離子交換 (Ion exchange)

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唐影莫
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1 Liquid Chromatography 液相層析課程伯森生物科技 ( 股 ) 公司產品專員張家銘 2011/2/23 1

2 液相層析一連串利用分子性質差異與膠體作用的過程 2

3 液相層析 (Liquid Chromatography) 固定相 : 膠體 (gel, media, beads, resin ) 流動相 : 緩衝液 (buffer, salts solution, solvents ) Agarose Buffer 緩衝液 : 鹽類水溶液 Tris, Phosphate, acetate..

4 AKTA series 4

5 液相層析 (Liquid Chromatography) 5

6 排氣過濾離心沉澱 Buffer 與樣本排氣過濾 6

7 Buffer 置換時機 : 準備進入特定管柱前或是管柱之間原理 : 膠體過濾 (Gel filtration) 或超過濾 (Ultrafiltration) 考慮除鹽樣品體積與目標分子大小 7

8 Buffer 置換 vs 選擇方法 Gel filtration Ultrafiltration 根據除鹽樣本體積選擇適合的管柱 ul ml ml ml Dialysis 8

9 濃縮樣本時機 : 減少膠體成本與小體積操作方便原理 : 分子篩 (Molecular sieving) MWCO (Molecular Weight Cut-Off), 以 kd 表示濾膜留下大分子, 小分子流出, 達到濃縮大分子的目的 9

10 濃縮離心管樣本體積 (100 ul-20 ml) 濃縮離心管 MWCO (3-100 kd) = 目標物分子量的一半以下 MWCO (kd) ul ml 2-6 ml 5-20 ml

11 管柱與膠體 11

12 純化原理膠體上 Ligand 與樣本交互作用的有無 Non-adsorptive Adsorptive GF HIC IEX AF RPC 12

13 純化模式分配型 (Partition) 吸附型 (Adsorption) 13

14 膠體過濾 (Gel Filtration) 由於交換頻率不同, 大分子先出 Column 14

15 Gel filtration 實驗結果 elution 15

16 影響 GF 效果的因素 Gel Media 膠體分離範圍膠體粒徑樣本體積流速 Gel Filtration Beads 管柱長度 16

17 膠體分離範圍 75kDa S kDa S kDa S

18 膠體粒徑 18

19 樣本體積 (1CV 約 20 ml) 約 0.1% CV 約 1% CV 約 2% CV 19

20 流速越慢, 解析度越好 20

21 管柱長度越長, 解析度越好 30 cm 60 cm 21

22 GF 膠體選擇 Fractionation range (kd) 與目標分子大小 Particle size (μm) 與純化階段 Sample volume (0.5-5% 膠體體積 ) 22

23 離子交換 (Ion Exchange) Charged group -Asp, Glu, Lys, Arg,His 溶液 ph 越高, 分子帶負電情形越強我們可以用相反電性作吸附 23

24 離子交換純化流程在某一溶液 ph 下, 不同分子帶電性與帶電程度不同低鹽環境下負電分子吸附 ligand 非負電分子流出 column 提高鹽濃度造成帶電性弱的分子先出 column 24

25 IEX 實驗結果 25

26 影響 IEX 效果的因素適當的溶液 ph Elution buffer 的 salt gradient 膠體上 Ligand 的種類 26

27 適當的溶液 ph 27

28 Elution buffer 的 salt gradient 28

29 膠體上 Ligand 的種類 A B C D 根據不同樣本, 快速找出最適合的管柱 29

30 疏水性作用 (Hydrophobic Interaction) 原理溶液中, 水分子在疏水區塊上有秩序排列溶液鹽濃度拉高, 疏水性區塊靠近並吸附溶液鹽濃度越高, 疏水性作用越強烈 30

31 HIC 實驗結果 31

32 影響 HIC 效果的因素溫度鹽的種類鹽的濃度膠體上 Ligand 的種類 32

33 溫度 33

34 鹽的種類促進疏水性作用的能力 34

35 鹽類濃度 35

36 膠體上 Ligand 的種類 A B C D 告訴你哪一種膠體最適合目前樣本 36

37 親和性純化 (Affinity Purification) 利用已知的分子交互作用, 專一性抓取目標蛋白比如說 : 酵素與受質, 抗體與抗原 Elution 方式 1. 改變鹽類濃度或 ph 值 2. 加入變性劑 (Chaotropic agents) 3. 加入競爭劑 (Competing agents) 37

