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1 :12:47 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2018, 40(2): DOI: /cjcb GATA-1/2 对感染 HCMV 人单核细胞中病毒 LUNA 基因转录的影响 郭彬瀚 张梦伊 刘艳清 赖媚媚 卢雨田 王慧燕 1,2 郑晓群 * ( 1 温州医科大学附属第二医院, 温州 ; 2 温州医科大学检验医学院, 温州 ; 3 检验医学教育部重点实验室, 温州 ) 摘要该文通过建立人巨细胞病毒 (human cytomegalovirus, HCMV) 感染人单核白血病细胞 (THP-1) 的潜伏和激活细胞模型, 研究转录因子 GATA-1/2 与 HCMV LUNA(latency unique nuclear antigen) 基因转录的关系 采用免疫印迹 (Western blot) 技术检测 HCMV 潜伏和激活感染组 GATA-1/2 蛋白质水平 ; 染色质免疫共沉淀 (chromatin immnuoprecipitation, ChIP) 技术检测 GATA-1/2 与 LUNA 基因 5 上游序列结合情况 ; 采用 shrna 干扰技术敲低 THP-1 细胞中 GATA-1/2 的表达后, 检测潜伏和激活感染组 HCMV LUNA 基因 mrna 水平 结果表明, HCMV 潜伏感染组 LUNA 基因 mrna 及 GATA-1/2 蛋白质水平均高于激活感染组, 差异有显著统计学意义 (P<0.01); HCMV 潜伏感染组转录因子 GATA-1/2 与 LUNA 基因 5 启动子区域结合率低于激活感染组, 差异有显著统计学意义 (P<0.01); shrna 干扰技术敲低 THP-1 细胞 GATA-1/2 后, HCMV LUNA 基因 mrna 水平出现下调 研究结果表明, 转录因子 GATA-1/2 在 HCMV 潜伏和激活感染 THP-1 细胞时与 LUNA 基因 5 上游启动子区域存在结合, 并与 LUNA 基因的表达有关 关键词 HCMV; LUNA; GATA-1/2; 转录因子 ; 感染 Effects of GATA-1/2 on the Transcription of LUNA Gene in Human Monocytes Infected with HCMV Guo Binhan, Zhang Mengyi, Liu Yanqing, Lai Meimei, Lu Yutian, Wang Huiyan 1,2, Zheng Xiaoqun * ( 1 The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou , China; 2 School of Laboratory Medical Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou , China; 3 The Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education of China, Wenzhou , China) Abstract This study investigated the relationship between transcription factor GATA-1/2 and human cytomegalovirus (HCMV) latency unique nuclear antigen (LUNA) gene using established HCMV latent and activated infection models. The protein level of GATA-1/2 were determined by Western blot. The binding of GATA- 1/2 with 5 upstream sequence of LUNA gene were assessed by chromatin immnuoprecipitation (ChIP). Moreover, the level of LUNA mrna was detected by RT-PCR after GATA-1/2 were interfered. The results showed that the expression of LUNA gene and GATA-1/2 in latent infection group were both higher than activated infection group, 收稿日期 : 接受日期 : 浙江省自然科学基金 ( 批准号 : LY13H190006) 和浙江省医药卫生项目 ( 批准号 : 2017KY474) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , jszhengxq@163.com Received: September 21, 2017 Accepted: November 9, 2017 This work was supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Grant No.LY13H190006) and the Medical and Health Issues Project of Zhejiang Province (Grant No.2017KY474) *Corresponding author. Tel: , jszhengxq@163.com

