1 实 验 室 在 开 展 肿 瘤 个 体 化 检 测 项 目 时, 应 评 估 所 开 展 的 检 测 项 目 的 科 学 性, 并 遵 循 实 验 室 的 质 量 管 理 相 关 规 定 5.3 DNA 提 取 方 法 与 质 量 控 制 DNA 提 取 之 前 的 病 理 质 量 控 制 非 常 重 要, 它 决 定 了 最 终 检 测 结 果 的 可 靠 性 样 本 进 行 检 测 前 均 先 行 常 规 病 理 检 查 和 诊 断 (HE 染 色 ), 必 须 经 有 经 验 的 病 理 医 师 确 定 肿 瘤 细 胞 的 百 分 比 ( 肿 瘤 细 胞 / 整 张 切 片 所 有 细 胞, 必 要 时 应 采 取 富 集 肿 瘤 细 胞 的 方 法, 如 手 工 刮 取 或 显 微 切 割 法 选 取 以 肿 瘤 细 胞 为 主 的 没 有 明 显 的 坏 死 黏 液 和 炎 性 改 变 的 组 织 进 行 检 测 肿 瘤 细 胞 比 例 尚 无 统 一 标 准, 理 想 情 况 下, 石 蜡 样 本 中 肿 瘤 细 胞 的 比 例 不 应 低 于 50%, 新 鲜 样 本 不 低 于 25%, 对 于 ARMS 等 敏 感 性 较 高 的 方 法, 肿 瘤 细 胞 的 含 量 和 比 例 可 以 低 一 些 具 体 视 所 采 用 的 DNA 提 取 方 法 和 突 变 检 测 方 法 的 敏 感 度 等 而 定 对 于 新 鲜 和 冻 存 的 手 术 组 织 样 本, 可 采 用 常 规 的 商 品 化 DNA 提 取 试 剂 盒 对 于 活 检 样 本, 推 荐 使 用 能 提 取 石 蜡 包 埋 组 织 微 量 DNA 的 试 剂 盒 对 于 商 品 化 核 酸 提 取 试 剂 盒, 临 床 实 验 室 在 使 用 前, 必 须 对 其 核 酸 提 取 纯 度 和 效 率 进 行 评 价 纯 化 的 靶 核 酸 的 完 整 性 可 使 用 凝 胶 电 泳 将 样 本 的 核 酸 提 取 物 与 核 酸 标 准 品 比 较 测 定 13

18 核 酸 提 取 的 产 率 : 可 在 A 260 读 数 测 定,DNA 可 溶 于 TE 溶 液 中, 建 议 浓 度 控 制 在 50~100ng/ul, 总 量 20~40 µg 或 以 上 核 酸 纯 度 : 可 通 过 提 取 物 A 260 /A 280 比 率 判 定,DNA 的 比 值 为 1.8,RNA 的 比 值 为 2.0 若 DNA 比 值 高 于 1.8, 说 明 制 剂 中 RNA 尚 未 除 尽 RNA DNA 溶 液 中 含 有 酚 和 蛋 白 质 将 导 致 比 值 降 低 5.4 RNA 提 取 方 法 与 质 量 控 制 RNA 提 取 常 比 较 困 难, 尤 其 是 保 存 年 限 较 长 的 肿 瘤 组 织,RNA 降 解 非 常 严 重 造 成 RNA 降 解 的 原 因 有 两 个 方 面 :RNA 核 糖 残 基 的 2 和 3 位 置 带 有 羟 基, 易 被 水 解 ; 生 物 体 内 和 外 部 环 境 中 存 在 大 量 RNA 酶, 并 且 RNA 酶 不 易 失 活, 高 温 后 仍 然 能 够 正 确 折 叠 恢 复 活 性 因 此 从 样 本 的 储 存 RNA 的 提 取 及 保 存, 都 需 要 格 外 小 心, 防 范 RNase 对 RNA 的 降 解 作 用 RNA 提 取 的 经 典 方 法 是 胍 盐 提 取 结 合 酚 - 氯 仿 抽 提, 石 蜡 样 本 或 活 检 样 本 可 使 用 商 品 化 RNA 提 取 试 剂 盒 纯 化 细 胞 或 组 织 的 彻 底 匀 浆 是 RNA 提 取 过 程 中 关 键 的 步 骤, 它 能 够 防 止 RNA 的 损 失 和 降 解 匀 浆 的 方 法 应 根 据 细 胞 或 组 织 的 类 型 来 选 择 核 酸 提 取 的 产 率 :RNA 可 溶 于 无 RNase 的 纯 水 中, 建 议 浓 度 控 制 在 100ng/ul 以 上, 总 量 达 30µg 以 上 纯 化 后 的 RNA 应 测 定 OD260/OD280 比 值,RNA:1.7<OD260/OD280<2.0 (<1.7 时 表 明 有 蛋 白 质 或 酚 污 染 ;>2.0 时 表 明 可 能 有 异 硫 氰 酸 残 存 ), 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 观 察 有 无 DNA 污 染 和 RNA 的 完 整 程 度 5.5 试 剂 的 选 择 储 存 及 使 用 注 意 事 项 临 床 检 测 试 剂 必 须 为 CFDA 批 准 的 试 剂, 或 具 有 严 格 标 准 操 作 规 程 (SOP) 的 自 配 试 剂 (LDT) 所 采 用 的 测 定 方 法 特 异 性 好, 灵 敏 度 准 确 度 精 密 度 符 合 国 家 卫 生 计 生 委 临 床 检 验 中 心 IFCC WHO 等 推 荐 的 方 法 性 能 所 用 标 准 品 或 标 准 参 考 物 符 合 国 家 卫 生 计 生 委 临 床 检 验 中 心 推 荐 的 标 准 和 要 求 14

19 5.6 核 酸 扩 增 质 量 控 制 临 床 PCR 检 测 方 法 不 但 要 求 特 异 性 好 灵 敏 度 高 还 要 求 具 有 高 的 可 重 复 性 准 确 性, 尽 量 降 低 假 阳 性 假 阴 性 和 非 特 异 性 扩 增 临 床 样 本 扩 增 时, 经 常 出 现 假 阳 性 和 假 阴 性, 导 致 检 测 结 果 得 出 错 误 结 论, 有 时 可 造 成 严 重 后 果 在 核 酸 提 取 中, 应 至 少 带 有 1 份 已 知 弱 阳 性 质 控 样 本 其 最 后 的 检 测 结 果, 应 是 核 酸 提 取 和 扩 增 检 测 有 效 性 的 综 合 反 映 同 时, 还 应 至 少 带 一 份 已 知 阴 性 质 控 样 本, 扩 增 测 定 的 结 果 可 以 判 断 核 酸 提 取 过 程 中 是 否 发 生 污 染 如 靶 核 酸 为 DNA, 为 判 断 DNA 扩 增 的 有 效 性, 可 使 用 1 份 已 制 备 好 的 弱 阳 性 靶 DNA 样 本, 直 接 与 靶 核 酸 同 时 扩 增 检 测 如 靶 核 酸 为 RNA, 则 除 了 可 用 上 述 弱 阳 性 cdna 判 断 DNA 扩 增 有 效 性 外, 还 可 用 已 制 备 好 的 弱 阳 性 RNA 质 控 来 判 断 反 转 录 的 有 效 性 另 外, 须 设 立 阴 性 对 照 样 品 阴 性 对 照 样 品 检 测 为 阴 性 时, 表 明 试 验 全 部 过 程 的 试 剂 没 有 受 到 核 酸 污 染 在 阴 性 对 照 样 品 和 阳 性 对 照 样 品 检 测 结 果 成 立 的 前 提 下, 才 能 对 检 测 样 品 扩 增 结 果 进 行 判 定 5.7 设 备 维 护 和 校 准 实 验 室 仪 器 的 保 养 与 维 护 是 实 验 室 实 验 技 术 员 的 重 要 组 成 部 分, 仪 器 的 保 养 与 维 护 关 系 到 仪 器 的 适 用 率 数 据 的 准 确 率 仪 器 设 备 安 装 及 技 术 性 能 验 收 需 由 项 目 负 责 人 仪 器 设 备 使 用 人 实 验 室 技 术 人 员 共 同 完 成, 验 收 内 容 按 采 购 合 同 中 技 术 需 求 部 分 以 服 务 协 议 书 的 要 求 逐 项 进 行, 并 且 建 立 仪 器 设 备 档 案 仪 器 设 备 应 定 期 开 展 校 准 计 量, 未 经 计 量 检 定 计 量 检 定 不 合 格 或 未 验 收 的 对 测 试 有 重 要 影 响 的 仪 器 设 备 不 得 投 入 使 用 实 验 室 日 常 工 作 中, 应 重 视 仪 器 设 备 的 清 洁 及 维 护, 做 到 日 维 护 周 维 护 月 维 护, 并 及 时 记 录 5.8 人 员 培 训 检 测 人 员 应 该 有 相 关 的 教 育 背 景 相 应 的 工 作 经 验, 接 受 过 专 业 培 训 培 训 主 要 有 内 部 和 外 部 培 训, 内 部 培 训 包 括 所 使 用 的 试 剂 方 法 原 理 仪 器 设 备 操 作 维 护 及 校 准 质 量 控 制 等, 外 部 培 训 包 括 国 家 卫 生 计 生 委 临 床 检 验 中 心 和 国 家 卫 生 计 生 委 个 体 化 医 学 检 测 培 训 基 地 等 机 构 组 织 开 展 的 各 种 技 术 培 训 15

