Microsoft PowerPoint - PhosPRO [相容模式]

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攀袁
5 years ago
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1 Phosphoprotein Purification PhosPRO phosphoprotein enrichment kit PhosPRO phosphoprotein purification kit

2 是否有遇到以下問題?(I) 磷酸化蛋白質純化 Q1 想進行磷酸化蛋白質體研究, 卻無工具可用 Q2 已使用了市售其他品牌, 但純化效果不佳, 磷酸化蛋白質與非磷酸化蛋白質均被純化下來 Q3 進行訊息傳導研究, 常作磷酸化蛋白質的 Western blot, 想要增加其磷酸化蛋白質比例

3 是否有遇到以下問題?(II) 磷酸化蛋白質純化 Q4 認為市售其他磷酸化蛋白純化套組, 缺乏彈性, 無法適用所有樣品 Q5 認為現有其他產品太貴

4 Q1 想進行磷酸化蛋白質體研究, 卻無工具可用 (I) PhosPRO phosphoprotein purification kit 是市面上唯一專門為 Phosphoproteomics 設計的 Kit, 可以使用在二維電泳或 MASS 分析上適用於綜觀磷酸化蛋白質表現量變化 PhosPRO phosphoprotein enrichment kit 是為一般磷酸化蛋白質純化設計的 Kit, 適合 western blot 研究特定磷酸化蛋白質表現量變化

BSA OVA Phosphoprotein M F E 磷酸化蛋白質確實僅在在 Elution 中 CA CA TI

5 Q1 想進行磷酸化蛋白質體研究, 卻無工具可用 (II) 應用實例 Phosphoprotein purification for mouse myeloma cell SP2/0 GP BSA OVA Total protein M F E GP BSA OVA Phosphoprotein M F E 磷酸化蛋白質確實僅在在 Elution 中 CA CA TI LAC TI LAC Flow through 中含有不少蛋白質, 都不是磷酸化蛋白質 PhosPRO 能將所有磷酸化蛋白質純化出來

6 Q1 想進行磷酸化蛋白質體研究, 卻無工具可用 (III) Total Protein 二維膠體比對圖單點放大比對圖質譜儀鑑定表 Phosophoprotein PhosPRO phosphoprotein purification kit 是唯一專門為蛋白質體學研究所開發的試劑組

7 Q2 已使用了市售其他品牌, 但純化效果不佳, 磷酸化蛋白質與非磷酸化蛋白質均被純化下來 Purification Enrichment Qiagen 純度最高很多其他蛋白質只有 phophoprotein Phophoprotein 及少量其他 protein Phophoprotein 及大量其他 protein PhosPRO 系列產品有最佳的純度

8 Q3 進行訊息傳導研究, 常作磷酸化蛋白質的 western blot, 想要增加其磷酸化蛋白質比例 Total Protein Stain Phosphoprotein Stain PhosPRO phosphoprotein enrichment kit 可以有效分離磷酸化蛋白質, 適合使用於磷酸化蛋白質之 western blot 研究

9 Q4 認為市售其他磷酸化蛋白純化套組, 缺乏彈性, 無法適用所有樣品 Kit 內附 stringent wash buffer 可以依照需求找出最佳化條件 PhosPRO 是唯一能調整 wash condition 的純化試劑組

10 Q5 認為現有其他產品太貴

11 純化原 Washing fraction Washing Elution 理 Eluant

12 純化效果比較實驗圖表 A. PhosPRO B. Q 牌 C. Al (OH) 3 N B U B N W B 2M NaCl N W W2 B GP BSA OVA CA TI LAC VisPROPro-Q VisPRO VisPRO Figure 1. The purification efficacy from (A) PhosPRO Phosphoprotein Purification kit, (B) Brand Q and (C) colloidal Al(OH)3. Protein standard markers containing glycogen phosphorylase b (GP), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OVA), carbonic anhydrase (CA), trypsin inhibitor (TI) and lactalbumin (LAC) were used for evaluation. Ovalbumin is the only phosphoprotein in the testing material. N: flow through; B: eluant; W and W2: washing fraction; 2M NaCl: additional washing step not suggested by manufacturer of Brand Q. VisPRO 5 minutes Protein Stain Kit (VisPRO) and Pro-Q Diamond stain (Pro-Q, from Invitrogen) were used for developing total proteins or phosphoproteins.

