04陈君石

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勋完国
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1 364 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No. 4 食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型研究细菌耐药白瑶王伟闫琳杨舒然闫韶飞董银苹赵彬丞赵洋洋徐进胡豫杰李凤琴摘要目的分析食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 对常用抗生素的耐药情况及分子分型特征, 并评价分子分型方法方法株 MRSA 菌株来自 202 年全国污染物监测网 ( 凉拌菜分离 3 株, 牛奶分离株, 糕点分离 2 株, 米饭分离株, 凉面分离株, 酱牛肉分离株, 水饺分离株, 盒饭分离株, 沙拉分离株, 生猪肉 9 株 ), 采用微量肉汤稀释法测定菌株对种抗生素的耐药性, 并采用 PCR 方法对菌株进行扩增, 获得多位点序列分型 (MLST,ST 型 ) spa 分型, 通过 eburst 软件获得克隆簇 (CC), 登陆网站获得多位点可变数目串联重复序列 (MLVA,MT 型 ) 和 MLVA 复合体 (MC); 采用 SmaⅠ-PFGE 获得菌株的 PFGE 带型 ; 应用 Simpson 区分系数 (DI 值 ), 评价各方法的分型能力, 以发现适合 MSRA 最强分辨率的分型方法结果所有 MRSA 菌株均为多重耐药株 ( 耐 3 类及以上抗生素 ), 对苯唑西林苄青霉素克林霉素和红霉素均耐药, 对四环素环丙沙星磺胺甲噁唑 / 甲氧苄啶和庆大霉素的耐药率分别为 7.4%(5 株 ) 47.6%(0 株 ) 42.9%(9 株 ) 和 28.6%(6 株 ), 此外有株菌对左氧氟沙星莫西沙星和利福平均耐药株菌株可分为 6 种 ST 型 7 种 spa 型 9 个 MLVA 型和 9 个 PFGE 带型,PFGE MLVA spa 及 MLST 分型方法的 DI 值依次为和 0.6 分离自生猪肉的 9 株 MRSA 被识别为 CC9-ST9-t899-MT929-MC2236,PFGE 带型 Ⅴ, 为主要的 MRSA 流行克隆, 此外, 有 2 株 MRSA 被识别为 CC59-ST338-t437-MT6-MC6,PFGE 带型 Ⅳ, 不同的流行克隆具有特定的耐药谱结论食源性 MRSA 多重耐药普遍存在, 不同流行克隆具有特定的耐药谱,MLVA 可作为处理 MRSA 所致突食源性疾病的首选溯源分型工具关键词抗甲氧西林金黄色葡萄球菌 ; 分子分型 ; 抗药性 ; 生猪肉基金项目 : 国家重点研发计划 (206YFD04002); 国家食品安全风险评估中心青年科研基金项目 (207004) Molecular typing characterization of food-borne methicillin-resistant Staphylococcus aureus in China Bai yao *, Wang Wei, Yan Lin, Yang Shuran, Yan Shaofei, Dong Yinping, Zhao Bincheng, Zhao Yangyang, Xu Jin, Hu Yujie, Li Fengqin. * Key Lab of Food Safety Risk Assessment, Ministry of Health, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 000, China Corresponding author: Li Fengqin, lifengqin@cfsa.net.cn Abstract Objective To analyses the antimicrobial resistance and molecular characterization of MRSA isolates cultured from retail foods from different provinces in China, and evaluate the molecular typing methods. Methods Twenty-one MRSA isolates were obtained from national foodborne pathogen surveillance network in 202 (Chinese salad, n=3; milk, n=; cake, n=2; rice, n=; cold noodle, n=; spiced beef, n=; dumpling, n=; packed meal, n=; salad, n=; raw pork, n=9). The antimicrobial resistance of strains to 2 antimicrobial agents was tested by broth dilution method. Polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing were performed to obtain the genetic types of MLST (ST) and spa typing. The clonal complex (CC) was assigned by eburst soft