20 5.9 方 法 的 性 能 验 证 方 法 学 引 进 初 期 需 对 检 测 系 统 测 定 项 目 各 参 数 的 实 验 或 评 估 性 验 证, 包 括 精 密 度 准 确 度 线 性 范 围 临 床 可 报 告 范 围 特 异 性 检 测 下 限 抗 干 扰 能 力 等 所 有 项 目 的 方 法 验 证 应 形 成 详 细 的 资 料 备 存, 资 料 需 详 细 描 述 方 法 验 证 的 目 的 过 程 检 测 结 果 分 析 判 断 及 验 证 结 论 验 证 的 结 果 及 结 论 须 经 实 验 室 负 责 人 签 字 后 才 能 用 于 临 床 检 测 根 据 项 目 的 特 性, 一 些 方 法 验 证 指 标 不 需 进 行 或 未 进 行 时, 需 在 报 告 中 书 面 解 释 原 因 推 荐 用 打 印 的 文 稿 并 在 专 用 文 件 夹 保 存 具 体 的 性 能 验 证 方 法, 如 使 用 的 是 经 CFDA 批 准 的 试 剂, 可 参 照 试 剂 盒 说 明 书 上 相 应 的 性 能 指 标 部 分 进 行 验 证, 看 是 否 能 在 其 实 验 室 内 复 现 说 明 书 所 显 示 的 上 述 性 能 指 标 如 为 自 制 试 剂 或 自 建 方 法, 则 参 考 LDT 技 术 指 南 进 行 性 能 评 价, 建 立 上 述 性 能 指 标 以 下 方 法 可 供 参 考 准 确 度 1) 参 加 国 家 卫 生 计 生 委 临 检 中 心 组 织 的 室 间 质 评, 从 室 间 质 评 统 计 结 果 评 价 实 验 室 检 测 结 果 的 偏 倚 或 符 合 情 况, 从 而 评 价 和 验 证 实 验 室 检 测 结 果 的 准 确 性 2) 方 法 比 较 实 验 : 当 引 进 新 方 法 与 原 有 方 法 进 行 比 较 时, 最 少 样 本 数 为 20 例, 用 两 种 方 法 同 时 测 定 同 样 的 样 品 如 结 果 有 不 符 合 时, 应 采 用 第 三 种 方 法 或 试 剂 进 行 确 认 3) 检 测 已 知 值 的 标 准 物 质, 对 于 样 本 来 源 存 在 问 题 的 检 测 方 法, 可 以 对 已 知 值 的 样 本 稀 释 成 不 同 浓 度 再 检 测, 以 评 估 其 准 确 度 灵 敏 度 1) 分 析 灵 敏 度 : 就 是 确 定 检 测 方 法 的 检 测 下 限 : 将 一 份 已 知 定 值 的 标 准 品, 用 野 生 型 的 基 因 组 稀 释 突 变 型 基 因 组, 设 定 不 同 的 突 变 含 量, 一 直 稀 释 到 检 测 下 限 以 下 为 止, 平 行 检 测 3 管,3 管 全 部 检 出 且 其 线 性 r 0.98 的 最 低 稀 释 浓 度 即 为 该 方 法 的 检 测 下 限 ( 可 根 据 实 际 情 况 在 最 低 稀 释 浓 度 附 近 进 行 10 倍 以 下 的 稀 释 ) 2) 临 床 灵 敏 度 : 主 要 是 验 证 方 法 的 假 阴 性 率 从 三 甲 医 院 或 专 业 权 威 检 测 机 构 收 集 20~50 例 样 本, 进 行 检 测 分 析, 其 灵 敏 度 应 满 足 临 床 检 测 要 求, 灵 敏 度 =[TB/(TB+FN)] 100(TB=true positive FN=false negative); 有 CFDA 批 文 的 检 16

21 测 试 剂, 收 集 20 例 阳 性 样 本 进 行 验 证 ; 没 有 CFDA 批 文 的 检 测 试 剂 或 自 己 实 验 室 研 发 的 LDT 试 剂, 收 集 50 例 阳 性 样 本 进 行 验 证, 并 应 进 行 室 间 比 对 特 异 性 1) 特 异 性 的 验 证 主 要 是 确 认 该 方 法 的 假 阳 性 率, 特 异 性 =[TN/(TN+FP)] 100 (TN=true negative FN=false positive) 2) 从 三 甲 医 院 或 专 业 权 威 检 测 机 构 收 集 20~50 例 阴 性 样 本, 进 行 检 测 分 析, 其 特 异 性 应 满 足 临 床 检 测 要 求 有 CFDA 批 文 的 检 测 试 剂, 收 集 20 例 阴 性 样 本 进 行 验 证 ; 没 有 CFDA 批 文 的 检 测 项 目 或 自 己 研 发 的 项 目, 收 集 50 例 阴 性 样 本 进 行 验 证 6. 分 析 后 质 量 保 证 6.1 检 测 结 果 的 记 录 1) 检 测 结 果 的 报 告 应 准 确 清 晰 明 确 客 观 和 及 时, 杜 绝 虚 假 报 告 2) 仪 器 原 始 数 据 要 仔 细 分 析, 根 据 质 控 品 判 断 PCR 扩 增 的 有 效 性, 只 有 当 质 控 品 的 扩 增 结 果 符 合 项 目 SOP 有 关 条 件 时, 才 可 发 出 报 告, 否 则 应 重 新 测 定 3) 患 者 档 案 及 测 定 结 果 一 并 录 入 检 验 管 理 系 统 报 告 内 容 至 少 应 包 括 : 实 验 室 名 称 患 者 姓 名 性 别 年 龄 测 定 项 目 检 测 方 法 检 测 结 果 参 考 范 围 用 药 建 议 及 样 本 号 样 本 类 型 检 测 日 期 实 验 操 作 者 审 核 者 报 告 日 期 实 验 室 联 系 方 式 等 否 则 视 为 无 效 或 虚 假 报 告 单 6.2 失 控 结 果 的 记 录 与 分 析 如 发 现 质 控 数 据 违 背 了 控 制 规 则, 操 作 员 应 填 写 失 控 记 录 或 失 控 报 告 单, 上 交 实 验 室 主 管, 由 专 业 主 管 做 出 是 否 发 出 与 失 控 质 控 品 同 批 患 者 样 本 检 测 报 告 的 决 定 失 控 信 号 一 旦 出 现 就 意 味 着 与 失 控 质 控 品 同 批 患 者 样 本 报 告 可 能 作 废 此 时, 首 先 要 尽 量 查 明 引 起 失 控 的 原 因, 如 为 假 失 控, 可 由 实 验 室 指 定 的 资 深 人 员 决 定 签 字 后 发 出 报 告 如 为 真 失 控, 最 好 是 纠 正 原 因 后, 全 部 样 本 重 新 检 测, 质 控 品 测 定 合 格 后 再 签 字 发 出 6.3 报 告 及 解 释 1) 报 告 的 编 写 需 要 有 严 谨 有 效 的 流 程, 以 确 保 检 验 信 息 的 完 整 有 效 及 时 正 确, 并 保 护 患 者 的 隐 私 检 测 结 果 以 检 测 报 告 单 的 形 式 发 放, 需 提 供 纸 质 版 检 17

22 测 报 告, 有 条 件 的 检 测 实 验 室 可 以 电 子 版 的 形 式 发 放 报 告, 并 建 立 网 络 查 询 系 统, 送 检 医 生 通 过 登 陆 网 站 进 行 检 测 结 果 的 查 询 2) 检 验 报 告 单 的 应 具 有 患 者 基 本 信 息 样 本 情 况 ( 采 集 送 检 及 检 测 时 间 样 本 性 质 及 状 态 等 ) 检 测 项 目 检 测 方 法 结 果 结 果 的 意 义 用 药 建 议 检 测 可 能 的 局 限 性 检 测 单 位 联 系 方 式 检 测 人 员 与 报 告 审 核 人 员 签 字, 审 核 者 应 当 是 主 管 技 师 以 上 的 工 作 人 员 本 专 业 实 验 室 负 责 人 中 级 及 以 上 的 病 理 医 师, 审 核 者 对 检 验 报 告 的 质 量 负 责 3) 结 果 解 释 的 责 任 属 于 临 床 实 验 室, 应 根 据 所 检 测 的 人 群 解 释 结 果 临 床 解 释 的 责 任 属 于 临 床 医 生, 其 应 根 据 检 测 结 果 和 临 床 信 息 向 患 者 解 释 检 测 结 果 综 合 临 床 分 子 诊 断 的 实 验 数 据 和 临 床 信 息, 为 医 师 和 患 者 描 述 此 结 果 对 疾 病 诊 断 的 含 义, 为 个 体 化 用 药 提 出 建 议 6.4 记 录 保 留 患 者 和 样 本 信 息 : 接 收 样 本 后, 在 样 本 接 收 记 录 本 中 记 录 患 者 和 样 本 信 息, 对 不 符 合 检 测 要 求 的 样 本 在 样 本 拒 收 登 记 本 上 记 录, 并 及 时 通 知 患 者 样 本 检 测 申 请 单 最 后 保 存 于 扩 增 区, 至 少 1 年 以 上 ; 其 它 实 验 记 录 保 存 于 各 自 实 验 操 作 区 内, 至 少 保 存 1 年 以 上 检 测 过 程 实 验 记 录 保 存 于 扩 增 区 的 专 用 文 件 柜 内, 以 备 查 找 扩 增 过 程 中 由 荧 光 扩 增 仪 产 生 的 数 据 文 件 必 须 保 存 在 非 系 统 分 区 的 专 门 文 件 夹 中, 定 期 做 备 份 6.5 检 测 后 基 因 咨 询 实 验 室 建 立 科 学 的 系 统 的 检 验 结 果 解 释 方 案, 提 供 结 果 的 解 释 意 见 报 告 单 上 提 供 咨 询 服 务 的 方 式 和 途 径, 如 客 户 服 务 专 线, 配 置 专 业 的 咨 询 服 务 人 员 ; 方 便 临 床 医 生 和 患 者 随 时 反 馈 意 见 和 提 出 咨 询 6.6 样 本 ( 及 核 酸 ) 保 留 与 处 理 肿 瘤 个 体 化 治 疗 基 因 检 测 报 告 发 出 后 的 样 本 应 尽 可 能 较 长 期 保 存 实 验 室 应 制 定 样 本 储 存 制 度 对 样 本 进 行 保 存, 建 立 样 本 储 存 的 规 章 制 度, 做 好 样 本 的 标 识 并 按 规 定 存 放, 保 存 好 样 本 的 原 始 标 码, 建 立 配 套 的 样 本 存 放 信 息 管 理 系 统 样 本 的 处 理 和 相 关 材 料 的 处 理 要 符 合 医 疗 废 物 管 理 条 例 医 疗 卫 生 机 构 医 疗 废 物 管 理 办 法 及 国 家 地 区 的 相 关 要 求 18

