Traditional immunological reaction

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俨葛
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1 蛋白質體學 Proteomics 2011 Protein Purification (I) 陳威戎

2 蛋白質純化階段及分析方法 A (1) Crude Protein (1% pure) (2) Partially Purified (50~90% pure) (3) Homogeneous (>99%) Purification Material Extraction Protein fractionation Ammonium sulfate Organic solvent Chromatography Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography FPLC Electrophoresis Preparative electrophoresis Isoelectric focusing Pure Enzyme Crystal B Analysis Background knowledge about Material Protein / Activity assay Electrophoresis Naive-PAGE SDS-PAGE Gradient PAGE Antibody production Monoclonal or conventional Kinetic study Molecular weight Sedimentation coefficient determination Quaternary structure Isoelectric focusing Peptide mapping X-Ray crystallography Amino acid analysis Protein sequencing Extinction coefficient Spectrometric methods CD, ORD, NMR & ESR Immunoassays Immunoblotting ELISA Double diffusion Immunoelectrophoresis (1) 粗蛋白 Crude protein (2) 部分純化 Partially purified (3) 均質酵素 Homogeneous Juang RH (2005) EPA

3 蛋白質純化方法鹽溶鹽析膠體過濾法離子交換法親和層析法純化策略最經濟方便的純化依照分子大小分離利用分子電荷性質最具專一性的吸著善用分子各種特性

4 蛋白質表面的極性或非極性分布 Hydrophobic area Activie site A typical protein Superxoide dismutase (SOD) Protein surface has both polar and non-polar patches. Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig

5 環境影響分子的帶電性質 Isoelectric point, pi Buffer ph Net Charge of a Protein - Environmental ph effects the charge properties of a protein Juang RH (2005) EPA

6 提高鹽濃度增加蛋白質溶解度 Solubility pi [NaCl] M 0.02 M 0.01 M ph > M ph = ph NaCl concentration (M) Salting in Higher salt concentration increases the solubility of a protein Juang RH (2005) EPA

7 鹽影響蛋白質溶解度 Salt effects protein solubility 鹽溶 Salting-in: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中鹽析 Salting-out: 加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來 Juang RH (2005) EPA

8 鹽溶 Salting-in effect Solubility NaCl Ionic strength = - NaCl KCl - = 分子在其等電點時, 容易互相吸引, 聚合成沈澱 ; 加入鹽離子會破壞這些吸引力, 使分子散開, 溶入水中 Juang RH (2005) EPA

9 鹽析 Salting-out Solubility A little salting-in effect NH 4 Ammonium sulfate 2- SO 4 Sodium sulfate Ionic strength Aggregate 蛋白質分子表面的疏水性區域, 都聚集許多水分子, 當鹽類加入時, 這些水分子被抽出, 以便與鹽離子進行水合, 暴露出來的疏水性區域互相結合, 形成沈澱 = hydrophobic Juang RH (2005) EPA

10 硫酸銨 (ammonium sulfate) 的特性 (1) 硫酸銨是一種中性鹽, 對蛋白質有相當好的安定作用因其離子容積大, 吸走水分子的能力也大, 為有效的鹽析工具 (2) 硫酸銨的添加以百分飽和度來表示 ( 不是濃度百分比 ), 大部分蛋白質可在 80% 硫酸銨飽和度下沉澱 (3) 飽和度隨溫度變化稍有差異,25 下的飽和濃度為 4.1 M, 即每公升加入 767 克固体硫酸銨 ;0-100% 之間各飽和度的添加量要查表, 而不是以 767 克直接乘以其百分比值 (%) (4) 各種蛋白質, 因其表面的非極性區域分佈不同, 各在其特定的硫酸銨飽和濃度下沉澱, 一般可做為初步的純化

11 硫酸銨百分飽和濃度表硫酸銨起始百分飽和濃度 0 最終硫酸銨百分飽和濃度加入 1 L 溶液中之固態硫酸銨克數本表數據來自 Methods in Enzymology (1990) Vol. 182, p. 291, 而該表原始資料又來自 Data for Biochemical Research (1969) Dawson, R.M.C. et al. (ed), 2nd edition, Oxford Univ. Press.

