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1 酵素純化與分析 蛋白質純化 Protein Purification 國立台灣大學微生物與生化所莊榮輝

2 如何開始? 先考慮以下諸點 : 5W a. 要純化那一個蛋白質? What? b. 為何要純化此蛋白質? Why? c. 由何種材料純化? Where, from? d. 由那一個生長期? When? e. 如何純化此蛋白質? How?

3 蛋白質純化過程有三個階段 (1) 粗蛋白 (crude protein).. 採樣 均質打破細胞 抽出全部蛋白, 多用鹽析沉澱法 (2) 部分純化 (partially purified).. 初步的純化, 使用各種管柱層析法 (3) 均質蛋白質 (homogeneous).. 目標蛋白質的進一步精製純化, 可用製備式電泳或 HPLC 等

4 蛋白質純化階段及分析方法 A (1) Crude Protein (1% pure) (2) Partially Purified (50~90% pure) (3) Homogeneous (>99%) 純化階段 Material Extraction Protein fractionation Ammonium sulfate Organic solvent Chromatography Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography FPLC Electrophoresis Preparative electrophoresis Isoelectric focusing Pure Enzyme Crystal B 分析方法 Background knowledge about Material Protein / Activity assay Electrophoresis NaivePAGE SDSPAGE Gradient PAGE Antibody production Monoclonal or conventional Kinetic study Molecular weight Sedimentation coefficient determination Quaternary structure Isoelectric focusing Peptide mapping XRay crystallography Amino acid analysis Protein sequencing Extinction coefficient Spectrometric methods CD, ORD, NMR & ESR Immunoassays Immunoblotting ELISA Double diffusion Immunoelectrophoresis (1) 粗蛋白 (2) 部分純化 (3) 均質

5 各種純化或分析方法的原理 細胞 細胞均質 胞器分離 小分子 胺基酸單醣核 酸脂酸 巨分子 核酸蛋白質多醣 ( 脂質 ) 細胞碎片 Cell debris 硫酸銨 沈澱分劃 分子大小不同分子電荷不同分子極性不同親和力不同 Gel filtration, SDSPAGE, Ultrafiltration Ion exchange, Chromatofocusing, DiscPAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Saltingout Affinity chromatography, Hydroxyapatite

6 各種純化方法的應用次序 次數 40 均質 沈澱 離子交換親和層析膠體過濾 步驟

7 蛋白質純化方法 鹽溶鹽析 膠體過濾法 離子交換法 親和層析法 純化策略 最經濟方便的純化依照分子大小分離利用分子電荷性質最具專一性的吸著善用分子各種特性

8 Lysozyme Backbone Hydrophobic Hydrophilic Total substrate Watson et al. (1987) Mol Biol Gene, Plate 3

9 環境影響分子的帶電性質 Isoelectric point, pi Buffer ph Net Charge of a Protein

10 等電點與環境 ph 的關係 環 ph = 6 境 pi = 5 等電點 凝 聚 環 境 ph = 4

11 提高鹽濃度會增加蛋白質的溶解度 溶解度 pi [NaCl] M 0.02 M 0.01 M ph > M ph = ph NaCl concentration (M) Salting in

12 鹽溶 Saltingin 溶解度 NaCl KCl Ionic strength = = NaCl 分子在其等電點時, 容易互相吸引, 聚合成沈澱 ; 加入鹽離子會破壞這些吸引力, 使分子散開, 溶入水中

13 鹽對蛋白質溶解度的影響 鹽溶 Saltingin: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中 鹽析 Saltingout: 加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來

14 疏水性物質間的親和力水籠 Clathrate 水分子會包圍在非極性分子四周, 形成類似竹籠的構造, 隔離非極性分子, 水分子本身的流動性因此而降低 Alberts et al (1994) Molecular Biology of the Cell (3e) p.49

15 鹽析 Saltingout 溶解度 Ionic strength A little saltingin effect NH 4 Ammonium sulfate Sodium sulfate Aggregate SO 4 2 蛋白質分子表面的疏水性區域, 都聚集許多水分子, 當鹽類加入時, 這些水分子被抽出, 以便與鹽離子進行水合, 暴露出來的疏水性區域互相結合, 形成沈澱 = hydrophobic