23 6.7 检 测 与 临 床 数 据 收 集 与 分 析 检 测 结 果 收 集 整 理 分 析 和 数 据 的 管 理 也 是 保 障 临 床 基 因 检 测 质 量 的 关 键 环 节 临 床 的 检 测 结 果 应 定 期 统 计 分 析, 如 基 因 突 变 的 阳 性 率, 如 果 发 现 阳 性 率 高 于 资 料 报 道 值, 应 引 起 重 视, 考 虑 是 否 存 在 假 阳 性 情 况, 如 果 阳 性 率 偏 低, 应 结 合 检 测 方 法 的 局 限 性 考 虑 假 阴 性 的 可 能, 并 进 行 针 对 性 的 改 进 7. 肿 瘤 个 体 化 治 疗 检 测 的 质 量 保 证 7.1 标 准 操 作 程 序 原 则 上 按 照 个 体 化 医 学 检 测 质 量 保 证 指 南 的 要 求 进 行 肿 瘤 个 体 化 治 疗 的 检 测 SOP, 应 包 括 试 剂 准 备 样 本 采 集 样 本 接 收 与 预 处 理 核 酸 提 取 检 测 方 法 结 果 分 析 和 报 告 仪 器 操 作 实 验 室 安 全 措 施 等 临 床 检 验 的 所 有 环 节 SOP 的 编 写 应 注 意 通 俗 易 懂 注 重 细 节 清 晰 明 了 图 文 并 茂 实 验 室 工 作 人 员 应 严 格 遵 循 SOP 中 的 步 骤 要 求 进 行 操 作, 应 每 年 定 期 根 据 实 验 室 的 运 行 状 况 进 行 SOP 审 核 修 订, 对 于 文 件 的 修 订 废 止 改 版 或 更 新, 要 按 照 规 定 的 要 求, 合 理 且 规 范 进 行, 并 防 止 无 效 或 作 废 版 本 文 件 使 用 7.2 质 控 品 检 测 质 控 品 的 建 立 是 为 了 提 高 实 验 室 检 测 结 果 的 可 靠 性 和 可 重 复 性, 一 般 情 况 下, 针 对 发 现 罕 见 的 基 因 突 变 实 验 运 行 异 常 新 批 次 的 试 剂 与 上 一 批 次 试 剂 的 比 对 储 存 条 件 或 反 应 温 度 发 生 改 变 后 的 样 本 和 试 剂 验 证 整 体 测 试 可 靠 性 的 样 本 等, 都 应 合 理 设 置 质 控 品 质 控 品 类 型 阳 性 对 照 : 以 含 有 目 的 片 段 的 DNA( 或 质 粒 ) 作 为 模 板 进 行 扩 增, 证 明 PCR 试 剂 是 否 有 效 扩 增 过 程 是 否 正 确 但 阳 性 样 品 扩 增 效 率 高, 应 严 格 控 制 其 浓 度 和 存 放 位 置, 避 免 其 成 为 潜 在 的 污 染 源 例 如, 检 测 基 因 突 变 时, 应 根 据 选 用 的 检 测 方 法, 选 择 该 方 法 最 低 检 测 限 的 阳 性 样 本 阴 性 对 照 : 以 不 含 有 目 的 片 段 的 阴 性 样 品 作 为 模 板 进 行 扩 增, 用 于 证 明 扩 增 过 程 中 无 假 阳 性 现 象 空 白 对 照 : 以 纯 水 作 为 模 板 进 行 扩 增, 用 于 证 明 扩 增 过 程 中 无 假 阳 性 现 象 PCR 抑 制 物 对 照 : 在 与 阳 性 对 照 相 同 的 反 应 体 系 中, 加 入 相 同 数 量 的 待 测 样 品 DNA, 如 果 未 扩 增 出 目 的 片 段, 证 明 此 待 测 样 品 DNA 中 存 在 PCR 抑 制 物 19

24 空 白 提 取 对 照 : 空 白 提 取 对 照 扩 增 结 果 为 阳 性, 说 明 DNA 提 取 试 剂 或 过 程 中 可 能 受 到 污 染 阳 性 提 取 对 照 : 阳 性 提 取 对 照 扩 增 结 果 为 阴 性, 说 明 提 取 过 程 可 能 有 误 如 果 DNA 阳 性 对 照 扩 增 结 果 为 阴 性, 或 者 DNA 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 扩 增 结 果 为 阳 性, 则 说 明 PCR 试 剂 或 扩 增 过 程 存 在 问 题 基 因 检 测 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP) 时, 需 要 设 置 多 个 阳 性 对 照 用 于 检 测 野 生 型 纯 合 子 基 因 型 杂 合 子 基 因 型, 突 变 纯 合 子 基 因 型 质 控 应 尽 可 能 模 拟 临 床 样 本, 如 基 质 或 采 样 方 法 与 待 测 样 本 相 同 7.3 室 内 质 量 控 制 原 则 上 按 照 个 体 化 医 学 检 测 质 量 保 证 指 南 的 要 求 进 行 建 议 按 照 以 下 原 则 设 定 室 内 质 量 控 制 : (1) 如 果 只 检 测 1 个 基 因 突 变, 定 性 测 定 有 一 份 接 近 CUT-OFF(2~4 倍 ) 的 弱 阳 性 和 一 份 阴 性 质 控 样 本 即 可 质 控 品 的 设 置 数 量 随 检 测 样 本 数 的 增 加 而 按 比 例 适 当 增 加, 例 如 临 床 样 本 数 量 达 到 50~60 份, 则 可 将 阳 性 和 阴 性 质 控 样 本 的 数 量 翻 倍 质 控 品 应 随 机 放 置 在 临 床 样 本 中 间 随 同 临 床 样 本 一 起 同 时 处 理 (2) 当 同 时 检 测 多 个 突 变 基 因 时, 可 以 根 据 实 验 室 自 身 的 条 件, 可 只 设 立 能 最 灵 敏 地 反 映 检 测 问 题 的 2 个 或 3 个 突 变 基 因 的 阴 阳 性 质 控, 下 次 检 测 改 用 跟 上 次 不 同 的 基 因 突 变 的 阴 阳 性 对 照, 依 次 类 推, 循 环 往 复 另 外, 质 控 样 本 在 扩 增 仪 中 的 位 置 不 应 持 续 性 的 固 定 在 同 一 个 孔, 而 应 在 每 次 扩 增 检 测 时, 进 行 相 应 的 顺 延, 尽 可 能 在 一 定 时 间 内 可 以 监 测 到 每 一 孔 的 扩 增 有 效 性 如 果 每 次 质 控 品 的 检 测 结 果 均 成 立, 说 明 结 果 可 信, 报 告 可 以 发 出 ; 反 之, 就 要 对 这 种 情 况 出 现 的 原 因 进 行 分 析 在 找 不 到 合 理 的 解 释 的 情 况 下, 须 将 不 符 合 的 基 因 突 变 和 其 相 应 的 对 照 重 新 检 测 此 外, 临 床 样 本 中 每 次 检 测 阳 性 和 阴 性 结 果 的 出 现 频 率, 以 及 同 一 基 因 型 或 基 因 突 变 出 现 频 率 或 连 续 出 现 频 率 等, 均 可 作 为 提 示 实 验 室 污 染 的 质 控 指 标 7.4 室 间 质 量 评 价 临 床 检 测 实 验 室 应 参 加 室 间 质 评 (EQA), 详 细 如 实 地 记 录 参 与 EQA 的 全 过 程, 根 据 反 馈 结 果 了 解 本 实 验 室 的 能 力 自 查 存 在 的 问 题, 及 时 寻 求 改 进 方 法, 解 决 问 题, 完 善 实 验 室 质 量 控 制 体 系 20

25 7.5 PCR 污 染 控 制 由 于 肿 瘤 基 因 突 变 检 测 时 必 须 设 置 阳 性 质 控 品, 阳 性 样 本 加 样 时 PCR 扩 增 的 产 物 可 能 成 为 PCR 实 验 室 的 主 要 污 染 来 源, 而 PCR 的 敏 感 性 和 效 率 特 别 高, 所 以 少 量 的 扩 增 产 物 污 染 样 本 或 反 应 管 即 可 出 现 假 阳 性 尤 其 是 PCR 扩 增 产 物 和 质 粒 分 子 很 容 易 造 成 实 验 室 的 污 染, 导 致 假 阳 性 现 象 发 生 通 过 规 范 实 验 室 设 计 规 范 试 剂 耗 材 管 理 规 范 实 验 室 操 作 和 技 术 处 理 来 控 制 污 染 常 见 的 PCR 污 染 有 样 品 间 交 叉 污 染 PCR 试 剂 的 污 染 PCR 扩 增 产 物 污 染 气 溶 胶 污 染 和 实 验 室 中 克 隆 质 粒 的 污 染 污 染 控 制 : 规 范 实 验 室 设 计 规 范 试 剂 耗 材 管 理 规 范 实 验 室 操 作 和 技 术 处 理, 如 PCR 扩 增 实 验 中 使 用 dutp, 而 不 用 dttp 21