12 硫酸銨 (ammonium sulfate) 的使用法 (1) 硫酸銨容易吸收空氣中的水分而結塊, 使用前最好先把硫酸銨磨碎, 平鋪在烤箱 ( 約 60 ) 內烘過, 切勿過熱 (2) 添加硫酸銨時, 要在冰浴中進行, 不可一次把硫酸銨倒入, 而以小量分多次慢慢溶入, 並不時攪拌, 以免造成局部濃度過高硫酸銨全加完後, 再攪拌約 min, 使溶解完全平衡, 然後進行離心, 注意所要的是沉澱或上清, 要弄清楚! (3) 最後所得的沉澱溶解在最少量的緩衝液中, 或者以沉澱形式保存, 均相當安定 ; 但要記得其中所含的硫酸銨, 是否對下一步檢定或純化有影響, 可以透析法除去之

13 有機溶劑沈澱法 Precipitation by organic solvent Solubility Membrane protein Water-soluble Water-soluble protein protein Solvent % 有機溶劑 Organic solvent 降低水活性, 使溶液的介電常數下降, 增加蛋白質溶質分子之間的作用力, 因而聚集在一起 = hydrophilic Juang RH (2005) EPA

14 Remarks Mechanism Factors Juang RH (2005) EPA 各種鹽析沉澱法比較 Comparison of methods Salting-in 鹽溶 Salting-out 鹽析 Organic solvent Ionic interactions on protein surface Non-polar area of protein surface All interaction forces on protein surface except hydrophobic Reagents NaCl (monovalent) (NH 4 ) 2 SO 4 (divalent) Methanol, acetone Protein has no net charge at its pi, that leads to the binding between proteins via ionic interactions, and precipitation. Salt can interfere these ionic interactions and separate bound protein molecules. Big divalent ions attract water molecules immobilized on the protein surface, expose the nonpolar surface, which then interacts with other proteins to form precipitate. Organic solvent decreases the water activity and the dielectric constant of the solution, which then decreases the solubility of the protein and precipitates it. Fig Fig 2.3 Fig 2.4 Fig 2.5 The reverse process of salting-in is not saltingout, it is the dialysis process against a dilute solution. 1) Non-polar proteins will be precipitated earlier. 2) Protein is very stable in ammonium sulfate. 1) Some proteins might be denatured by heat produced. 2) Factors facilitate precipitation: larger protein, ph close to protein pi. 3) Lipophilic protein might be dissolved more readily.

15 其他處理法 (1) Polyethylene glycol (PEG): 是一種水溶性的高分子聚合物, 分子量 4,000 以上的 PEG 可以用來沉澱蛋白質, 其作用原理類似有機溶液, 但使用濃度較低 (2) 去除核酸及多醣 : 樣本溶液中若有大量核酸, 可以加 protamine sulfate ( 魚精蛋白 ) 與之產生沉澱, 再以離心去除之碳水化合物則較難完全去掉, 通常期望在蛋白質沉澱時, 或往後的層析法能去除二者都可以用對應的水解酵素分解, 但價錢昂貴 (3) 特殊處理 : 有些較特別的酵素, 具有特殊性質, 可利用在純化上例如 RNase 對熱非常安定, 欲純化時可將粗酵素液加熱煮沸, 除去其它蛋白質對強酸強鹼或有機溶劑的特殊安定性, 亦可利用之不過使用這些嚴苛的處理方法時, 要特別小心控制好其正確條件

16 3 色層分析法 Chromatography 3.1 色層分析原理 Basic principles 極性不同的分子在兩相中有不同分佈比例 3.2 膠體過濾法 Gel filtration 依樣本分子量的不同來做分離純化 3.3 離子交換法 Ion exchange 利用樣本分子的表面帶電性質不同來進行分離 3.4 親和性層析法 Affinity chromatography 利用分子間的親和性大小不同來進行分離 3.5 疏水性層析法 Hydrophobic interaction chromatography 利用樣本分子的表面疏水性性質不同來進行分離 Juang RH (2005) EPA

17 色層分析法的演進過程 : Martin, Synge (1952) 圓形濾紙 Paper partition chromatography (PPC) 管柱層析長條濾紙加展開液薄層層析 (TLC) 容量變大容量更大 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.9