2 232 研究论文 and the difference was statistically significant (P<0.01). The binding rate of transcription factor GATA-1/2 with 5 terminal of promoter of LUNA gene in latent infection group was lower than that of activated infection group, and the difference was statistically significant (P<0.01). The expression of LUNA gene were both downregulated in HCMV latent and activated infection group after GATA-1/2 were interfered. Our results indicated that the transcription factor GATA-1/2 is involved in the presence of LUNA 5 upstream promoter region in HCMV latent and activated infection, and participates in the process of HCMV latent and activated infection. Keywords HCMV; LUNA; GATA-1/2; transcription factor; infection 人巨细胞病毒 (human cytomegalovirus, HCMV) 是一类人群普遍感染的疱疹病毒 HCMV 感染宿主 后, 常通过多种途径逃避宿主的免疫监视及防御功 能, 并在宿主体内建立长期潜伏感染 当宿主免疫 功能不全或低下时, 潜伏感染的病毒被激活, 易引起 播散性疾病或器官损害, 甚至威胁生命 [1-2] 因此, 及 早发现 HCMV 感染对其预防及治疗至关重要 尽管 目前关于 HCMV 感染的研究已取得了较大进展, 但 迄今为止, HCMV 潜伏和激活感染的分子机制仍不 明确 既往研究证实, HCMV 潜伏感染时, 病毒基因 虽以低水平复制的形式持续存在, 但是一些病毒基 因 ( 如病毒 LUNA 基因 UL111A 和 UL138 等 [3-4] ) 仍然 是转录的, 与病毒的复制 感染有着密不可分的关 系 其中, 病毒 LUNA 基因通过影响病毒基因 UL82 mrna 的稳定性与翻译, 进而介导病毒被膜蛋白 pp71 的合成来调控 HCMV 的潜伏和激活感染 [5-6] 转录因子 GATA-1/2 是造血细胞分化的重要调节因 子, 含 2 个锌指结构, 即 C- 锌指和 N- 锌指, 可通过与 基因启动子中 (A/T)GATA(A/G) 模块结合影响基因 的转录 [7] 经生物信息学分析表明, 在 HCMV LUNA 基因的启动子区交错分布着转录因子 GATA-1/2 的 结合位点 本文通过建立 HCMV 潜伏和激活感染 的 THP-1 细胞模型, 明确 GATA-1/2 与 LUNA 基因启 动子区的结合情况, 探讨 HCMV 潜伏与激活感染时 GATA-1/2 对 LUNA 基因转录的影响 1 材料与方法 1.1 细胞株与病毒株 HCMV Towne 株来自中国典型培养物保藏中 心, THP-1 细胞 ( 人急性单核白血病细胞 ) 以及 293T 细 胞 ( 人胚肾 T 细胞 ) 购自中国科学院上海细胞库, HEL 细胞 ( 人胚肺成纤维细胞 ) 购自中国科学院昆明动物 研究所 1.2 主要试剂佛波酯 (PMA) 以及细胞总蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术研究所 Trizol 提取试剂购自 Invitrogen 公司 mirneasy Mini Kit 购自 QIAGEN 公司 SYBR Premix Ex Taq 购自 TaKaRa 公司 RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit 试剂盒购自 Thermo Scientific 公司 GATA-1/2 兔抗人抗体购自 Abcam 公司 PCR 引物由生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司合成 ChIP 试剂盒购自 Millipore 公司 Trans10 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司 VSVG 质粒购自上海吉然生物科技有限公司 RNAi-Ready psiren-retroq 质粒购自 Clontech 公司 Gagpol 质粒购自 Biovector 公司 Polybrene 购自上海吉玛制药技术有限公司 质粒 DNA 小量试剂盒购自 AxyPrep 公司 无内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司 1.3 主要方法 HCMV 潜伏和激活感染细胞模型建立 THP-1 细胞的培养以及 HCMV 病毒制备参照我们先前的 [8] 研究 HCMV Towne 株 (MOI=3) 感染 THP-1 细胞, 37 C 5% CO 2 恒温培养箱中培养 3 d 后, 建立潜伏感染模型 100 