and the MLVA type (MT) and MLVA complex (MC) were identified via the database of the MLVA website ( SmaI pulsed-field gel electrophoresis (Sma Ⅰ-PFGE) was also carried out to obtain the PFGE patterns of strains. The genetic diversity and discriminatory power of typing were calculated by the Simpson's index of diversity (diversity index, DI) to find out the best genotyping method for MRSA. Results All MRSA isolates showed multi-drug resistance DOI:0.3760/cma.j.issn 作者单位 :000 北京, 国家食品安全风险评估中心卫生部食品安全风险评估重点实验室 ( 白瑶王伟闫琳杨舒然闫韶飞董银苹徐进胡豫杰李凤琴 ); 北京农学院食品科学与工程学院 ( 赵彬丞赵洋洋 ) 通信作者 : 李凤琴, lifengqin@cfsa.net.cn

2 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No (MDR), and were resistant to oxacillin, benzylpenicillin, clindamycin and erythromycin, and 7.4% (5/), 47.6% (0/), 42.9% (9/) and 28.6% (6/) of the MRSA isolates were resistant to tetracycline, ciprofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole and gentamicin, respectively. Moreover, one strain was found to be resistant to all three antimicrobials of levofloxacin, moxifloxacin and rifampicin. Great diversity was found in these food-associated MRSA (6 STs, 7 spa types, and 9 MTs). PFGE patterns were more diverse than those of other three molecular typing methods (9 pulse types). The index of diversity (DI) of PFGE, MLVA, spa typing and MLST was 0.99, 0.80, 0.73, and 0.6, respectively. Among the MRSA isolates, CC9-ST9-t899-MT929-MC2236 (PFGE Cluster Ⅴ) was the most prevalent clone, which were all cultured from raw pork (9 isolates). Besides, two MRSA were identified as CC59-ST338-t437-MT6-MC6 (PFGE Cluster Ⅳ). Different clone had their own resistance spectrum profiles. Conclusion The food-borne MRSA isolates were all MDR in this study. Different clones had their own resistance spectrum profiles. MLVA represented a promising tool for molecular epidemiology tracing of MRSA in foodborne disease events. Key words Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Molecular typing; Drug resident; Raw pork Fund program: National Key R&D Program of China (206YFD04002); China Food Safety Talent Competency Development Initiative (207004) 近年来, 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,mrsa) 感染已成为世界各国重要的公共卫生问题, 造成了严 [-5] 重的经济和疾病负担最初 MRSA 感染主要与住院治疗和临床手术有关, 即医院获得型 MRSA (hospital-acquired MRSA, HA-MRSA), 然而近年来社区获得型 MRSA(community-acquired MRSA, CA-MRSA) 的出现及其对医疗机构和人群的感染 [6-7] 也逐渐成为各国关注的热点 999 年, 美国发生 [8] 了 4 名儿童死于 CA-MRSA 的感染事件加拿大人感染 CA-MRSA 