26 附 录 A: 常 见 的 检 测 项 目 A.1 基 因 突 变 检 测 项 目 A.1.1 EGFR 基 因 突 变 检 测 基 因 简 介 EGFR 是 原 癌 基 因 c-erbb1 的 表 达 产 物, 是 表 皮 生 长 因 子 受 体 (HER) 家 族 成 员 之 一 HER 家 族 由 EGFR/HER1/erbB1 HER2/neu/erbB2 HER3/erbB3 及 HER4/erbB4 四 个 分 子 构 成, 在 细 胞 的 生 长 增 殖 和 分 化 等 生 理 过 程 中 发 挥 重 要 的 调 节 作 用 常 见 突 变 EGFR 的 突 变 主 要 发 生 在 胞 内 酪 氨 酸 激 酶 (TK) 区 域 的 前 四 个 外 显 子 上 (18~21), 目 前 发 现 的 TK 区 域 突 变 有 30 多 种 缺 失 突 变 主 要 发 生 在 外 显 子 19 上, 最 常 见 的 是 del E746-A750, 替 代 突 变 最 常 见 的 是 发 生 在 外 显 子 21 上 的 L858R, 复 制 或 插 入 突 变 发 生 在 外 显 子 20 上 发 生 在 外 显 子 20 上 的 替 代 突 变 T790M 为 耐 药 突 变, 研 究 还 发 现 L858Q D761Y T854A 等 耐 药 突 变 EGFR 基 因 突 变 和 EGFR-TKI 敏 感 性 EGFR-KTI 的 有 效 性 也 因 突 变 类 型 而 不 同, 外 显 子 19 缺 失 突 变 的 有 效 率 为 81%,L858R 的 有 效 率 为 71%,G719X 的 有 效 率 为 56% 吉 非 替 尼 初 期 有 效 的 全 部 患 者, 在 后 期 均 产 生 耐 药 其 中 50% 患 者 是 在 19 外 显 子 缺 失 或 L858R 点 突 变 等 的 敏 感 突 变 的 基 础 上, 又 发 生 了 第 790 位 密 码 子 苏 氨 酸 向 蛋 氨 酸 的 突 变 (T790M) 研 究 发 现 有 约 1~3% 的 患 者 在 TKI 治 疗 前 即 存 在 T790M, 即 原 发 耐 药, 这 种 情 况 下 TKI 治 疗 难 以 有 效 检 测 样 本 类 型 经 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 的 非 小 细 胞 肺 癌 肿 瘤 组 织 检 测 方 法 推 荐 ARMS 或 Sanger 测 序 法 进 行 EGFR 突 变 检 测, 可 考 虑 采 用 新 一 代 测 序 技 术 同 时 进 行 肺 癌 驱 动 基 因 的 检 测 临 床 意 义 (1) 预 测 药 物 疗 效 :EGFR 是 HER/ErbB 家 族 信 号 通 路 的 首 要 分 子, 吉 非 替 尼 厄 洛 替 尼 等 小 分 子 TKI 进 入 细 胞 内, 直 接 作 用 于 EGFR 胞 内 的 激 酶 区, 干 扰 ATP 合 成, 抑 制 酪 氨 酸 激 酶 的 活 性, 阻 断 激 酶 的 自 身 磷 酸 化 及 底 物 的 磷 酸 化, 彻 底 阻 断 异 常 的 酪 氨 酸 激 酶 信 号 传 导, 从 而 阻 止 配 体 介 导 的 受 体 及 下 游 信 号 通 路 的 激 活, 阻 滞 细 胞 在 G1 期, 促 进 凋 亡, 抑 制 新 生 血 管 形 成 侵 袭 和 转 移, 达 到 治 疗 的 作 用 小 分 子 TKI 的 疗 效 与 EGFR 基 因 突 变 密 切 相 关, 是 TKI 疗 效 预 测 因 子 22

27 (2) 预 后 评 价 : 根 据 是 否 使 用 EGFR-TKI 对 肺 癌 切 除 后 患 者 进 行 预 后 分 析, EGFR 敏 感 性 突 变 并 服 用 TKI 的 患 者 至 少 在 单 因 素 分 析 中 有 预 后 良 好 的 趋 势 但 是,EGFR 基 因 突 变 与 女 性 非 吸 烟 者 等 这 些 传 统 的 预 后 良 好 因 子 有 交 叉, 只 分 析 基 因 突 变 进 行 预 后 评 价 几 乎 是 不 可 能 的 用 药 建 议 (1) 吉 非 替 尼 厄 洛 替 尼 等 小 分 子 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 的 疗 效 与 EGFR 基 因 发 突 变 密 切 相 关, 特 别 是 当 第 19 外 显 子 缺 失 第 21 外 显 子 突 变 (L858R) 和 第 18 外 显 子 突 变 (G719X) 的 患 者, 使 用 吉 非 替 尼 厄 洛 替 尼 等 小 分 子 TKI 可 获 益 (2) 约 1~3% 未 经 TKI 治 疗 的 NSCLC 患 者 第 20 外 显 子 存 在 T790M 突 变, 但 经 TKI 治 疗 后 超 过 50% 后 耐 药 的 患 者 出 现 T790M 突 变 阳 性, 导 致 TKI 治 疗 失 败 也 有 报 道 认 为 L747S D76IY T854A 突 变 阳 性 时, 患 者 也 会 对 吉 非 替 尼 厄 洛 替 尼 等 小 分 子 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 耐 药 局 限 性 临 床 实 践 表 明, 并 不 是 所 有 携 有 EGFR 突 变 的 NSCLC 患 者 都 对 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 有 效,EGFR-TKI 的 有 效 性 因 突 变 类 型 而 不 同, 如 对 外 显 子 19 缺 失 突 变 的 肿 瘤 患 者 有 效 率 为 81%, L858R 的 有 效 率 为 71%,G719X 的 有 效 率 为 56%, 而 有 些 患 者 发 生 第 20 外 显 子 插 入 突 变 却 对 TKI 无 效 另 外, 约 10% 的 EGFR 野 生 型 NSCLC 患 者 对 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 有 效, 但 其 机 制 尚 不 明 确 A.1.2 KRAS 基 因 突 变 检 测 基 因 简 介 哺 乳 动 物 基 因 组 中 普 遍 存 在 三 种 RAS 癌 基 因 家 族 成 员 :H-RAS K-RAS N-RAS, 这 三 种 基 因 编 码 的 蛋 白 质 大 约 有 90% 的 氨 基 酸 同 源 序 列, 分 子 量 均 为 21kDa, 故 称 为 RASp21 蛋 白, 其 在 功 能 上 与 G 蛋 白 相 似, 可 与 二 磷 酸 尿 苷 (GDP) 结 合 为 非 活 性 状 态, 与 三 磷 酸 尿 苷 (GTP) 结 合 为 活 性 状 态,RASp21 蛋 白 自 身 具 有 弱 GTPase 活 性, 位 于 细 胞 膜 内 侧 参 与 跨 膜 信 号 传 递 作 用 KRAS 基 因 是 RAS 基 因 家 族 中 三 种 癌 基 因 的 一 种, 位 于 12 号 染 色 体 上, 含 有 4 个 编 码 外 显 子 和 1 个 5 端 非 编 码 外 显 子, 共 同 编 码 含 189 个 氨 基 酸 的 RAS 蛋 白 KRAS 是 表 皮 生 长 因 子 受 体 功 能 信 号 的 下 游 分 子, 属 膜 结 合 型 GTP/GDP 结 合 蛋 白, 通 过 GTP 和 GDP 的 相 互 转 化 作 用 有 节 制 的 调 节 KRAS 基 因 对 信 号 系 统 的 开 启 和 关 闭, 传 递 细 胞 生 长 分 化 信 号 23