ng/ml 佛波酯 (PMA) 刺激 HCMV 潜伏感染的 THP-1 细胞分化为巨噬细胞, 于 37 C 5% CO 2 恒温培养箱培养 3 d 后建立激活感染模型 对照组加入与病毒液等量的 RPMI-1640 培养液, 同条件培养 HCMV 潜伏和激活感染组 IE1(immediate early 1) 以及 LUNA 基因表达的检测使用 QIAGEN 公司的 mirneasy Mini Kit 试剂盒提取 HCMV 潜伏和激活感染组的细胞总 RNA 并测定浓度及纯度 取 1 μg 总 RNA, 按照 Thermo 公司 RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit 试剂盒说明书进行操作, 逆转录为 cdna 应用 Primer Premier 5.0 软件设计 IE1 LUNA 基因以及内参基因 GAPDH 的 PCR 引物, 上述

3 郭彬瀚等 : GATA-1/2 对感染 HCMV 人单核细胞中病毒 LUNA 基因转录的影响 233 得到 cdna 进行 PCR 扩增所得产物用 2% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析 使用 ImageJ 软件对电泳条带进行灰度分析, 目的基因灰度值与内参基因灰度值之比表示 IE1 以及 LUNA 基因的相对表达量 所用 PCR 引物序列见表 Western blot 检测转录因子 GATA-1/2 蛋白质水平利用细胞总蛋白提取试剂盒提取对照组 HCMV 潜伏和激活感染组细胞总蛋白 将提取的蛋白质样品与 5 1 蛋白质上样缓冲液按4 的比例混匀, 100 C 加热变性 10 min, 调节蛋白质浓度一致, 然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 用事先活化的硝酸纤维素膜 (nitrocellulose filter membrane) 在恒流 300 ma 条件下转膜 60 min, 5% 脱脂奶粉封闭 2 h, 分别用相应的 000) 5 GAPDH(1 000) 1 GATA-2(1 000) 1 GATA-1(1 一抗于 4 C 条件下孵育过夜 TBST 洗膜后, 于 HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗室温孵育 1 h, ECL 发光试剂盒显影 使用 ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度分析, 目的条带灰度值与内参蛋白质灰度值之比表示转录因子 GATA-1/2 的相对表达量 ChIP 检测 HCMV 潜伏和激活感染组 GATA-1/2 与 LUNA 基因的结合对 HCMV LUNA 基因 5 端上游约 1 Kb 左右的核酸序列进行生物信息学分析, 应用 TRANSFAC 数据库中 MATCH 工具对分析序列的转录因子结合位点进行预测 该数据库通过每个位 点的所得分数 (0~1) 来确定转录因子结合位点 经过筛选, 我们确定 HCMV LUNA 基因 5 上游序列 831 位点和 172 位点分别与 GATA-1 GATA-2 存在结合, 并进行后续 ChIP-PCR 引物设计 使用 Millipore 公司的 EZ-ChIP Kit 处理对照组 HCMV 潜伏和激活感染组细胞 根据试剂盒说明书进行染色质免疫共沉淀, 操作步骤如下 : 加入 37% 甲醛体外交联和裂解细胞 DNA, 超声处理 ( 功率 500 W, 超声 7 s, 停 10 s, 重复 3 次 )DNA, 使交联的 DNA/ 蛋白质共沉淀, 洗脱 DNA/ 蛋白质复合物, 解交联, 纯化 DNA 将各组得到的 DNA 产物分别加入对应的引物进行 PCR 扩增, 扩增产物用 2% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析 电泳结果使用 ImageJ 软件进行灰度分析, 并以抗体处理组与 Input 自身对照组的电泳结果灰度值之比表示 GATA- 1/2 与 LUNA 基因的结合率 shrna 干扰对 HCMV LUNA 基因转录的影响根据文献 [9] 设计了针对 GATA-1/2 基因分别有干扰作用的 shrna 序列 ( 表 2); 将退火双链小片段与 RNAi -Ready psiren-retroq 载体连接后导入感受态细胞, 筛选阳性菌落并抽提质粒 DNA 送至杭州擎科生物公司测序 待插入序列鉴定正确后, 在 293T 细胞 [(4~6) 10 6 /10 cm 2 培养皿 ] 中构建慢病毒并收集用于转染 THP-1, polybrene(10 mg/ml) 转染操作按照说明书进行, 补齐培养液后于 37 C 5% CO 2 恒温培 表 1 HCMV IE1 LUNA 以及 GAPDH 引物 Table 1 The primers of HCMV IE1, LUNA and GAPDH 引物名称 Primer name 引物序列 (5 3 ) The sequence of primer (5 3 ) 产物大小 The length of primer IE1 F CAA GAG AAA GAT GGA CCC TG 242 bp IE1 R CGA GTT CTG CCA GGA CAT C GAPDH F GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT 185 bp GAPDH R GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT LUNA F GAG CCT TGA CGA CTT GGT AC 241 bp LUNA R GAG CCT TGA CGA CTT GGT AC shrna 名称 shrna name sh-gata1 F sh-gata1 R sh-gata2 F sh-gata2 R 表 2 合成的 shrna 对应的 DNA 序列 Table 2 Synthesized DNA sequence correlated to shrna shrna 序列 (5 3 ) The sequenceofshrna (5 3 ) GAT CCA GCG CCT GAT TGT CAG TAA ACT TCA AGA GAG TTT ACT GAC AAT CAG GCG CTT TTT TG AAT CCA AAA AAA GCG CCT GAT TGT CAG TAA ACT CTC TTG AAG TTT ACT GAC AAT CAG GCG CTG GAT CCG AAC CGG AAG ATG TCC AAC AAT TCA AGA GAT TGT TGG ACA TCT TCC GGT TCT TTT TTG AAT CCA AAA AAG AAC CGG AAG ATG TCC AAC AAT CTC TTG AAT TGT TGG ACA TCT TCC GGT TCG

4 234 研究论文 养箱中培养 2 d 后, 先后使用 1.0 μg/ml 1.5 μg/ml puromycin 筛选阳性转染的细胞 经过两次筛选存 活下来的细胞进行扩大培养, 待其状态良好后使用 HCMV 感染建立潜伏和激活模型, 提取细胞总 RNA 后, RT-PCR 检测 HCMV LUNA 基因的表达情况 1.4 统计学处理 数据采用 SPSS 18.0 统计学软件进行分析, 数 据用均数 ± 标准差 (mean±s.d.) 表示, 两组间比较采 用 t 检验, 多组间比较用单因素方差分析 (One-Way ANOVA), 以 P<0.05 为差异有统计学差异 2 结果 2.1 HCMV 潜伏和激活感染组 IE1 LUNA 基因 的表达水平 为证明成功建立 HCMV 潜伏和激活感染细胞 模型, 我们使用 RT-PCR 实验分别检测了 HCMV IE1 和 LUNA 基因的表达 HCMV 潜伏感染组在 1 d 时 IE1 基因有表达, 随后逐渐降低或不表达 ; HCMV 激 活感染组在 1 d 时 IE1 基因有表达, 随后表达逐渐增 加 HCMV 潜伏感染组在 1~3 d 时 LUNA 基因持续 表达 ; HCMV 激活感染组在 1 d 后 LUNA mrna 水平 下降 上述实验结果表明, HCMV 潜伏感染组 IE1 LUNA mrna 水平与激活感染组存在显著的统计学差异 (P<0.01, 图 1) 2.2 HCMV 潜伏和激活感染组转录因子 GATA- 1/2 蛋白质水平的变化为了解 HCMV 潜伏和激活感染组 GATA-1/2 蛋白质水平的差异, 我们通过 Western blot 实验发现, HCMV 潜伏感染组 GATA-1 在 1~3 d 持续表达 ; HCMV 激活感染组 GATA-1 在 1 d 后表达明显下降 结果表明, HCMV 潜伏感染组 GATA-1 的表达明显高于激活感染组, 差异具有显著统计学意义 (P<0.01, 图 2) 同等实验条件下, HCMV 潜伏感染组在 1 d 后 GATA-2 水平下降, 低于对照组 ; HCMV 激活感染组在 1~3 d GATA-2 水平与对照组差异不大 结果表明, HCMV 潜伏感染组 GATA-2 的水平高于激活感染组, 差异具有统计学意义 (P<0.05, 图 3) 2.3 HCMV 潜伏和激活感染组 GATA-1/2 与 LUNA 基因 5 上游序列结合情况基于 ChIP 实验我们发现, GATA-1 与 HCMV LUNA 基因 5 上游序列 831 位点存在结合, HCMV 潜伏感染组 GATA-1 与 HCMV LUNA 基因启动子区的结合率较 A: IE1 mrna 水平 ; B: IE1 mrna 相对水平的统计分析 ; C: LUNA mrna 水平 ; D: LUNA mrna 相对水平的统计分析 NI: 对照组 ; Latent infection: HCMV 潜伏感染组 ; Activated infection: HCMV 激活感染组 Mean±S.D., n=3 **P<0.01, ***P<0.001, HCMV 潜伏感染组与 HCMV 激 活感染组相比较 A: the level of IE1 mrna; B: the statistical analysis of relative level of IE1 mrna; C: the level of LUNA mrna; D: the statistical analysis of relative level of LUNA mrna. NI: control group; Latent infection: HCMV latent infection group; Activated infection: HCMV activated infection group. Mean±S.D., n=3. **P<0.01, ***P<0.001, latent group vs activated group. 图 1 HCMV 潜伏和激活感染 THP-1 细胞时 IE1 LUNA 基因的表达 Fig.1 The expression of HCMV IE1 and LUNA genes in HCMV latent and activated infection