占全部感染 MRSA 的比率从 2007 年的 9.5% 上升到了 2009 年的 3.9% [9] 提示 MRSA 所致感染有从医院获得型逐渐向社区获得型转化的趋势由于金黄色葡萄球菌可产生肠毒素, 是食源性 [0] 疾病发生的主要原因之一, 目前已有大量从动物 [-3] 性食品及其制品中分离到 MRSA 的报道鉴于 MRSA 普遍耐药, 目前临床上只能用万古霉素替 [4] 考拉宁等少数几种抗生素来治疗 MRSA 感染因此, 对食品中 MRSA 进行分子分型分析, 对有效控制食品中 MRSA 污染及流行具有重要意义国际上已有针对食源性 MRSA 开展的分子分型研究 [5-6] 报道, 国内虽有关于食源性 MRSA 的报道, 但大 [7-8] 部分局限于一种或两种分型方法, 本研究对 202 年食源性致病菌监测网收集的食源性 MRSA 菌株进行四种分子分型研究, 获得 MRSA 菌株的分子分型特征和主要流行菌株的型别, 为我国开展 MRSA 所致食源性疾病突发事件溯源分析提供重要的实验室依据同时探讨 MRSA 菌株的抗生素耐药谱与分子分型之间的关系, 为研究其耐药机制提供依据, 进而指导食品生产环节抗生素的合理应用, 从根本上控制 MRSA 对食品的污染和对人群的健康危害具有重要意义材料与方法. 菌株 : 本研究采用的株 MRSA 菌株 202 [9] 年全国食品污染物监测网, 该监测网设有覆盖全国的食品污染物和有害因素监测点为个株 MRSA 菌株主要从凉拌菜分离 3 株, 牛奶分离株, 糕点分离 2 株, 米饭分离株, 凉面分离株, 酱牛肉分离株, 水饺分离株, 盒饭分离株, 沙拉分离株, 生猪肉分离 9 株药敏质控菌株金黄色葡萄球菌 (ATCC R 293) PFGE 相对分子量沙门菌 Salmonella serotype Braenderup H982 均为本实验室保存 2. 仪器与试剂 : 高通量 DNA Engine Tetrad 2 PCR 仪 Sub-Cell R Model 96 Cell 电泳仪 Gel Doc XR 凝胶成像系统和脉冲场凝胶电泳仪 PFGE( 美国 Bio-Rad 公司 ); 脑心浸液琼脂和脑心浸液肉汤购自北京陆桥技术股份有限公司, 细菌基因组提取试剂盒 (DP302) 00 bp DNA 标准 (MD09) 和 PCR 酶 (KT20-02) 购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司, Xba Ⅰ 酶和 Sma Ⅰ 酶 ( 美国 New England Biolabs 公司 ),GeneScan 200 LIZ 内标购自美国 Applied Biosystems 公司, 试验用抗生素均购自美国 Sigma 公司 3. 引物 : 金黄色葡萄球菌 A 蛋白基因 (spa) 分型多位点序列分型 (multilocus sequence typing, MLST) 和多位点可变数目串联重复序列分析

3 366 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No. 4 (multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,mlva) 分型引物合成及 PCR 产物纯化测序均由上海英俊生物技术有限公司 4. 抗生素敏感性试验 : 根据美国临床和实验室标准委员会 (Clinical and Laboratory Standards [20] Institute,CLSI)205 版推荐的微量肉汤稀释法, 以金黄色葡萄球菌 ATCC R 293 作为质控菌株, 测定苄青霉素 (benzylpenicillin,ben) 苯唑西林 (oxacillin,oxa) 庆大霉素 (gentamicin,gen) 环丙沙星 (ciprofloxacin,cip) 左氧氟沙星 (levofloxacin,lev) 莫西沙星 (moxifloxacin, MOX) 红霉素 (erythromycin,ery) 克林霉素 (clindamycin,cli) 四环素 (tetracycline,tet) 利福平 (rifampicin,rif) 甲氧苄啶 / 磺胺甲噁唑 (trimethoprim/sulfamethoxazole,sxt) 万古霉素 (vancomycin,van) 种抗生素对受试菌株的最低抑菌浓度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 质控菌株 293 操作同上结果判定 : 通常将无细菌生长的抗生素最低浓度定位 MIC, 对含甲氧苄啶或磺胺类等抗生素的结果, 以细菌生长数量较生长对照孔有 80% 及以上的减少定为 MIC 参照美国临床和实验室标准委员会 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 的解释标准, 将结果判定为 : 敏感 (S) 中介 (I) 耐药 (R) 多重耐药 (multi-drug resistance,mdr) 的判定标准为菌株对 3 类及以上的抗生素表现为耐药, 该菌株即为 MDR 5. 