28 KRAS 基 因 的 常 见 突 变 KRAS 基 因 突 变 发 生 在 肿 瘤 恶 变 的 早 中 期, 并 且 原 发 灶 和 转 移 灶 的 KRAS 基 因 状 态 基 本 保 持 一 致 目 前 研 究 发 现,KRAS 基 因 在 膀 胱 乳 腺 直 肠 肾 肝 肺 卵 巢 胰 腺 胃, 还 有 造 血 系 统 等 均 在 一 定 频 率 的 突 变, 其 中 以 结 直 肠 癌 胰 腺 癌 和 肺 癌 的 发 生 率 比 较 高, 在 胰 腺 癌 组 织 高 达 90% 以 上, 在 肺 癌 中 则 以 肺 腺 癌 为 主, 突 变 率 为 20~30%, 结 直 肠 癌 患 者 突 变 率 为 27~43% 当 KRAS 基 因 催 化 活 性 区 突 变 时, 该 基 因 永 久 活 化, 不 能 产 生 正 常 的 RAS 蛋 白, 导 致 RAS 蛋 白 不 依 赖 EGFR 受 体 激 活 而 持 续 活 化, 造 成 RAS 信 号 通 路 的 异 常 活 化, 影 响 细 胞 的 生 长 增 殖 和 分 化, 促 进 细 胞 的 恶 性 转 化, 导 致 细 胞 增 殖 失 控 而 癌 变 KRAS 基 因 最 常 见 的 突 变 方 式 为 点 突 变,90% 的 KRAS 基 因 突 变 位 于 2 号 外 显 子 的 第 12 和 13 密 码 子 位 点, 另 有 1~4% 为 第 61 和 146 密 码 子 突 变 其 中 结 直 肠 癌 中 第 12 密 码 子 ( 约 82%) 是 最 常 见 的 突 变 位 点 一 般 中 国 人 群 样 本 检 测 数 据 G12A 高 于 G12S/C, 西 方 人 群 相 反 检 测 样 本 类 型 经 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 的 结 肠 癌 / 肺 癌 肿 瘤 组 织, 或 者 与 原 发 灶 具 有 同 样 病 理 形 态 的 转 移 组 织 检 测 方 法 可 以 采 用 Sanger 测 序 法, 也 可 采 用 灵 敏 度 高 的 ARMS-PCR 等 临 床 意 义 西 妥 昔 单 抗 和 帕 尼 单 抗 均 通 过 直 接 抑 制 EGFR 从 而 发 挥 抗 肿 瘤 的 作 用, 在 结 直 肠 癌 和 头 颈 部 癌 的 靶 向 治 疗 中 都 有 肯 定 的 效 果 西 妥 昔 单 抗 治 疗 的 有 效 性 受 其 下 游 基 因 KRAS 状 态 的 影 响, 突 变 型 的 KRAS 无 需 接 受 上 游 EGFR 信 号 即 能 够 自 动 活 化 该 通 路 并 启 动 下 游 信 号 的 转 导 因 此 只 有 KRAS 基 因 野 生 型 的 患 者 才 能 从 抗 EGFR 的 治 疗 中 获 益, 而 突 变 型 的 患 者 则 不 能 用 药 建 议 KRAS 野 生 型 患 者 使 用 西 妥 昔 单 克 隆 抗 体 和 帕 尼 单 克 隆 抗 体 治 疗 效 果 确 切, 可 显 著 提 高 患 者 的 生 存 率 和 改 善 生 活 状 态, 建 议 使 用 ; 而 KRAS 的 2 号 外 显 子 的 12 号 密 码 子 和 ( 或 )13 号 密 码 子 或 其 他 密 码 子 任 意 突 变 型 患 者 使 用 西 妥 昔 单 抗 和 帕 尼 单 克 隆 抗 体 抗 治 疗 无 效, 建 议 不 使 用 该 类 药 物 而 在 进 行 结 肠 癌 靶 向 药 物 治 疗 时, 应 询 问 所 有 结 肠 癌 患 者 的 家 族 史, 如 果 怀 疑 患 者 有 遗 传 性 非 息 肉 病 性 结 直 肠 癌 (HNPCC) 家 族 性 腺 瘤 性 息 肉 病 (FAP) 和 轻 表 型 家 族 性 腺 瘤 性 息 肉 病 (AFAP), 除 非 是 进 行 临 床 试 验, 否 则 不 应 使 用 贝 伐 珠 单 克 隆 抗 体 西 妥 昔 单 克 隆 抗 体 帕 尼 单 克 隆 抗 体 或 伊 立 替 康 24

29 局 限 性 临 床 实 践 表 明, 只 有 50% 的 野 生 型 KRAS 患 者 对 抗 EGFR 治 疗 有 效, 提 示 EGFR 下 游 信 号 通 路 其 他 分 子 的 激 活 和 变 异 可 能 影 响 了 其 治 疗 反 应 因 此, KRAS 基 因 突 变 的 检 测 仅 用 于 预 测 结 直 肠 癌 对 抗 EGFR 靶 向 药 物 的 治 疗 效 果 A.1.3 BRAF 基 因 突 变 检 测 基 因 简 介 BRAF 基 因 是 1988 年 由 Ikawa 等 首 先 在 人 类 尤 因 肉 瘤 中 发 现 并 克 隆 确 认 的 一 种 能 转 染 NIH3T3 细 胞 且 有 活 性 的 DNA 序 列 BRAF 基 因 与 ARAF CRAF 基 因 同 属 RAF 家 族, 命 名 为 鼠 类 肉 瘤 滤 过 性 毒 菌 致 癌 同 源 体 B1, 位 于 人 染 色 体 7q34, 长 约 190kb, 编 码 783 个 氨 基 酸 的 蛋 白, 相 对 分 子 质 量 为 84436, 有 CR1 CR2 和 CR3 三 个 保 守 区 BRAF 是 Ras-Raf-MEK-ERK 信 号 转 导 通 路 重 要 的 转 导 因 子, 具 有 功 能 的 编 码 区 由 2510 对 碱 基 组 成, 主 要 通 过 有 丝 蛋 白 激 酶 通 路 中 的 丝 氨 酸 苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 来 发 挥 作 用, 该 酶 将 细 胞 表 面 的 受 体 和 RAS 蛋 白 通 过 MEK 和 ERK 与 核 内 的 转 录 因 子 相 连 接, 启 动 多 种 因 子 参 与 调 控 细 胞 内 多 种 生 物 学 事 件, 如 细 胞 生 长 分 化 和 凋 亡 研 究 表 明, 在 多 种 人 类 恶 性 肿 瘤 中, 如 恶 性 黑 色 素 瘤 结 直 肠 癌 肺 癌 甲 状 腺 癌 肝 癌 及 胰 腺 癌, 均 存 在 不 同 比 例 的 BRAF 突 变 常 见 突 变 BRAF 突 变 主 要 有 两 种 类 型 :1.11% 位 于 exon11 上 的 甘 氨 酸 环, 如 G463 G465 G468 的 点 突 变 ;2.89% 的 突 变 发 生 在 exon15 上 的 激 活 区, 其 中 约 92% 位 于 第 1799 核 苷 酸 上,T 突 变 为 A(T1799A 以 前 认 为 是 T1796A), 导 致 其 编 码 的 谷 氨 酸 由 缬 氨 酸 取 代 (V600E 以 前 被 认 为 是 V599E) 此 外, 仅 不 到 1% 的 癌 组 织 同 时 存 在 BRAF 突 变 与 RAS 突 变, 且 在 这 1% 中,BRAF 突 变 几 乎 均 为 非 V600E 突 变 以 上 两 种 类 型 的 突 变 均 能 使 BRAF 激 酶 活 性 及 NIH3T3 细 胞 转 化 能 力 提 高, 但 以 后 者 更 为 重 要 V600E 突 变 能 模 拟 T598 和 S601 两 个 位 点 的 磷 酸 化 作 用, 使 BRAF 蛋 白 激 活 BRAF 突 变 与 维 罗 非 尼 (vemurafenib) 2011 年 FDA 批 准 维 罗 非 尼 用 于 治 疗 晚 期 ( 转 移 性 ) 或 不 可 切 除 的 黑 色 素 瘤, 尤 其 是 携 有 BRAF V600E 基 因 变 异 肿 瘤 者 该 药 的 安 全 性 和 疗 效 评 估 基 于 一 项 国 际 单 中 心 研 究 该 研 究 纳 入 675 例 BRAF V600E 变 异 的 初 治 晚 期 黑 色 素 瘤 患 者, 入 选 者 被 随 机 分 入 维 罗 非 尼 组 或 达 卡 巴 嗪 组 结 果 显 示, 在 维 罗 非 尼 组 患 者 未 达 到 中 位 生 存 期 终 点 时 (77% 的 患 者 25

30 生 存 ), 达 卡 巴 嗪 组 患 者 中 位 生 存 期 为 8 个 月 (64% 的 患 者 生 存 ) 该 药 最 常 见 副 作 用 为 关 节 痛 皮 疹 脱 发 疲 乏 恶 心 和 皮 肤 光 敏 感 中 国 黑 色 素 瘤 患 者 中 BREF V600E 变 异 率 接 近 26%, 虽 然 不 如 白 种 人 ( 约 50%) 的 变 异 率 高, 但 仍 有 可 能 通 过 这 个 药 物 治 疗 我 国 1/4 黑 色 素 瘤 患 者, 因 此 该 药 物 对 于 黑 色 素 瘤 患 者 的 治 疗 有 着 十 分 重 要 的 意 义 检 测 样 本 类 型 经 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 的 结 肠 癌 肿 瘤 组 织 和 黑 色 素 瘤 组 织 检 测 方 法 BRAF 基 因 突 变 的 检 测 方 法 进 可 以 采 用 Sanger 测 序 法, 也 可 以 使 用 ARMS-PCR 等 方 法 进 行 检 测 临 床 意 义 (1)BRAF 是 位 于 KRAS 下 游 级 联 信 号 通 路 上 的 一 个 重 要 蛋 白, 当 BRAF 基 因 发 生 突 变 后, 其 编 码 生 成 的 蛋 白 产 物 无 需 接 受 上 游 信 号 蛋 白 的 活 化 便 始 终 处 于 激 活 状 态, 启 动 下 游 细 胞 信 号 转 导 途 径, 引 起 细 胞 增 殖, 从 而 使 EGFR 抑 制 剂 西 妥 昔 单 克 隆 抗 体 和 帕 尼 单 克 隆 抗 体 等 疗 效 减 弱 或 无 效 (2)BRAF 基 因 可 作 为 患 者 预 后 评 价 的 独 立 性 指 标,BRAF V600E 突 变 患 者 呈 现 预 后 更 差 的 趋 势 (3) BREF V600E 基 因 突 变 的 黑 色 素 瘤 患 者 对 维 罗 非 尼 治 疗 有 效 用 药 建 议 (1) 对 于 KRAS 基 因 野 生 型 但 同 时 具 有 BRAF 基 因 V600E 突 变 的 患 者, 抗 EGFR 单 克 隆 抗 体 靶 向 药 物 治 疗 可 能 无 效 (2) 回 顾 性 亚 组 分 析 显 示, 无 论 BRAF 基 因 V600E 是 否 存 在 突 变, 一 线 治 疗 采 用 抗 EGFR 单 克 隆 抗 体 联 合 有 效 的 化 疗 药 物 都 有 可 能 使 患 者 获 益 目 前 有 限 的 研 究 数 据 提 示, 一 线 治 疗 后 病 情 进 展 的 患 者, 如 果 存 在 BRAF V600E 突 变, 使 用 抗 EGFR 单 克 隆 抗 体 的 疗 效 欠 佳 (3)50% 以 上 表 达 BRAFV600 突 变 的 晚 期 黑 色 素 瘤 患 者 在 维 罗 非 尼 治 疗 中 可 获 得 临 床 应 答 局 限 性 (1)BRAF 基 因 突 变 的 检 测 用 于 预 测 结 直 肠 癌 抗 EGFR 单 克 隆 抗 体 靶 向 药 物 的 治 疗 效 果 和 预 后, 必 要 时 必 须 结 合 NRAS KRAS PI3KCA 等 基 因 的 突 变 的 检 测 (2) 研 究 发 现 黑 色 素 瘤 患 者 BRAF V600 突 变 位 点 外, 如 携 带 BRAF L597 和 K601 突 变 可 能 对 BRAF 抑 制 剂 药 物 维 罗 非 尼 药 物 治 疗 敏 感, 但 目 前 还 需 进 一 步 开 展 研 究 来 证 实 这 些 发 现 26