5 郭彬瀚等 : GATA-1/2 对感染 HCMV 人单核细胞中病毒 LUNA 基因转录的影响 235 A: GATA-1 蛋白质水平 ; B: GATA-1 蛋白质相对水平的统计分析 NI: 对照组 ; Latent infection: HCMV 潜伏感染组 ; Activated infection: HCMV 激 活感染组 Mean±S.D., n=3 **P<0.01, ***P<0.001, HCMV 潜伏感染组与 HCMV 激活感染组相比较 A: the level of GATA-1 protein; B: the statistical analysis of relative level of GATA-1 protein. NI: control group; Latent infection: HCMV latent infection group; Activated infection: HCMV activated infection group. Mean±S.D., n=3. **P<0.01, ***P<0.001, latent group vs activated group. 图 2 HCMV 潜伏和激活感染 THP-1 细胞时转录因子 GATA-1 蛋白质水平 Fig.2 The protein level of transcription factor GATA-1 in HCMV latent and activated infection A: GATA-2 蛋白质水平 ; B: GATA-2 蛋白质相对水平的统计分析 NI: 对照组 ; Latent infection: HCMV 潜伏感染组 ; Activated infection: HCMV 激活感染组 Mean±S.D., n=3 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, HCMV 潜伏感染组与 HCMV 激活感染组相比较 A: the level of GATA-2 protein; B: the statistical analysis of relative level of GATA-2 protein. NI: control group; Latent infection: HCMV latent infection group; Activated infection: HCMV activated infection group. Mean±S.D., n=3. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, latent group vs activated group. 图 3 HCMV 潜伏和激活感染 THP-1 细胞时转录因子 GATA-2 蛋白质水平 Fig.3 The protein level of transcription factor GATA-2 in HCMV latent and activated infection A: HCMV 潜伏和激活感染组 ChIP 实验后 PCR 产物电泳结果 ; B: HCMV 潜伏和激活感染组 GATA-1/2 相对结合程度的统计分析 Input: 阴性对照 组 ; Anti-TF: 抗体处理组 ; Isotype: 同型对照组 Mean±S.D., n=3 **P<0.01, ***P<0.001, HCMV 潜伏感染组与 HCMV 激活感染组相比较 A: PCR product electrophoresis of HCMV latent and activated infection after ChIP; B: the statistical analysis of relative binding intensity of GATA- 1/2 in latent and activated infection. Input: negative control group; Anti-TF: antibody treatment group; Isotype: isotype control group. mean±s.d., n=3. **P<0.01, ***P<0.001, latent group vs activated group. 图 4 HCMV 潜伏和激活感染时转录因子 GATA-1/2 与 LUNA 基因结合的 ChIP 结果 Fig.4 HCMV LUNA binding with transcription factor GATA-1/2 in latent and activated infection detected by ChIP