16 有機溶劑沈澱法 溶解度 Membrane protein Watersoluble Watersoluble protein protein Solvent % 有機溶劑 降低水活性, 使溶液的介電常數下降, 增加蛋白質溶質分子之間的作用力, 因而聚集在一起 = hydrophilic

17 色析法的演進過程 Martin, Synge (1952) 圓形濾紙 Paper partition chromatography (PPC) 管柱層析 長條濾紙 加展開液 薄層層析 (TLC) 容量變大 容量更大 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.9

18 色層分析法的基本機制 Like Dissolves Like 極性相似的兩分子間, 其親和力較強 極性 極性 非極性 非極性

19 色層分析法的基本原理 A B C 非極性 非極性 Mobile phase 流動相 兩相系統 極性 Stationary phase 固定相 極性 樣本分子依其分子極性選擇親和兩相之一 每次分離樣本都要做一次選擇 One Plate of Separation ( 理論板數 ) L 樣本 ADSORPTION Liquid Solid S 樣本 L L PARTITION Liquid Liquid

20 膠体過濾法是一種 Partition 層析法 Stokes radius 分子大小 形狀 固定相 小分子 樣本 流動相 大分子 小分子被延滯 較快流出

21 各種色析膠體 Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glucose (dextrose) agarose glucose acrylamide cellulose FPLC Superose, Superdex Mono Q, Mono S BioRad BioGel P BioGel A acrylamide agarose

22 膠体過濾法的膠球

23 膠柱的裝填方法緩衝液平衡溫度平衡靜置膠體清洗膠體預估體積裝填膠體暫停流洗 X 繼續流洗加上 reservoir 已堆積沈積中上清加壓流洗加上 adaptor 緊密堆積檢查好管柱是否暢通 1 2 Gel Gel

24 質子可以吸著或脫離一基團 Proton: 最小且最多的生物粒子, 影響酸鹼度及分子帶電性質 胺基 lone pair electrons N H H H H N H H 羧基 C O O H C O O H

25 選擇離子交換介質 陽離子交換 Buffer ph pi 陰離子交換 0 Net Charge of a Protein

26 陰離子交換法 Anion Exchange 樣本分子 固定相 擔体 陽離子基團 Counter ion 陰離子 流動相

27 各種離子交換介質 陰陽強弱分類 Resin / Polystyrene Glycan / Cellulose = X Mono bead Anion Exchanger Strong Weak Dowex1 Dowex2 Dowex3 IR45 NR 3 NHR 2 TEAEX (QAEX) NR 3 DEAEX OCH 2 CH 2 NHR 2 Q Cation Exchanger Strong Weak Dowex50 IRC150 SO 3 COO PhosphoX CMX 2 PO4 OCH COO 2 S X = Sephadex, Sepharose, Sephacel or cellulose

28 離子取代優先順序 Pecking Order 電荷高者 離子大者 濃度大者

29 連續與階段梯度比較 蛋白質濃度 連續梯度 階段梯度 Elution volume Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography Principles and Methods

30 離子交換法實例 : Cellulase M NaCl Mono Q HR 5/5 1 ml/min 20 mm Tris, ph 7.6 Crude cellulase 2.5 mg Q 0.5 M NaCl S Mono S HR 5/5 1 ml/min 20 mm Acetate, ph Retention time (min) Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography Principles and Methods p

31 親和層析法的作用機理 A X (1) (2) (3) Sample B A Washing A Elution B 固相擔體 親和基團配體 X B

32 專一性結合力量的構成因素 I. Conformational Match: Van der waals interaction 兩分子間因構形互補所造成的吸引力是由凡得瓦爾力所貢獻 II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction Kd =O HN

33 金屬螯合層析法 imidazole 固相擔体 CCOOH OCCCOCCCN CCOOH OH OH Ni elution His His His Protein Metal Chelate Affinity Chromatography

34 分子淨電荷不同純化流程基本骨幹 組合純化步驟 硫酸銨分劃 離子交換法 膠體過濾法 分子表面極性不同 分子量大小不同

35 蔗糖合成酵素之純化表 抽取 100 g 水稻乳熟期穀粒 純化步驟全蛋白質全部活性比活性純化倍數回收率 (mg) (U) (U/mg) (fold) (%) 粗抽取液 1,070 9, 魚精蛋白沈澱後上清硫酸銨分劃 (3555%) Sepharose CL6B 膠體過濾 ,555 6,610 5, DEAE Sepharose 離子交換 8.6 2,

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