31 A.1.4 C-KIT 基 因 突 变 检 测 基 因 简 介 C-KIT 基 因 位 于 人 染 色 体 4q11-21, 属 于 原 癌 基 因, 其 cdna 全 长 共 5230bp, 含 有 21 个 外 显 子, 编 码 一 个 145KD 的 跨 膜 酪 氨 酸 激 酶 受 体 (tyrosine kinase receptor,rtk) 蛋 白, 命 名 CD117 第 1 号 外 显 子 编 码 起 始 密 码 子 和 信 号 肽, 第 2-9 号 密 码 子 编 码 膜 外 配 体 结 构 域, 第 10 号 外 显 子 编 码 疏 水 跨 膜 结 构 域, 第 号 外 显 子 编 码 膜 内 结 构 域 其 中 11 号 外 显 子 编 码 近 膜 区 段 C-KIT 受 体 属 于 III 型 RTK 家 族, 分 布 于 细 胞 表 面, 可 以 用 CD117 单 克 隆 抗 体 检 测, 与 血 小 板 衍 生 生 长 因 子 受 体 (platelet-derived growth factor receptors,pdgfr) 有 很 强 的 同 源 性 常 见 突 变 多 数 胃 肠 道 间 质 瘤 (GIST) 发 生 源 于 C-KIT 基 因 突 变,C-KIT 突 变 主 要 发 生 在 近 膜 区 的 外 显 子 11, 然 后 是 外 膜 区 的 外 显 子 9, 酪 氨 酸 区 段 的 外 显 子 也 可 以 发 生 突 变 最 近 数 据 显 示, 约 8~50% 的 大 肿 瘤 GIST 中 可 观 察 到 典 型 的 突 变, 突 变 频 率 约 35% 在 不 同 GIST 中,C-KIT 基 因 突 变 型 式 并 不 完 全 一 样, 最 常 见 为 第 11 号 外 显 子 突 变, 导 致 其 编 码 的 近 膜 结 构 域 的 空 间 结 构 改 变, 消 弱 或 丧 失 对 激 酶 结 构 域 的 抑 制 功 能 C-KIT 基 因 突 变 与 伊 马 替 尼 疗 效 甲 磺 酸 伊 马 替 尼 (Imatinib mesylate)( 商 品 名 : 格 列 卫 ) 是 一 种 口 服 的 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 类 药 物, 能 够 有 效 地 选 择 性 抑 制 所 有 类 型 的 abl 酪 氨 酸 激 酶 活 性, 包 括 v-abl PDGFR 和 C-KIT 蛋 白 等 伊 马 替 尼 于 2001 年 5 月 在 美 国 上 市, 同 年 11 月 在 欧 洲 上 市, 并 于 2002 年 4 月 在 中 国 上 市 最 初 被 应 用 于 费 城 染 色 体 阳 性 的 (Ph+) 慢 性 粒 细 胞 白 血 病 (CML) 的 治 疗, 之 后 被 批 准 用 于 胃 肠 道 间 质 瘤 的 治 疗, 使 得 GIST 治 疗 进 入 了 分 子 靶 向 时 代 一 般 认 为 C-KIT/PDGFRA 突 变 类 型 可 以 预 测 伊 马 替 尼 的 疗 效, 其 中 C-KIT 外 显 子 11 突 变 者 的 疗 效 最 佳 ;PDGFRA D842V 突 变 可 能 对 伊 马 替 尼 与 舒 尼 替 尼 原 发 耐 药 舒 尼 替 尼 治 疗 GIST 原 发 C-KIT 外 显 子 9 突 变 者 和 C-KIT 野 生 型 者 优 于 C-KIT 外 显 子 11 突 变 患 者 ; 治 疗 继 发 性 C-KIT 外 显 子 突 变 患 者 疗 效 优 于 继 发 C-KIT 外 显 子 突 变 者 CSCO 胃 肠 间 质 瘤 专 家 委 员 会 推 荐 存 在 以 下 情 况 时, 应 该 进 行 基 因 学 分 析 : 1 所 有 初 次 诊 断 的 复 发 和 转 移 性 GIST, 拟 行 分 子 靶 向 治 疗 ;2 原 发 可 切 除 GIST 手 术 后, 中 - 高 度 复 发 风 险, 拟 行 伊 马 替 尼 辅 助 治 疗 ;3 对 疑 难 病 例 应 进 行 C-KIT 27

32 或 PDGFRA 突 变 分 析, 以 明 确 GIST 的 诊 断 ;4 鉴 别 NF1 型 GIST 完 全 性 或 不 完 全 性 Carney s 三 联 征 家 族 性 GIST 及 儿 童 GIST;5 鉴 别 同 时 性 和 异 时 性 多 原 发 GIST 检 测 基 因 突 变 的 位 点, 至 少 应 包 括 C-KIT 基 因 的 第 和 17 号 外 显 子 及 PDGFRA 基 因 的 第 12 和 18 号 外 显 子 由 于 大 多 数 GIST(65~85%) 的 基 因 突 变 发 生 在 C-KIT 基 因 的 第 11 号 或 第 9 号 外 显 子, 对 于 经 济 承 受 能 力 有 限 的 患 者, 在 鉴 别 诊 断 时, 可 以 优 先 检 测 这 两 个 外 显 子 ; 但 是, 对 于 继 发 耐 药 的 患 者, 宜 增 加 检 测 C-KIT 基 因 的 和 18 外 显 子 检 测 样 本 类 型 经 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 的 GIST 肿 瘤 组 织 推 荐 检 测 的 样 本 类 型 为 治 疗 前 的 原 发 癌 肿 瘤 组 织 或 转 移 的 肿 瘤 组 织 检 测 方 法 C-KIT 基 因 突 变 的 检 测 方 法 可 以 采 用 Sanger 测 序 法 ARMS-PCR 等 方 法 检 测 特 定 的 突 变 位 点 临 床 意 义 (1) 辅 助 诊 断 和 预 测 疗 效 : 伊 马 替 尼 是 一 种 酪 氨 酸 蛋 白 酶 抑 制 剂, 能 阻 断 酪 氨 酸 蛋 白 激 酶 KIT 受 体 功 能, 从 而 抑 制 肿 瘤 的 形 成 已 有 研 究 证 实, C-KIT 基 因 突 变 的 位 置 能 影 响 肿 瘤 患 者 对 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 的 反 应 通 过 检 测 C-KIT 基 因 的 突 变 状 态, 协 助 GIST 诊 断, 也 可 以 进 一 步 的 明 确 诊 断 CD117 阴 性 的 患 者, 诊 断 家 族 性 GIST, 评 价 小 儿 GIST, 指 导 化 疗, 预 测 化 疗 的 效 果 (2) 预 后 评 价 : 当 C-KIT 基 因 第 11 外 显 子 发 生 突 变 后, 患 者 预 后 较 发 生 于 C-KIT 基 因 其 他 外 显 子 或 PDGFRA 基 因 突 变 的 患 者 或 者 未 检 测 到 C-KIT 基 因 或 PDGFRA 基 因 突 变 的 患 者 预 后 更 差 来 源 于 小 肠 或 结 肠 的 CIST 如 发 生 C-KIT 基 因 第 9 外 显 子 突 变, 较 发 生 C-KIT 基 因 第 11 外 显 子 突 变 者 更 具 有 侵 袭 性 用 药 建 议 伊 马 替 尼 苏 坦 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 与 C-KIT 基 因 发 突 变 密 切 相 关, 对 发 生 于 外 显 子 和 17 的 原 发 性 突 变 患 者, 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 时, 患 者 可 从 抗 C-TKI 靶 向 药 物 治 疗 中 获 益 当 发 生 位 于 第 外 显 子 的 继 发 性 突 变 时, 则 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 出 现 耐 药 局 限 性 由 于 存 在 肿 瘤 异 质 性, 或 肿 瘤 组 织 中 混 有 大 量 正 常 组 织, 或 坏 死 组 织 过 多 等, 均 有 可 能 导 致 假 阴 性 结 果 的 产 生 同 时 还 有 部 分 患 者 无 法 提 供 检 测 所 需 28