菌株活化和 DNA 制备 : 菌株划线接种脑心浸液琼脂平板,(37±) 培养 8~24 h 后, 挑取单菌落分别接种于脑心浸液肉汤和脑心浸液琼脂平板,(37±) 培养 8~24 h 按照试剂盒说明书的方法进行操作, 提取实验菌株的基因组 DNA 6.MLST 分型 : 根据金黄色葡萄球菌的 7 个管家 [] 基因序列 ( 表 ), 用 PCR 方法进行扩增 PCR 产物送公司进行纯化和测序, 将所获得的 7 个管家基因序列导入 BioNumerics 7.6 软件 ( 比利时 Applied Math) 分析其等位基因号和序列型 (sequence type, ST) 用 eburst 软件 ( 将本研究所鉴定的 ST 型与数据库中所有目前国际上报道的 ST 型进行比较以获得其克隆簇 (clonal complex, CC) [22] 7.spa 分型 : 用 PCR 方法进行 spa 分型引物序列为 SpaF: 5'-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3', SpaR:5'-AGACGATCCTTCGGTGAGC-3' PCR 产物送公司进行纯化和测序, 获得的序列导入 BioNumerics 7.6 软件进行分析, 获得各菌株的 spa 型基因表 arcc aroe glpf gmk pta tpi yqil 多位点序列分型中管家基因引物序列及预期片段大小预期片段引物序列 (5'~3') 大小 (bp) 456 TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC AGGTATCTGCTTCAATCAGCG ATCGGAAATCCTATTTCACATTC GGTGTTGTATTAATAACGATATC CTAGGAACTGCAATCTTAATCC TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC ATCGTTTTATCGGGACCATC TCATTAACTACAACGTAATCGTA GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC CAGCATACAGGACACCTATTGGC CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC MLVA 分型 : 根据 MLVA( net) 网站公布的 8 个数目可变串联重复序列 (variable number of tandem repeats,vntr ) 位点的引物序列和方法 ( 表 2), 采用多重 PCR 方法进行扩 [23] 增 PCR 产物送公司测序分析, 以 GeneScan 200 LIZ 内标作为片段大小标准, 将测序结果导入 GeneMarker 软件进行扩增片段大小的分析, 实验所得的数据与 MLVA 数据库数据中 Saureus_MLVA_allele_size 进行比对, 获得每个等位基因的重复数 8 个等位基因的重复数按照 VNTR09-0 VNTR6-0 VNTR6-02 VNTR67-0 VNTR-0 VNTR24-0 VNTR63-0 VNTR8-0 的顺序连成一串即 MLVA 谱, 如 , 将其提交至网站获得对应的 MLVA 型 (MT) 和 MLVA 复合体 (MLVA complex, MC), 获得的 MLVA 谱导入 BioNumerics 7.6 软件进行聚类分析

4 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No VNTR 位点 VNTR09_0 VNTR6_0 VNTR6_02 VNTR67_0 VNTR_0 VNTR24_0 VNTR63_0 VNTR8_0 表 2 株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 8 个数目可变串联重复序列位点的引物序列情况引物序列 (5'~3') 重复单元大小 (bp) 重复单元次数重复序列片段大小 (bp) 9 0~20 238~472 FAM-ATAAGCATTGAAACCATTATGATG GCAACTTCTTAAAACAAAATATTG 60 0~7 239~666 HEX-AATGCACATGAAACACTAATT GGTCAAGAATATTTAAAATCAATT 66 0~9 206~755 ROX-CTGTGAAGTTAGATAGATGAGTTT GCAATTAACGATTTCTTCAC 67 0~0 45~85 FAM-CGTGAATCTCTTTTATAAGAGTGT CCCTCCTATTAATATATATACCGT 0~20 0~530 HEX-GTCGATAAAGCATAAAGCTTT AGCAATGAATCAATAATTTTCA 24 0~25 49~762 FAM-CAGCAGTAGTGCCGTT GTAACGGCTTCATCCA 64 0~ 268~96 HEX-TGAAGATGTAGTAGGAATGTTAGT AGAAAAAGCTAAAGAAGTTGAA 8 ~2 72~ 063 ROX-TTTGGATATGAAGCGAGA CATATGTCGCAGTACCATC 9.PFGE 分型 : 参照文献 [24] 的方法, 用新鲜培养的金黄色葡萄球菌菌落制备菌悬液, 取 200 µl 菌悬液加入 2 μl 的葡萄球菌溶菌素 ( mg/ml) 和 0 μl 的溶菌酶 (20 mg/ml),55 水浴 20 min 破壁后, 加入 200 μl % SeaKem Gold 琼脂糖制备 plug 实验菌株用限制性内切酶 Sma Ⅰ 30 酶切至少 3 h, H982 用 Xba Ⅰ 37 酶切至少 2 h 使用 CHEF-mapper XA 型脉冲场凝胶电泳仪和 0.5 TBE 进行电泳设置电泳参数,low MW-49kb,high MW-450kb, 电泳时间 9 h 用 GEL DOC XR 凝胶成像系统拍摄图像所获电泳图谱用 BioNumerics 7.6 软件进行处理, 绘制菌株间关系的树状图, 判定菌株间的亲缘关系, 方法采用 UPGMA (unweighted pair-group mean arithmetic) 进行聚类分析, 菌株之间的差异程度用 Diec 相似性系数来确定 0. 