18 色層分析法的基本機制 : Like Dissolves Like 極性相似的兩分子間, 其親和力較強極性極性非極性非極性

19 色層分析法的基本原理 : A B C 兩相系統非極性非極性 Mobile phase 流動相極性 Stationary phase 固定相極性樣本分子依其分子極性選擇親和兩相之一每次分離樣本都要做一次選擇 One Plate of Separation ( 理論板數 ) L 樣本 ADSORPTION Liquid - Solid S 樣本 L L PARTITION Liquid - Liquid

20 常用層析法 Common chromatographic methods Partition Adsorption Large molecules Small molecules Gel filtration Reverse phase chromatography Ion exchange Affinity chromatography Hydrophobic interaction Hydroxyapatite PPC, TLC, GC TLC, GC Juang RH (2005) EPA

21 薄層層析法操作 Thin-layer chromatography Thin-layer plate Activated Not-activated Sample spotting Add developer Developing Juang RH (2005) EPA

22 3.2 膠体過濾法 Gel filtration 原理概述 Basic principles 是一種 partition 層析法膠体介質 Gel materials 是一種長鏈的大分子聚合物膠体管柱 Gel and column 管柱性質影響因素及管柱系統管柱操作 Column operation 裝填並操作一支膠体過濾管柱問題及解決 Problem and solution 常見的錯誤要先避免之 Juang RH (2005) EPA

23 膠體過濾法是一種 Partition 層析法 : Stokes radius 分子大小形狀固定相小分子樣本流動相大分子小分子被延滯較快流出

24 各種色析膠體 : Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel FPLC glucose (dextrose) agarose glucose acrylamide cellulose Superose, Superdex Mono Q, Mono S Bio-Rad BioGel P BioGel A acrylamide agarose

25 Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods p.35 膠體的構成 Space for filtration glucose unit Sephadex Sephadex is the polymer of glucose with chemical cross-linking

26 膠體的使用範圍 Sephadex G MW ranged from ten to several hundred thousands G-200 could be smashed flat easily (its backbone support is too weak) 1 g 7.5 ml From powder to gel form 1 g 20 ml gel Small proteins Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods p.37

27 Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods p.22 膠體的構成 Bigger space Stronger support for backbone Acrylamide Cross-linking Sephacryl

28 洋菜膠體的成膠反應 Agar gel formation Even stronger backbone Much bigger space Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods p.38, 39

29 膠體的使用範圍 Sepharose MW ranged from ten thousands to several millions Sepharose is rigid Cross-linking 6% gel 2% gel Sephadex Sephacry Large proteins Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods p.40

30 膠體過濾法的膠球 :

31 管柱內膠體的組成區隔 Spaces in a column V t V o V t - V o 管柱總體積膠體外體積膠體內體積 Mobile phase Stationary phase Adapted from Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods p.11

32 膠体過濾的溶離圖譜 A typical chromatogram A 目標酵素 (E) 最好不要落在主要蛋白質峰 (Y) 的範圍內 V o 之前不應有物質溶離出來 X E Y Enzyme activity V t 之後不應有物質溶離出來 Z NaCl V o V e 0 Elution Volume (ml) V t Juang RH (2005) EPA

33 Relative amount Adapted from Pharmacia: Gil Filtration Principles and Methods 介質的粗細影響解析力 Coarse Fine Superfine Poor separation Peak flattened Best separation Ve/Vt Bead size is critical to the resolution of gel chromatography

34 溶離液擴散進出膠球 Diffuse in and out bead 溶離液或樣本分子, 由膠體粒子外圍均勻向內或外擴散 Sample or buffer is diffusing in and then out of the gel particle. Diffusion Dispersion Juang RH (2005) EPA

35 溶離液對膠球的擴散或瀰散 Two types of gel 若膠體粒子太大, 則由外圍擴散到內部的距離長, 通過粒子所需要的時間拉長, 降低分離效果 Small particle size reduces the diffusion time and increases the resolution of the gel Dispersion ( 瀰散 ) 方式的膠體因通透性佳, 溶離液可直接流入膠體, 不再靠擴散作用 Dispersion type gels let the sample molecules flow directly through the gel body, and have better resolution Juang RH (2005) EPA