33 的 组 织 样 本, 或 组 织 样 本 无 法 满 足 检 测 的 基 本 要 求, 或 患 者 病 情 发 展 及 治 疗 过 程 中 会 发 生 C-KIT 基 因 状 态 的 变 化, 均 可 导 致 治 疗 的 失 败 此 外,C-KIT 基 因 的 突 变 与 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 敏 感 性 之 间 的 关 系 因 人 而 异 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 在 体 内 的 代 谢 受 CYP450 3A4 状 态 的 影 响, 因 此 即 使 C-KIT 基 因 突 变 阳 性 的 患 者, 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 亦 不 一 定 能 达 到 预 期 临 床 疗 效, 需 要 考 虑 其 他 因 素 的 干 扰 A.1.5 PDGFRA 基 因 基 因 简 介 PDGFR 是 分 子 量 为 180kD 的 单 链 膜 糖 蛋 白, 细 胞 外 配 体 结 合 区 含 5 个 免 疫 球 蛋 白 样 结 构 域, 具 保 守 的 半 胱 氨 酸 残 基, 单 一 跨 膜 片 段 ; 胞 内 的 酪 氨 酸 激 酶 区 断 裂 处, 为 亲 水 氨 基 酸 插 入 序 列 受 体 分 子 由 α,β 两 种 亚 基 组 成, 成 熟 后 的 PDGFR 以 二 聚 体 稳 态 形 式 ( α α, α β, β β ) 与 配 体 PDGF (platelet-derived growth factor,pdgf) 相 应 异 构 体 (PDGF-AA,AB,BB) 结 合 结 直 肠 癌 组 织 中 PDGFR α 和 PDGFR β 均 有 表 达 分 布,PDGFR α 分 布 于 结 直 肠 正 常 组 织 息 肉 组 织 及 肿 瘤 组 织 上 ;PDGFR β 表 达 于 肿 瘤 细 胞 肿 瘤 间 质 细 胞 和 微 血 管 细 胞 ( 包 括 微 血 管 周 细 胞 ) 上 PDGFRA 基 因 的 突 变 PDGFRA 基 因 突 变 常 见 于 GIST 胶 质 母 细 胞 瘤 恶 性 外 周 神 经 鞘 等 肿 瘤, 其 中 GIST 中 PDGFRA 基 因 突 变 率 在 5~10% 左 右, 突 变 主 要 发 生 于 PDGFRA 基 因 的 近 膜 端 区 域 ( 外 显 子 12) 和 激 酶 区 ( 外 显 子 14 和 外 显 子 18), 突 变 频 率 分 别 为 0.8% 和 3.9%, 其 中 以 外 显 子 18 突 变 为 主 PDGFRA 常 见 突 变 类 型 见 PDGFRA 基 因 突 变 后 则 通 过 活 化 AKT MAPK 及 STAT 蛋 白 中 STAT1 和 STAT3 发 挥 作 用 也 有 研 究 发 现 活 化 的 A-Raf 激 酶 能 调 节 PLCG1 经 PDCFR 依 赖 途 径 的 信 号 转 导, 也 能 调 节 PI3K 经 PDCFR 非 依 赖 的 信 号 转 导 检 测 样 本 类 型 经 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 的 肿 瘤 组 织 推 荐 检 测 的 样 本 类 型 治 疗 前 的 原 发 癌 肿 瘤 组 织 或 转 移 的 肿 瘤 组 织 检 测 方 法 PDGFRA 基 因 突 变 的 检 测 方 法 可 以 采 用 Sanger 测 序 法 ARMS-PCR 等 方 法 检 测 特 定 的 突 变 位 点 临 床 意 义 (1) 辅 助 诊 断 和 预 测 疗 效 : 伊 马 替 尼 是 一 种 酪 氨 酸 蛋 白 酶 抑 制 剂, 能 阻 断 酪 氨 酸 蛋 白 激 酶 KIT 受 体 功 能, 从 而 抑 制 肿 瘤 的 形 成 已 有 研 究 证 实, PDGFRA 基 因 突 变 的 位 置 能 影 响 肿 瘤 患 者 对 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 29

34 抑 制 剂 的 反 应 研 究 表 明,PDGFRA 基 因 外 显 子 12 和 外 显 子 18 大 部 分 基 因 位 点 突 变 后 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 治 疗 时 GIST 患 者 可 从 中 获 益 但 如 外 显 子 18 基 因 位 点 发 生 D842V RD KI 或 D IM 突 变 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 治 疗 时 GIST 患 者 不 能 从 中 获 益 (2) 预 后 评 价 : 当 PDGFRA 基 因 发 生 突 变 后, 肿 瘤 侵 袭 性 较 发 生 于 KIT 基 因 突 变 的 患 者 侵 袭 性 低 用 药 建 议 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酿 激 酶 抑 制 剂 与 PDGFRA 基 因 发 突 变 密 切 相 关, 对 发 生 于 外 显 子 12 中 的 Tyr555Cys 和 Asp56lVal 突 变 及 外 显 子 18 中 的 Asp846Tyr 等 突 变 患 者, 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 时, 患 者 可 从 中 获 益 当 位 于 第 18 外 显 子 中 的 D842V RD KI 和 DI IM 突 变 时, 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 则 出 现 耐 药 局 限 性 由 于 存 在 肿 瘤 异 质 性, 或 肿 瘤 组 织 中 混 有 大 量 正 常 组 织, 或 坏 死 组 织 过 多 等, 无 法 避 免 假 阴 性 结 果 的 产 生 同 时 还 有 部 分 患 者 无 法 提 供 检 测 所 需 的 组 织 样 本, 或 组 织 样 本 无 法 满 足 进 行 检 测 的 基 本 要 求, 或 患 者 病 情 发 展 及 治 疗 过 程 中 会 发 生 PDGFRA 基 因 状 态 的 变 化, 均 可 导 致 治 疗 的 失 败 此 外,PDGFRA 基 因 突 变 与 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 敏 感 性 之 间 的 关 系 因 人 而 异 同 时 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 在 体 内 的 代 谢 受 CYP450 3A4 状 态 的 影 响, 即 使 检 测 到 了 PDGFRA 基 因 的 突 变, 使 用 伊 马 替 尼 舒 尼 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 不 一 定 能 达 到 预 期 临 床 疗 效, 需 要 考 虑 其 他 因 素 的 干 扰 A.2 基 因 表 达 检 测 项 目 A.2.1 HER2 基 因 表 达 基 因 简 介 原 癌 基 因 HER2 位 于 染 色 体 17q21, 习 惯 上 称 为 HER2/neu 基 因 或 c-erbb-2 基 因 编 码 分 子 量 185kD 的 跨 膜 蛋 白, 因 此 又 被 称 为 p185 HER2, 是 具 有 跨 膜 酪 氨 酸 激 酶 活 性 的 生 长 因 子 受 体 HER2 受 体 介 导 的 信 号 通 路 是 一 个 复 杂 的 网 络 系 统, 包 括 输 入 细 胞 层 ( 配 体 或 生 长 因 子 ) 信 息 加 工 层 ( 受 体,SH2 蛋 白, 转 录 因 子 ) 和 输 出 层 ( 细 胞 生 长, 分 化 和 转 移 ) 配 体 介 导 受 体 的 二 聚 体 是 关 键, 使 该 信 号 系 统 能 够 传 递 多 种 生 物 信 息, 而 缺 乏 特 异 性 配 体 的 HER2 在 整 个 信 号 网 络 中 起 调 节 作 用 信 号 转 导 涉 及 的 主 要 通 路 包 括 :Ras Raf-Mek-MAPK 30

35 PBK Akt 激 酶 camp( 蛋 白 激 酶 A) 磷 脂 酶 C-r 和 src 等 HER2 通 过 这 些 信 号 转 导 通 路 使 细 胞 增 殖 周 期 变 短, 恶 性 表 现 增 强 和 抗 凋 亡 HER2 基 因 过 表 达 与 乳 腺 癌 等 HER2 基 因 在 乳 腺 癌 膀 胱 癌 结 直 肠 癌 胃 癌 和 非 小 细 胞 肺 癌 等 中 均 存 在 表 达 上 调 许 多 研 究 资 料 表 明, 在 20~30% 的 乳 腺 癌 中 存 在 HER2 基 因 明 显 扩 增 或 过 表 达, 临 床 上 HER2 基 因 过 表 达 的 乳 腺 癌 患 者 往 往 表 现 出 生 存 率 低 肿 瘤 恶 性 程 度 增 强 进 展 迅 速 易 于 发 生 淋 巴 结 转 移 化 疗 缓 解 期 缩 短, 并 对 他 莫 昔 芬 (Tamoxifen) 和 很 多 细 胞 毒 性 化 疗 药 耐 药 等, 但 对 大 剂 量 蒽 环 类 紫 杉 类 药 物 疗 效 好 由 于 HER2 基 因 位 于 细 胞 表 面, 易 被 抗 体 接 近, 故 HER2 基 因 可 作 为 抗 肿 瘤 治 疗 的 一 个 靶 点 检 测 样 本 类 型 经 10% 中 性 福 尔 马 林 固 定 石 蜡 包 埋 的 乳 腺 癌 肿 瘤 组 织 治 疗 前 的 原 发 肿 瘤 组 织 或 转 移 的 肿 瘤 组 织 检 测 方 法 对 HER2 基 因 表 达 的 检 测 方 法 可 以 采 用 FISH IHC 扩 增 显 色 原 位 杂 交 (CISH) 等, 目 前 也 有 实 验 室 使 用 荧 光 定 量 PCR 等 方 法 进 行 检 测, 但 该 方 法 用 于 检 测 HER2 基 因 的 表 达 尚 未 得 到 认 可 一 般 来 说, 实 验 室 首 先 采 用 IHC 方 法 进 行 HER2 蛋 白 检 测, 如 果 检 测 结 果 为 2+, 则 进 行 原 位 杂 交 (FISH) 方 法 进 行 HER2 基 因 检 测 确 认 结 果 判 读 免 疫 组 织 化 学 (IHC) 检 测 : 1)3+,HER2 表 达 阳 性 ; 2)1+ 或 阴 性, 表 达 阴 性 ; 3)2+ 时 则 需 要 进 行 FISH 检 测 FISH 检 测 : 1)HER2 与 CEP17 信 号 数 比 值 : 2.0 为 阳 性, 有 HER-2/neu 基 因 扩 增 ; 2)HER2 与 CEP17 信 号 数 比 值 :<2.0 时, 若 HER2 拷 贝 数 6.0 为 阳 性, 有 HER-2/neu 基 因 扩 增 ; 若 HER2 拷 贝 数 <4.0 为 阴 性, 无 HER-2/neu 基 因 扩 增 ; 若 HER2 拷 贝 数 4.0, 但 <6.0 时 为 不 确 定, 不 能 确 定 HER-2/neu 基 因 状 态 3) 若 众 多 信 号 HER2 信 号 连 接 成 簇 时 可 不 计 算, 即 视 为 基 因 扩 增 31