6 236 研究论文 A: GATA-1/2 蛋白质水平 ; B: GATA-1/2 蛋白质相对水平的统计分析 Blank: 空白对照组 ; shctrl: 阴性对照组 ; shgata-1: GATA-1 shrna 干扰 组 ; shgata-2: GATA-2 shrna 干扰组 Mean±S.D., n=3 **P<0.01, 与阴性对照组相比较 A: the level of GATA-1/2 protein; B: the statistical analysis of relative level of GATA-1/2protein. Blank: blank control group; shctrl: negative control group; shgata-1: GATA-1 shrna group; shgata-2: GATA-2 shrna group. Mean±S.D., n=3. **P<0.01 vs negative control shrna group. 图 5 GATA-1/2 敲低 THP-1 细胞株构建 Fig.5 The construction of GATA-1/2 knockdown THP-1 cell line A: GATA-1 shrna 干扰 THP-1 细胞后 LUNA mrna 水平 ; B: GATA-2 shrna 干扰 THP-1 细胞后 LUNA mrna 水平 NI: 对照组 ; Latent infection: HCMV 潜伏感染组 ; Activated infection: HCMV 激活感染组 A: the level of LUNA mrna in THP-1 treated with GATA-1 shrna; B: the level of LUNA mrna in THP-1 treated with GATA-2 shrna. NI: control group; Latent infection: HCMV latent infection group; Activated infection: HCMV activated infection group. 图 6 HCMV 潜伏和激活感染 GATA-1/2 干扰后 THP-1 细胞时 LUNA 基因的表达 Fig.6 The Expression of HCMV LUNA gene in GATA-1/2 knockdown THP-1 cells in latent and activated infection 激活感染组低, 差异具有显著统计学意义 (P<0.001); GATA-2 与 HCMV LUNA 基因 5 上游序列 172 位点存 在结合, HCMV 潜伏感染组 GATA-2 与 HCMV LUNA 基因启动子区的结合率较激活感染组低, 差异具有 显著统计学意义 (P<0.01, 图 4) 2.4 shrna 干扰 GATA-1/2 后 HCMV LUNA 基因 的表达 采用 shrna 分别靶向干扰 GATA-1 和 GATA-2 后, 实验组 GATA-1/2 的表达明显低于空载组, 差异 具有显著统计学意义 (P<0.01, 图 5) HCMV 潜伏 和激活感染 GATA-1/2 干扰后 THP-1 细胞时, LUNA mrna 水平在感染 3 d 内明显降低 ( 图 6) 3 讨论 HCMV 感染具有潜伏 激活的特性, 单核细胞和 [10] 髓系祖细胞是 HCMV 潜伏感染的主要宿主细胞 HCMV 潜伏感染时, 可编码一些称为巨细胞病毒潜伏相关转录组 (cytomegalovirus latent association [11-12] transcripts, CLTs) 的基因 这些 CLTs 可能是维持病毒潜伏感染所必需的, 其中, LUNA 是 UL81 基因编码的由 133 个氨基酸组成的富含丝氨酸的蛋白质, 与 HCMV 潜伏感染密切相关, 但其在 HCMV 潜伏感染 [6] 中的具体作用机制尚未明确 研究发现, 在 HCMV 血清学阳性的单核细胞中可检测到 LUNA 基因的表达, 表明 HCMV 在潜伏感染单核细胞过程中, 存在 [6,13] 病毒 LUNA 基因的表达 本研究结果同样表明了 HCMV LUNA 基因在两种感染状态下的表达差异, 即 HCMV 潜伏感染时 LUNA 基因表达, 而在激活感染时基本不表达 HCMV 感染髓系祖细胞后, 随着其分化为巨噬

7 郭彬瀚等 : GATA-1/2 对感染 HCMV 人单核细胞中病毒 LUNA 基因转录的影响 237 细胞或树突状细胞, 病毒的早期基因表达就会被激活, HCMV 可由潜伏感染向激活感染转化, 同时产生 [14-15] 具有感染性的子代病毒 HCMV 潜伏感染细胞时, 病毒 CLTs 的表达直接受到细胞一些转录调控因子的影响, 例如核因子 -κb(nuclear factor-κb, NF-κB) CAMP 反应元件结合蛋白 (camp-response element [16] [17] binding protein, CREB) 和 GATA-1/2 等 Reeves 等研究发现, HCMV 感染髓系 CD34 + 细胞时, 病毒 LUNA 基因的表达会受到细胞分化的影响 这主要是由于细胞分化过程中, 病毒 LUNA 基因启动子区受到乙酰化组蛋白以及甲基化酶的调控, 随后转录因子 GATA-2 与病毒 LUNA 基因启动子结合, 通过改变染 [17] 色质结构影响 LUNA 基因的表达 我们先前的研究亦证实, 转录因子 GATA-1 可以与 UL111A 基因结合进而调控其表达, 参与 HCMV 潜伏和激活感染过 [8] 程 LUNA 基因已被证实是 HCMV 潜伏相关基因, 本研究结果表明, HCMV 潜伏和激活感染组转录因子 GATA-1/2 的表达与 LUNA 基因表达相关, GATA- [18] 1/2 可影响病毒基因 LUNA 的转录 Emma 等研究证实, 在 HCMV TB40E/Merlin 病毒株潜伏感染髓系 CD34 + 细胞时, 转录因子 GATA-2 可与 LUNA 基因启动子区域发生结合, 在乙酰化组蛋白作用下对 LUNA 基因的表达进行调控 本研究在 HCMV 感染的细胞模型中, 进一步证实转录因子 GATA-1/2 通过与 LUNA 基因 5 上游序列结合影响 LUNA 基因的转录, 参与 HCMV 潜伏与激活过程 shrna 