分型方法的分辨能力 : 采用 Simpson 区分系数 (index of diversity) [23], 评价各方法的分型能力, 以发现适合 MSRA 最强分辨率的分型方法, 公式如下 :DI = - [N(N - )] s n j (n j - ), 其中 s 为总分型 j - 数 ;n j 为第 j 个型中含有的菌株数 ;N 为菌株总数结果. 抗生素敏感性试验结果 : 株菌均为多重耐药, 对苯唑西林苄青霉素克林霉素和红霉素均表现为耐药, 对四环素环丙沙星甲氧苄啶 / 磺胺甲噁唑和庆大霉素耐药等额菌株分别有和 6 株, 此外有株 MRSA 菌株对左氧氟沙星 (MIC= 32 µg/ml) 莫西沙星 (MIC>6 µg/ml) 和利福平 (MIC=6 µg/ml) 等均耐药所有菌株对万古霉素均敏感详见表 3 2.MLST 分型 : 株 MRSA 共识别到 6 个 ST 型, 获得 4 个克隆簇其中有 3 株菌为 ST9 型, 等位基因谱是 , 为优势序列型, 与 ST903 型 ( 株 ) 均属于 CC9, 为优势克隆簇 ;ST59 和 ST338 型各有 2 株菌, 均属于 CC59;2 株 ST630 型属于 CC8; ST0 型有株菌, 属于 CC0 详见图 2

5 368 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No. 4 抗生素表 3 苯唑西林苄青霉素克林霉素红霉素四环素环丙沙星甲氧苄啶 / 磺胺甲噁唑庆大霉素左氧氟沙星莫西沙星利福平株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对种抗生素的耐药情况敏感中介 MIC50 MIC90 (µg/ml) (µg/ml) 菌株数菌株数 > > > > /4.75 >8/ 耐药菌株数注 :MIC: 最小抑菌浓度 ;MIC50: 拟制 50% 菌株时的 MIC 值 ; MIC90: 拟制 90% 菌株时的 MIC 值 3.spa 分型 : 株 MRSA 菌株共识别到 7 个 spa 型, 包括 2 个流行克隆和 5 个散发克隆流行克隆为 t899(9 株 ) 和 t437(7 株 ) 型 ; 散发克隆为 t030 t72 t337 t244 和 t4549 型, 各有株 MRSA 详见图 2 4.MLVA 分型 : 株 MRSA 共识别到 9 个 MLVA 型 ( 图 2) 其中主要的 MLVA 型为 MT 929 和 MT6, 分别有 9 和 4 株 MRSA; 其次有 2 株 MRSA 的 MLVA 型为 MT622; 其他 6 个 MLVA 型各有株 6 有 8 个 MLVA 型的 20 株 MRSA 被指定为 4 个 MLVA 复合体, 其中以 MC2236(9 株 ) 和 MC6(8 株 ) 为主, 分别含有和 4 个 MLVA 谱 ; 其次为 MC8(2 株 ), 含有 2 个 MLVA 谱 ; 此外, 株 MT3054 型的 MRSA 菌株被指定为与 MC6 关系最近的 MLVA 复合体, 即 NMC6; 而株 MT3028 型的 MRSA 菌株未能识别到 MLVA 复合体, 与其他 MLVA 复合体的关系均较远, 详见图 3 5.PFGE 分型 : 株 MRSA 菌株共得到 9 个 PFGE 带型, 以同源性 72% 作为截断值 (cut-off) 的阈值, 可将株 MRSA 菌株分为 5 个簇 ( 即 Ⅰ~Ⅴ), 其中 Ⅳ 和 Ⅴ 分别含有 9 株菌,Ⅰ~Ⅲ 分别各有株菌详见图 3 6. 分型方法的分辨能力比较 :PFGE MLVA spa 及 MLST 法的分型能力区分系数 DI 值依次为和主要 MRSA 流行克隆及其耐药谱 : 由图 3 可见,9 株分离自生猪肉的 MRSA 具有相同的克隆簇 ST 型 spa 型和 MLVA 型, 即 CC9-ST9-t899-MT929-MC2236, 同时也具有相近的 PFGE 带型 (Ⅴ), 为主要的流行克隆, 其对应的耐药谱有 2 种, 即 BEN-OXA-CIP-ERY-CLI-TET-SXT 和 BEN-OXA-GEN-CIP-ERY-CLI-TET-SXT; 有 2 株为 CC59-ST338-t437-MT6-MC6(PFGE 带型 Ⅳ), 其对应的耐药谱有两种,BEN-OXA-ERY-CLI 和 BEN-OXA-ERY-CLI-TET; 其他株则具各自的分型特点讨论图中每个小点代表个序列型的菌株, 多个相同型别的菌株聚类成克隆簇, 本研究鉴定的 ST9 ST0 ST59 ST338 ST630 和 ST903 用粉色圈表示图株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的 eburst 分析结果金黄色葡萄球菌毒力和耐药基因包括可移动遗传元件如质粒前噬菌体和毒力基因岛等, 可通过水平传递在食品等环境介质以及人体中传递给其他致病菌, 给食品安全 [25-26] 和人类健康带来严重危害由于 MRSA 对抗生素的耐药性, 且在环境中具有较强的适应和定植能力, 一直以来受到各国政府的高度关注本研究株食源性 MRSA 菌株均为多重耐药, 人一旦感染上述菌株, 将造成严重的经济和社会负 [27-28] 担因此, 掌握 MRSA 菌株的流行趋势和遗传特征, 对预防和控制 MRSA 的传播具有重要意义目