36 粒子粗細影響溶離液流動 Bead size vs flow rate 膠體的顆粒越小其解析力越大但流速變慢 Smaller particles also reduce the space between the beads, and prevent the turbulence as the buffer flows, but the flow rate might be decreased Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.192

37 Absorbance Adapted from Pharmacia: Gil Filtration Principles and Methods 不同介質的運用選擇 Sephacryl S-300 Sephacryl S-200 高分子量處分離較好色帶都較晚溶離出來低分子量處分離較好色帶都較快 0 溶離出來 Elution volume Choose the gel which brings your target protein out of the column earlier

38 色析管柱的形狀 10 cm 30 cm cm 3 矮胖型 Short and fat 細長型 Long and slim 10 cm 2 30 cm 矮胖型管柱不能容忍分離不佳 Fat column cannot tolerate poor separation 但其流速及容量均較大 But it has better flow rate and higher capacity Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification Principles and Practice p.195

39 液相層析管柱系統 A 梯度製造器 Gradient mixer (1) 緩衝液 Buffer 轉接器 Connector reservoir 管柱 Column 膠體 Gel (2) 幫浦 Pump adapter (3) (4) 監視器 Monitor (5) 記錄器 Recorder 分劃收集器 Fraction collector 膠體裝填 The whole family of liquid chromatography apparatus Juang RH (2005) EPA

40 膠柱裝填方法 Packing column step by step 清洗膠體 Wash gel well 預估體積 Estimate gel volume Gel 靜置膠體 Gel stands o/n Put on reservoir 檢查管柱是否暢通 Check flow rate of empty column 裝填膠體 Pouring gel smoothly 上清 Supernatant 沈積中 In progressing 已堆積 Sediment Put on adaptor 緊密堆積緩衝液平衡 Equilibrated in buffer 溫度平衡 Temperature equilibrated 1 2 Gel 暫停流洗 Stop elution X 繼續流洗 Keep eluting 加壓流洗 Elute under High pressure Juang RH (2005) EPA Gel should be packed tightly

41 Pharmacia (1991) Gil Filtration Principles and Methods 色析膠體的裝填 Packing column 一口氣倒入膠體, 勿陷入氣泡 Pour gel slurry smoothly (non-stop), avoid trapping any bubble

42 膠體過濾法注意事項 : (I) 膠體處理與選擇 : (1) 許多膠体是乾燥粉末, 使用前要先行膨潤, 如 Sephadex, Bio-Gel P; 其餘如 Sephacryl, Sepharose (CL), Bio-Gel A 均為已膨潤者, 直接在玻璃漏斗以緩衝液洗過即可裝填 ; 若有需要, 可以減壓幫浦抽去氣泡注意 Sepharose 及 Bio-Gel A 不可加熱或高壓滅菌 (2) 取決於所要分離蛋白質樣本分子量的大小, 並且預期溶離出來的蛋白質峰, 可出現在 Vo-Vt 區間的前半段通常分子量大於十萬可用 Sepharose CL 系列, 小於五萬者用 Sephadex G-100 以下, 其間則使用 Sephacryl S-200 或 300 避免使用 Sephadex G-150 或 200, 因其流率不佳 ; 其它廠牌相對應的產品, 亦可使用之

43 膠體過濾法注意事項 : (II) 樣品處理 : 体積限定在膠柱体積的 1-3% 有 adaptor 的管柱較方便, 可用幫浦注入, 否則要直接把樣品加在膠体表面上吸去上方緩衝液後, 小心注入 ( 乾式 ); 或不吸去緩衝液, 把密度較大的樣本, 在緩衝液中直接加入, 讓它自動沉降在膠体表面 ( 溼式 ) 樣品溶液不可有沉澱, 否則要先離心除去之, 太濃或太稀均不適宜注入樣品應極為小心, 勿破壞膠体表面!