干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达, 我们利用该技术干扰转录因子 GATA- 1/2 后, 分析病毒 LUNA 基因的表达 以慢病毒为载体的 shrna 干扰技术, 通过扩增的方式使转染成功的细胞基因组中永久包含 shrna 表达框并能稳定表达 shrna, 产生较久的基因沉默效应 本文研究结果显示, 干扰 THP-1 细胞 GATA-1/2 后, 病毒 LUNA 基因的表达受到影响, 这进一步证明转录因子 GATA- 1/2 的表达与病毒 LUNA 基因的表达相关 综合上述结果, 我们认为, GATA-1/2 对 HCMV 潜伏和激活感染组 LUNA 基因的表达发挥着调控作用, 且潜伏感染组调控作用更为明显, 这可能是由于潜伏感染时 GATA-1/2 蛋白表达量较高 在病毒潜伏感染过程中, HCMV 基因的表达增加, 可能有其他病毒产物影 [19-20] 响了细胞转录因子的产生 Poole 等的研究也认为, 在 HCMV 潜伏感染髓系 CD34 + 细胞时, 病毒产生 的 mirna 可以引发胞内转录因子 GATA-2 表达上调, 从而维持病毒在细胞内的潜伏感染, 而在 HCMV 激 活感染中并无无此现象 本研究结果证实, GATA-1/2 与 LUNA 基因启动 子区结合, 初步阐明 GATA-1/2 通过影响病毒 LUNA 基因的转录参与 HCMV 潜伏和激活感染, 为明确 HCMV 感染的分子机制提供实验依据 但由于 HCMV 潜伏与激活感染是一个复杂的过程, 还需进 一步深入研究并进行验证, 例如 GATA-1/2 是如何与 LUNA 基因启动子区结合位点作用, 结合位点的缺失 是否影响 GATA-1/2 的调控功能, 是否存在其他转录 因子作用这些区域等? 相信随着这些问题的逐一阐 明, 将有助于全面理解 HCMV 潜伏和激活感染的分 子机制 参考文献 (References) 1 Mocarski ES, Shenk T, Pass RF. Cytomegaloviruses//Lippincott W, Wilkins. Fields Virology, 5th ed. Philadelphia, PA, USA, 2007, Ross DS, Dollard SC, Victor M, Sumartojo E, Cannon MJ. The epidemiology and prevention of congenital cytomegalovirus infection and disease: activities of the Centers for Disease Control and Prevention Workgroup. J Womens Health (Larchmt) 2006; 15(3): Ma Y, Wang N, Li M, Gao S, Wang L, Zheng B, et al. Human CMV transcripts: an overview. Future Microbiol 2012; 7(5): Slobedman B, Cao JZ, Avdic S, Webster B, McAllery S, Cheung AK, et al. Human cytomegalovirus latent infection and associated viral gene expression. Future Microbiol 2010; 5(6): Bresnahan WA, Shenk TE. UL82 virion protein activates expression of immediate early viral genes in human cytomegalovirus-infected cells. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(26): Reeves M, Sinclair J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 325: Gao J, Chen YH, Peterson LC. GATA family transcriptional factors: emerging suspects in hematologic disorders. Exp Hematol Oncol 2015; 4: 田可港, 浮苗, 高艳, 彭颖, 李祥, 郑晓群, 等. 转录因子 GATA-1 与人巨细胞病毒 UL111A 基因 5 上游序列结合的研究. 中国病理生理杂志 (Tian Kegang, Fu Miao, Gao Yan, Peng Ying, Li Xiang, Zheng Xiaoqun, et al. Binding of transcription factor GATA-1 to 5 upstream sequence of human cytomegalovirus UL111A gene. Chinese Journal of Pathophysiology) 2012; 28(12): Kong SK, Kim BS, Uhm TG, Lee W, Lee GR, Park CS, et al. Different GATA factors dictate CCR3 transcription in allergic inflammatory cells in a cell type-specific manner. J Immunol 2013; 190(11): Rice GP, Schrier RD, Oldstone MB. Cytomegalovirus infects