PFGE 聚类分析图及 MLVA spa 分型 MLST 和耐药谱图中相同的 MLVA 型聚类为同一个圆圈, 每个圆圈的大小代表该型别所包含的菌株数, 相同的 MC 聚类为一簇以灰色阴影标记, 其中绿色代表 MC6, 青绿色代表 N-MC6, 红色代表 MC2236, 紫色代表 MC8, 金色代表该 MLVA 谱未能识别到 MC;MLVA: 多位点可变数目串联重复序列分析 ;

6 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No BEN: 苄青霉素 ;OXA: 苯唑西林 ;GEN: 庆大霉素 ;CIP: 环丙沙星 ;LEV: 左氧氟沙星 ; MOX: 莫西沙星 ;ERY: 红霉素 ;CLI: 克林霉素 ;TET: 四环素 ;RIF: 利福平 ;SXT: 甲氧苄啶 / 磺胺甲噁唑 ;VAN: 万古霉素 ;MLVA: 多位点可变数目串联重复序列分析 ;MLST: 多位点序列分型图 2 株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 PFGE 聚类分析图及 MLVA spa 分型 MLST 和耐药谱图中相同的 MLVA 型聚类为同一个圆圈, 每个圆圈的大小代表该型别所包含的菌株数, 相同的 MC 聚类为一簇以灰色阴影标记, 其中绿色代表 MC6, 青绿色代表 N-MC6, 红色代表 MC2236, 紫色代表 MC8, 金色代表该 MLVA 谱未能识别到 MC;MLVA: 多位点可变数目串联重复序列分析 ; MC:MLVA 复合体图 3 株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的 MC 聚类分析图前, 国内已有大量分子分型技术应用于耐药致病菌流行特征研究的报道 [29-30] CC9 是本研究的优势克隆簇, 据报道,CC9 在全球范围均有流行, 而 CC59 目前包括我国在内的亚太地区已逐渐成为仅次于 CC9 的 CA-MRSA 优势克隆簇 [7],CC8 主要在美国和加拿大等地流行 [7, 3-32], 我国仅在 HA-MRSA 中有检出的报道 [33], 食品中较少见,CC0 属于较为罕见的克隆簇, 在国内首次分离到该克隆簇本研究从即食食品和生猪肉中同时分离到 ST9 型的 MRSA, 且生猪肉来源的 MRSA 具有相同的克隆簇 ST 型 spa 型和 MLVA 型, 提示同一食品来源的菌株其基因型可能也相同研究发现,ST9 型 MRSA 主要来源于猪牛等动物性食品, 是亚洲地区包括中国在内食源性动物中 MRSA 主要的流行株, 而欧美地区食源性动物中 MRSA 流行 [34] [35] 株主要以 ST398 为主 Wang 等于年在陕西从收集的 979 份零售食品中分离到 23 株 MRSA, 主要来自生牛奶猪肉禽肉等动物性产品及其制品, 其中有 52.2% 的 MRSA 为 ST9 型, 这与本研究基本一致, 提示 ST9 型 MRSA 极有可能已经在养殖动物和食品消费链间发生了传递此外, 近期我国临床还从未接触养殖动物的患者中分离到了 3 株 ST9 型 MRSA [36], 提示动物来源的 MRSA 极有可能已经向社区人群扩散并导致疾病发生, 应引起足够重视 spa 分型结果显示,t899 型菌株 (ST9) 为优势克隆, 耐药谱结果显示其耐受 7 种以上抗生素, 耐药现象严重以往报道显示, 我国 ( 陕西上海四川河北和湖北 ) 动物源 MRSA 主要以 ST9-t899 克隆系 [37-39] [39] 为主, 张强等研究显示该克隆系菌株不仅对所有 β- 内酰胺类抗生素都耐药, 对大环内酯类喹诺酮类林可胺类及四环素类等非 β- 内酰胺类抗生素也表现出不同程度的耐药, 这与本研究结果一致, 提示 ST9-t899 克隆系的菌株具有多重耐药特性, 给动物性食品和人类健康构成潜在的风险本研究发现的 t437 型 MRSA 近年来在亚洲欧洲等地 [36,39-40] 区的食品中也多有报道, 有研究认为, 欧洲社区人群和食品中 CC59-t437 型 MRSA 克隆可能是经 [35] 食品贸易和旅行从亚洲传播过去的, 说明 MRSA 克隆株可在不同地域间发生传播和流行本研究结果还显示,MLVA 分型获得的 DI 值虽然低于 PFGE, 但要高于 spa 分型和 MLST, 这与 [23] Schouls 等的研究结果一致 PFGE 分型虽然能够获得很好的分型结果, 但其操作步骤复杂要求高, 不利于各实验室标准化和比较分析, 因而不适于长期大规模的调查监测而 MLVA 操作简便省时省力, 对操作人员的技术水平要求不高, 较 spa 分型和 MLST 又具有较高的分型能力, 分型结果与 PFGE 基本一致, 且不需要进行测序, 在处理食源性 MRSA 所致突发事件时, 可替代上述 3 种方法进行溯源分析, 对快速确定病因食品和暴发菌株具有重要意义同时, 由结果可见, 相同 MLVA 谱型的菌