44 膠體過濾法注意事項 : (III) 管柱大小 : 視所要分離樣本的体積而定, 一支膠体体積為 100 ml 的管柱, 可分離 1-3 ml 樣本膠体過濾管柱以細長較妥, 通常直徑為 1.6 或 2.6 cm, 長度 cm, 太長者擴散作用明顯 (IV) 溶離速度 : 以直徑 1.6 或 2.6 cm 管柱而言, 通常每小時流速約 30 ml 左右, 較粗的管柱可加快,Sephadex G-150 或 G-200 要減慢, 而 Sephacryl 溶離速度可加快一倍收集約定在每 2-5 ml 一分劃, 但可依情況自行增減, 最好使用分劃收集器, 讀滴數秒速均可 ; 要注意勿讓膠体乾掉, 也要小心收集器很容易出毛病

45 膠體過濾法注意事項 : (V) 管柱保存 : (1) 膠体暫不使用時, 可在緩衝液中加 NaN3 (0.01%) 流洗一次, 關好出口 (2) 長期不用時最好取出膠体, 在玻璃漏斗中以 PBS 洗過數個体積後, 保存在 4 中, 再加數滴 NaN3 防菌 (3) 若發覺膠体太髒, 可用 0.2 M NaOH 或 NaCl 先洗過, 再以緩衝液平衡 ; 再度取出使用時, 要注意有沒有長霉 ( 黑色棉絮狀小球 ), 膠体有無結塊 (4) 已膨潤的膠体應貯於 4, 但切勿貯藏在零下的溫度, 膠体結構會破壞掉 ; 乾粉或未尚未開封者, 可貯於室溫 (5) 膠体外表看來都一樣, 一定要標示好, 以免混淆不清 ; 千萬不要把兩種膠体混在一起, 結果會很淒慘!

46 General principle for column chromatography Gel selection Bead size Column size Make target protein elute out column earlier Finer bead has better resolution, slower flow rate Use larger column size but consider practical need Column shape Slim column for gel filtration, fat column for others Pack tightly Flow rate Pack the gel tightly for better resolution Fast flow reduces resolution, slow Sample volume Apply 1% of total gel volume for sample Juang RH (2005) EPA

47 膠體過濾法常見之問題與解決方法 : (I) 管柱裝填 : 膠柱是否良好, 可跑 Blue Dextran (Pharmacia) 試之, 藍色色帶應平穩地往下移動, 色帶厚度會稍加寬, 但不該有拖尾變斜, 甚或成為不規則亂流! 也可用手電筒在管柱後方打光, 看膠体中有無氣泡 (II) 溶離緩衝液 : 流速太快會造成分離結果不好, 通常是色帶拉長或呈現不規則緩衝液中的離子濃度有相當影響, 通常不能使用蒸餾水來溶離樣本分子在通入膠体後不久, 其緩衝液即被管柱中的緩衝液所取代 ; 若此二種緩衝液不同, 則因離子濃度的改變, 某些蛋白質可能會鹽析出來, 沉澱在膠面

48 膠體過濾法常見之問題與解決方法 : (III) 活性消失 : 有些樣本蛋白質, 需要金屬離子輔酶輔因子等小分子, 共同達成其活性, 在通過管柱後, 可能被排除而失去活性可在活性分析時補充, 或可在溶離緩衝液中添加若回收量太低, 注意膠体有無吸附現象 (IV) 使用溫度 : 膠体管柱由冷房移到室溫後, 會漸生成小氣泡, 不能再用由高溫處移至低溫處時, 則無此問題緩衝液也有同樣現象, 應當注意 (V) 老舊膠柱 : 管柱經長期未使用, 要注意有無長霉, 管柱有無乾裂 ( 用手電筒檢查 ) 使用太多次數後, 膠柱最上方的表面會有沉澱或變得較髒, 可稍挖去表層, 再小心輕輕攪拌, 使膠体表面重新沉降平整, 對結果影響不大

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Microsoft PowerPoint Pur3a.PPT 3 色層分析法 Chromatography 3.1 色層分析原理 Basic principles 極性不同的分子在兩相中有不同分佈比例 3.2 膠体過濾法 Gel filtration 依樣本分子量的不同來做分離純化 3.3 離子交換法 Ion exchange 利用樣本分子的表面帶電性質不同來進行分離 3.4 親和層析法 Affinity chromatography 利用分子間的親和性大小不同來進行分離