38 AF 實驗結果 80-95% 純度的目標物 38

39 分子間交互作用樣本類型重組蛋白 (Recombinant proteins) His-tag, GST-tag, MBP-tag, Strep(II)-tag 抗體 (Antibodies) 磷酸化蛋白與胜肽 (Phosphorylated proteins and peptides) 醣蛋白 (Glycoproteins) 蛋白質酶 (Proteases) 其他 39

40 His-tag Protein Purification IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) Ni2+ 最常用於純化 His-tag protein Co2+ His-tag proteins 純化的另一種選擇當我們需要結合目標蛋白能力較低的 ligand 時 Cu2+ & Zn2+ 主要用於沒有 tag 的蛋白質, 也是 His-tag proteins 純化的另一種選擇 Cu2+ 結合力強並結合蛋白範圍廣 Zn2+ 結合力較弱但選擇性更好 40

41 GST-tag Protein Purification Glutathione Glutathione 競爭型 elution Target protein Glutathione S Transferase (GST),26 kda 41

42 MBP-tag Protein Purification Maltose Maltose 競爭型 elution Maltose Binding Protein (MBP),42.5 kd 也常用來增加表現量與溶解度促進正常摺疊, 避免產生 inclusion bodies 通常需要從目標物上裁剪下來, 避免影響後續實驗常位於胺基端 42

r-protein Strep-Tactin Strep-tag II 改良自 SA-Biotin 系統,

43 Strep(II)-tag Protein Purification 可以表現在 N- 或 C-terminal 可用 desthiobiotin 作 elution, 條件溫和不易破壞目標物本身活性 host proteins r-protein Strep-Tactin Strep-tag II 改良自 SA-Biotin 系統, 保留了高專一性, 而且可用溫和條件做 elution 輕易得到高純度蛋白 biotin Streptavidin 8 個胺基酸組成, 約 1 kd 43

44 Ab purification Protein A/G 免疫沉澱 -IP Screening of elution conditions ph Salt concentration 影響 IP 結果的因素 Amount of antibodies Amount of protein (antigen) to be enriched Incubation times Choice of buffers No of washes 44

45 其它可利用的交互作用 Serine proteases 目標物 Albumin, coagulation factors, interferons and nucleotiderequiring enzymes Calmodulin-binding protein (CBP), ATPases, protein kinases, phosphodiesterases, neurotransmitters Fibronectin from plasma Antithrombin III and other coagulation factors, lipoprotein lipases, DNA-binding proteins, protein synthesis factors and steroid receptors Plasminogen, plasminogen activator, ribosomal RNA and double-stranded DNA 膠體 HiTrap Benzamidine FF (high sub) Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub) HiTrap Blue HP Blue Sepharose 6 Fast Flow Calmodulin Sepharose 4B Gelatin Sepharose 4B HiTrap Heparin HP HiPrep 16/10 Heparin FF Heparin Sepharose 6 Fast Flow Lysine Sepharose 4B 目標物 Biotinylated molecules Glycoproteins, membrane proteins, glycolipids and polysaccharides 膠體 HiTrap Streptavidin HP Streptavidin HP SpinTrap Streptavidin HP MultiTrap Streptavidin Sepharose High Performance HiTrap Con A 4B Con A Sepharose 4B Glycoproteins and membrane proteins Lentil Lectin Sepharose 4B NADP-binding proteins and NADPdependent dehydrogenases RNA polymerase, DNA polymerase, DNases, and DNA-binding proteins Eukaryotic mrna cap-binding proteins mrna, reverse transcriptases, interferon 2'5' ADP Sepharose 4B DNA-cellulose (denatured) 7-methyl-GTP Sepharose 4B Poly(U) Sepharose 4B 45

46 純化的階段與策略 46

47 純化階段與策略 CIPP (Capture Intermediate Purification Polishing) 精緻純化初步抓取中間純化 & 粒徑 47

48 純化策略安排 48

49 多種純化策略沒有最好的策略, 只有最適合目前目標物的策略 49

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50 Appreciate your attention! Any questions? 未來有任何問題很歡迎您與伯森生技討論! 網頁很榮幸為您服務 Product specialist Michael Chang 張家銘 TEL:

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