13 純化效果比較 -- 實驗圖表說明純化試劑 A. PhosPRO B. Q 牌 C. Al (OH) 3 N B U B N W B 2M NaCl N W W2 B 測試樣本中唯一的磷酸化蛋白質 ovalbumin GP BSA OVA CA TI LAC VisPROPro-Q VisPRO VisPRO 染色法 : Pro-Q 只染磷酸化蛋白質 VisPRO 染所有蛋白質

14 純化效果比較 -- 實驗結果 ( 一 ) A. PhosPRO B. Q 牌 C. Al (OH) 3 N B U B N W B 2M NaCl N W W2 B GP BSA OVA B lane (eluant) CA TI LAC PhosPRO 大量 OVA 被純化出來 Q 牌 - 除了 OVA, 還有許多其他 Bands, 夾雜非磷酸化蛋白質氫氧化鋁 - 少量 OVA 被純化, 夾雜其他非磷酸化蛋白質 VisPRO Pro-Q VisPRO VisPRO 實驗證明 :PhosPRO 的 eluant 純化出最多量的 Phosphoprotein, 同時不夾雜 non-phosphoprotein; 純度最高, 專一性高, 純化效果最好

15 純化效果比較 -- 實驗結果 ( 二 ) A. PhosPRO B. Qiagen C. Al (OH) 3 GP BSA OVA N B U B N W B 2M NaCl N W W2 B U W W2 lane (washing fraction) PhosPRO- 幾乎沒有 OVA CA TI Q 牌 - 除了非磷酸化蛋白質, 許多 OVA 也被洗掉了氫氧化鋁 - 除了非磷酸化蛋白質少量 OVA 被洗掉 LAC VisPRO Pro-Q VisPRO VisPRO 實驗證明 : 使用 PhosPRO,Phosphoprotein 能真正吸附, 不會被洗掉, 該被純化的 phophoprotein 不會被遺留洗掉

16 PhosPRO phosphoprotein purification kit (PP401, PE401) 應用實例 Phosphoprotein enrichment for mouse myeloma cell SP2/0 GP BSA OVA CA TI LAC M N B GP BSA OVA CA TI LAC M N B Experimental conditions: 1. 1mg protein extract dissolved in 2mL system buffer were prepared according to the instruction A The above sample was purified by one Perpacked column (PP401-C-6) according to the instruction B.1-B The stringent washing buffer had been evaluated as S2. 4. The result was evaluated by 12.5% SDS-PAGE. 20 ul of samples was loaded. 5. Total protein stain: VisPro 5 minutes protein stain (Visual protein). 6. Phosphoprotein stain: Pro-Q Diamond (Invitrogen) VisPro Total protein stain Pro-Q Phosphoprotein stain N: the unbound flow-through from N1-N4 were mixed as N. B: The eluted fractions B1-B4 were mixed as B. M: Low molecular weight marker (GE Healthcare)

17 PhosPRO 主要特性純化效果勝過 Q 牌純化效果更好, 純度更高實驗結果證實 :PhosPRO 的專一性高, 取得的 eluant 中幾乎都是磷酸化蛋白質使用 Q 牌 Kit 或者使用氫氧化鋁, 則混雜有許多的非磷酸化蛋白質效率勝過免疫沈澱法一次分離出三種 phosphoamino acid 的蛋白質免疫沈澱法使用偵測 phosphoserine, phosphothreonine, phosphotyrosine 的抗體, 但 phosphothreonine 及 phosphoserine 的抗體昂貴且純化效果不好, 運用 IMAC 原理的 PhosPRO 則可一次處理純化含有三種磷酸化胺基酸的蛋白質市場上唯一可彈性調配試劑, 更能符合不同實驗樣本需求使用者可用內附的 stringent buffer stock, 調配出最適合自身實驗的 washing buffer, 過濾掉非磷酸化蛋白質, 取得純度更高的 phosphoprotein

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告

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