7 370 中华预防医学杂志 208 年 4 月第 52 卷第 4 期 Chin J Prev Med,April 208, Vol. 52, No. 4 株又能被其他 3 种分型方法识别为不同的基因型, 因此在进行长期分子流行病学研究时, 同时应用 2 种以上的分型方法可以获得更好的分辨率, 可更好地掌握 MRSA 菌株的流行特征和基因多样性此外, 虽然本研究从 202 年全国食品污染物监测网金黄色葡萄球菌菌株中筛选到株 MRSA 菌株进行四种分子分型方法评价, 关于这几种方法在其他食源性 MRSA 菌株分子分型分析应用中可能还存在菌株间的差异, 因此本研究尚存在一定的局限性, 仍需要通过大量 MRSA 菌株进行验证值得注意的是, 通过抗生素药敏试验发现, 不同流行克隆的 MRSA 具有特征性耐药谱, 这对研究不同 MRSA 流行克隆的耐药机制, 进而指导动物养殖和食品生产中抗生素的合理应用, 从根本上控制 MRSA 对食品的污染和对人群的健康危害具有重要意义参考文献 [] de Carvalho Ferreira D, Cisne FAC, Cavalcante FS, et al. Necrotizing fasciitis secondary to community pneumonia by Panton-Valentine leukocidin-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus [J]. Am J Respir Crit Care Med, 202, 86(2): DOI: 0.64/ajrccm [2] Changchien CH, Chen YY, Chen SW, et al. Retrospective study of necrotizing fasciitis and characterization of its associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Taiwan [J]. BMC Infect Dis, 20, : 297. DOI: 0.86/ [3] Gonzalez BE, Teruya J, Mahoney DH, et al. Venous thrombosis associated with staphylococcal osteomyelitis in children [J]. Pediatrics, 2006, 7(5): DOI: 0.542/peds [4] Seltz LB, Smith J, Durairaj VD, et al. Microbiology and antibiotic management of orbital cellulitis [J]. Pediatrics, 20, 27(3): e DOI: 0.542/peds [5] Köck R, Becker K, Cookson B, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): burden of disease and control challenges in Europe [J]. Euro Surveill, 200, 5(4): [6] David MZ, Daum RS. Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: epidemiology and clinical consequences of an emerging epidemic [J]. Clin Microbiol Rev, 200, 23(3): DOI: 0.28/CMR [7] Song JH, Hsueh PR, Chung DR, et al. Spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus between the community and the hospitals in Asian countries: an ANSORP study [J]. J Antimicrob Chemother, 20, 66(5): DOI: 0.093/jac/dkr024. [8] Four pediatric deaths from community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus Minnesota and North Dakota, [J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 999, 48(32): [9] Nichol KA, Adam HJ, Hussain Z, et al. Comparison of community-associated and health care-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Canada: results of the CANWARD study [J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 20, 69(3): DOI: 0.06/j. diagmicrobio [0] Hennekinne JA, De Buyser ML, Dragacci S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation [J]. FEMS Microbiol Rev, 202, 36(4): DOI: 0./j x. [] Crago B, Ferrato C, Drews SJ, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in food samples associated with foodborne illness in Alberta, Canada from 2007 to 200 [J]. Food Microbiol, 202, 32 (): DOI: 0.06/j. fm [2] 王伟, 郭云昌, 裴晓燕, 等. 中国食源性和猪源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌遗传特性和耐药特征分析 [J]. 