8 238 研究论文 human lymphocytes and monocytes: virus expression is restricted to immediate-early gene products. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81(19): Kondo K, Kaneshima H, Mocarski ES. Human cytomegalovirus latent infection of granulocyte-macrophage progenitors. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91(25): Kondo K, Xu J, Mocarski ES. Human cytomegalovirus latent gene expression in granulocyte-macrophage progenitors in culture and in seropositive individuals. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93(20): Bego M, Maciejewski J, Khaiboullina S, Pari G, St Jeor S. Characterization of an antisense transcript spanning the UL81-82 locus of human cytomegalovirus. J Virol 2005; 79(17): Goodrum FD, Jordan CT, High K, Shenk T. Human cytomegalovirus gene expression during infection of primary hematopoietic progenitor cells: a model for latency. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(25): Hargett D, Shenk TE. Experimental human cytomegalovirus latency in CD14 + monocytes. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107(46): 李琦涵, 姜莉. 人类疱疹病毒的病原生物学. 北京 : 化学工业出版社 (Li Qihan, Jiang Li. Pathogenesis of Human Herpesvirus. Beijing: Chemical Industry Press), 2009, Reeves MB, Sinclair JH. Analysis of latent viral gene expression in natural and experimental latency models of human cytomegalovirus and its correlation with histone modifications at a latent promoter. J Gen Virol 2010; 91(Pt 3): Poole E, Walther A, Raven K, Benedict CA, Mason GM, Sinclair J. The myeloid transcription factor GATA-2 regulates the viral UL144 gene during human cytomegalovirus latency in an isolatespecific manner. J Virol 2013; 87(8): Poole E, McGregor Dallas SR, Colston J, Joseph RS, Sinclair J. Virally induced changes in cellular micrornas maintain latency of human cytomegalovirus in CD34 progenitors. J Gen Virol 2010; 92(Pt 7): Poole E, Sinclair J. Sleepless latency of human cytomegalovirus. Med Microbiol Immunol 2015; 204(3):

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<30302DB7E2C3E6CDC6BDE9A3A D34A3A92E6D6469> 212 绎 Vol.14 No.5 ScienceDirect 阴 元元 元元 / 99978 5 doi: 1.3969/j.issn.1674-3849.212.5.3 2 1 29 72.7% 21 27.1% 24.26% 1 [1] 1 2 21 7.85 [2] 1 29 21% 662 26 9.38 211 3.8 27.2% 1 212-3-26 212-1-19 元 UL16/9-Y4/CMS/WYT1/ICMS

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