36 临 床 意 义 准 确 分 析 HER2 基 因 扩 增 状 态 是 乳 腺 癌 患 者 预 后 判 断 及 制 订 有 效 治 疗 方 案 的 先 决 条 件, 对 乳 腺 癌 的 诊 疗 具 有 重 要 的 指 导 作 用 (1) 预 后 评 价 : 研 究 显 示,HER2 基 因 的 过 表 达 除 了 与 肿 瘤 的 发 生 发 展 相 关 外, 还 是 一 个 重 要 的 临 床 预 后 指 标, 主 要 表 现 为 HER2 基 因 扩 增 的 乳 腺 癌 浸 润 性 强 无 进 展 生 存 期 (progress free survival PFS) 短 预 后 差 而 且 这 部 分 患 者 就 诊 时 的 肿 瘤 负 荷 更 大, 淋 巴 结 转 移 的 几 率 更 高, 激 素 受 体 阴 性 的 比 例 更 高 组 织 学 分 级 更 差 肿 瘤 的 增 殖 指 数 更 高 复 发 风 险 更 高 但 没 有 证 据 显 示 HER2 基 因 扩 增 与 导 管 原 位 癌 ( ductal carcinoma in situ,dcis) 的 预 后 相 关 (2) 内 分 泌 药 物 疗 效 预 测 : 研 究 显 示, 相 对 于 无 HER2 基 因 扩 增 的 乳 腺 癌 患 者 而 言,HER2 基 因 扩 增 的 患 者 应 用 他 莫 昔 芬 治 疗 后 的 死 亡 风 险 明 显 增 高, 因 此 这 类 乳 腺 癌 患 者 可 能 不 适 合 选 择 他 莫 昔 芬 作 为 内 分 泌 治 疗, 而 且 HER2 基 因 扩 增 的 乳 腺 癌 患 者 对 CMF 化 疗 方 案 的 反 应 性 降 低, 宜 采 用 高 剂 量 的 蒽 环 类 药 物 方 案 (3) 靶 向 药 物 疗 效 预 测 : 大 量 临 床 研 究 数 据 提 示, 使 用 曲 妥 珠 单 克 隆 抗 体 等 治 疗 乳 腺 癌 时, 无 论 是 与 常 规 化 疗 联 合 用 于 乳 腺 癌 患 者 的 辅 助 治 疗, 还 是 用 于 辅 助 治 疗 后 的 维 持 治 疗, 及 用 于 晚 期 乳 癌 患 者 的 单 药 或 联 合 治 疗, 都 能 肯 定 改 善 HER2 基 因 扩 增 或 蛋 白 过 表 达 患 者 的 生 存, 使 乳 腺 癌 患 者 获 益 即 使 在 使 用 曲 妥 珠 单 抗 治 疗 过 程 中 出 现 疾 病 进 展 而 需 要 进 一 步 治 疗 的 乳 腺 癌 患 者, 继 续 使 用 曲 妥 珠 单 抗 治 疗 仍 然 有 效 而 对 于 HER2 基 因 低 度 扩 增 或 不 扩 增 的 乳 腺 癌 患 者, 使 用 曲 妥 珠 单 抗 疗 效 不 佳 用 药 建 议 曲 妥 珠 单 抗 及 拉 帕 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 等 乳 腺 癌 靶 向 药 物 治 疗 乳 腺 癌 的 疗 效 与 HER2 基 因 表 达 状 态 密 切 相 关, 当 HER2 基 因 扩 增 时, 使 用 曲 曲 妥 珠 单 抗 和 拉 帕 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 时, 患 者 可 从 抗 HER2 靶 向 药 物 治 疗 中 获 益 但 如 果 发 生 PI3KCA 基 因 突 变 PTEN 基 因 失 活 及 HER2 基 因 某 些 位 点 发 生 突 变 时, 则 会 对 曲 妥 珠 单 抗 和 拉 帕 替 尼 等 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂 耐 药 局 限 性 由 于 方 法 学 本 身 的 局 限 性,IHC 和 FISH 得 出 的 均 有 不 确 定 结 果, 无 法 对 HER2 基 因 状 态 做 出 明 确 判 断 即 使 经 IHC 或 FISH 判 断 为 HER2 基 因 过 表 达 的 患 者 也 未 必 一 定 能 从 靶 向 治 疗 中 获 益, 导 致 这 种 现 象 的 原 因 可 能 是 检 测 体 系 本 身 所 造 成 的 假 阳 性, 也 可 能 是 HER2 基 因 的 信 号 通 路 中 还 存 在 其 他 异 常 的 位 32

37 点 其 次 肿 瘤 异 质 性 的 存 在 导 致 IHC 和 FISH 均 无 法 避 免 假 阴 性 结 果 的 产 生 还 有 部 分 患 者 无 法 提 供 检 测 所 需 的 组 织 样 本, 或 组 织 样 本 无 法 满 足 进 行 检 测 的 基 本 要 求, 或 患 者 病 情 发 展 及 治 疗 过 程 中 会 发 生 HER2 基 因 状 态 的 变 化, 而 IHC 和 FISH 均 无 法 对 患 者 的 HER2 基 因 状 态 进 行 动 态 实 时 的 监 测 A.3 融 合 基 因 检 测 项 目 A.3.1 EML4-ALK 融 合 基 因 检 测 项 目 基 因 简 介 ALK, 即 人 类 间 变 性 淋 巴 瘤 激 酶 (anaplastic lymphoma kinase,alk), 于 1994 年 首 先 发 现 于 间 变 性 大 细 胞 淋 巴 瘤 AMS3 细 胞 株 中, 是 由 1620 个 氨 基 酸 组 成 的 跨 膜 蛋 白, 属 于 胰 岛 素 受 体 家 族 EML4 是 人 类 棘 皮 动 物 微 管 相 关 蛋 白 样 4(echinoderm microtubule-associated protein- like 4,EML4), 属 于 棘 皮 动 物 微 管 相 关 蛋 白 样 蛋 白 家 族, 由 N 末 端 碱 基 区 疏 水 的 棘 皮 动 物 微 管 相 关 蛋 白 区 (hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein,help) 及 WD 重 复 区 三 部 分 构 成 该 融 合 基 因 定 位 于 2 号 染 色 体 的 短 臂 上 (2p21 和 2p23), 其 5 端 为 EML4 的 片 段,3 端 为 ALK 的 片 段, 由 倒 置 后 的 EML4 基 因 片 段 与 残 余 的 ALK 片 段 连 接 该 融 合 基 因 拥 有 EML4 基 因 中 的 BASIC 区 域, 疏 水 的 棘 皮 动 物 微 管 相 关 蛋 白 区 及 部 分 WD 重 复 区 ( 后 两 部 分 在 部 分 亚 型 中 缺 失 ) 和 ALK 基 因 中 的 Kinase 功 能 区 EML4-ALK 的 信 号 转 导 通 路 为 PI3-K/Akt STAT3/5 Ras-MEK 和 PLC-γ/PIP2 等, 这 些 通 路 与 细 胞 存 活 增 殖 和 迁 移 密 切 相 关 EML4-ALK 融 合 与 克 唑 替 尼 克 唑 替 尼 是 一 种 酪 氨 酸 激 酶 受 体 抑 制 剂, 靶 向 分 子 包 括 ALK 肝 细 胞 生 长 因 子 受 体 (HGFR,c-Met) 和 ROS1, 于 2011 年 获 得 美 国 食 品 和 药 品 管 理 局 (FDA) 批 准 用 于 治 疗 间 变 型 淋 巴 瘤 激 酶 (ALK) 基 因 重 排 的 非 小 细 胞 肺 癌 (NSCLC) EML4-ALK 基 因 融 合 可 促 使 ALK 基 因 引 起 致 癌 融 合 蛋 白 的 表 达 ALK 融 合 蛋 白 形 成 可 引 起 基 因 表 达 和 信 号 的 激 活 和 失 调, 进 而 促 使 表 达 这 些 蛋 白 的 肿 瘤 细 胞 增 殖 和 存 活 克 唑 替 尼 在 肿 瘤 细 胞 株 中 对 ALK 和 c-met 在 细 胞 水 平 检 测 的 磷 酸 化 具 有 浓 度 依 赖 性 抑 制 作 用, 对 表 达 EML4-ALK 或 NPM-ALK 融 合 蛋 白 或 c-met 的 异 种 移 植 荷 瘤 小 鼠 具 有 抗 肿 瘤 活 性 在 NSCLC 患 者 中,ALK 重 排 的 阳 性 率 大 约 为 3~5%, 在 腺 癌 从 未 吸 烟 或 少 量 吸 烟 的 患 者 中 EML4-ALK 融 合 的 几 率 高 33