卫生研究, 203, 42(6): [3] 王迪, 张晓嫒, 陈倩, 等. 北京市食源性耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的分子特征研究 [J]. 中国卫生检验杂志, 204, 24(22): [4] Wang JL, Wang JT, Sheng WH, et al. Nosocomial methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteremia in Taiwan: mortality analyses and the impact of vancomycin, MIC= 2 mg/l, by the broth microdilution method [J]. BMC Infect Dis, 200, 0: 59. DOI: 0.86/ [5] Sallam KI, Abd-Elghany SM, Elhadidy M, et al. Molecular Characterization and Antimicrobial Resistance Profile of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Retail Chicken [J]. J Food Prot, 205, 78(0): DOI: 0.435/ X.JFP [6] Jackson CR, Davis JA, Barrett JB. Prevalence and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from retail meat and humans in Georgia [J]. J Clin Microbiol, 203, 5(4): DOI: 0.28/ JCM [7] Li G, Wu C, Wang X, et al. Prevalence and characterization of methicillin susceptible Staphylococcus aureus ST398 isolates from retail foods [J]. Int J Food Microbiol, 205, 96: DOI: 0.06/j.ijfoodmicro [8] 王迪, 张晓嫒, 陈倩, 等. 北京市食源性金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究 [J]. 中国食品卫生杂志, 204, 26(5): DOI: /j.cjfh [9] 王茂起, 刘秀梅, 王竹天. 中国食品污染监测体系的研究 [J]. 中国食品卫生杂志, 2006(06): DOI:0.3969/j. issn [20] Jorgensen JH. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline [S]. Wayne Pennsylvania: Clinical Laboratory Standards Institute, 205. [] Enright MC, Day NP, Davies CE, et al. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus [J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): [22] Harmsen D, Claus H, Witte W, et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management [J]. J Clin Microbiol, 2003, 4(2): [23] Schouls LM, Spalburg EC, van Luit M, et al. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis of Staphylococcus aureus: comparison with pulsed-field gel electrophoresis and spa-typing [J]. PLoS One, 2009, 4(4): e5082. DOI: 0.37/

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2012 11 43 11 855 35-80 55 P < 0. 05 1. 2. 2 168 - P < 0. 05 53 31. 5% 48 28. 6% α = 2α /k k - 1 α = 0. 05 k = 3 α = 0. 016 7 P < 20 0. 016 7 2 40 2.

2012 11 43 11 855 35-80 55 P < 0. 05 1. 2. 2 168 - P < 0. 05 53 31. 5% 48 28. 6% α = 2α /k k - 1 α = 0. 05 k = 3 α = 0. 016 7 P < 20 0. 016 7 2 40 2. 854 林伟 1, 程金妹 2* 2, 王英歌 1 350000 2 * E-mail chengjinmei0687@ sina.com 目的方法 2008-01 ~ 2012-01 结果 10. 43% 3. 93% P < 0. 05 34. 4% 30. 4% P > 0. 05 7 d 0. 63% 7 d P < 0. 05 结论 R763 A 1007-6611 2012