1 材料与方法 1.1 材料大肠埃希菌 DH5α 菌株 (Escherichia coli DH5α) 耐氨苄青霉素的大肠埃希菌 DH5α 菌株 (E. coli DH5α Amp r ) 表皮葡萄球菌 ATCC 菌株 (Staphyococcus epidermidis ATCC 14

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押祉璩
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1 :45 部分牙膏抑菌效果调查及牙膏抑菌剂比较刘淑萍 1, 金波 1, 李桢 1, 李培 1, 蒲锗遐 1 2*, 潘渠 (1. 成都医学院 2011 级医学影像学本科班, 成都 ;2. 成都医学院病原生物学教研室, 成都 ;) 摘要目的调查 10 种牙膏和 6 种牙膏抑菌剂的抑菌效果方法以大肠埃希菌耐氨苄青霉素大肠埃希菌表皮葡萄球菌和枯草芽胞杆菌为测试菌株, 采用纸片扩散法观察抑菌效果, 以抑菌圈的直径作为评价标准结果 9 种牙膏对大肠埃希菌无抑制作用 1 种牙膏 ( 含三氯生 ) 对 4 种菌株均有抑菌作用, 而且对 4 种菌株的抑菌圈都是最大的 6 种牙膏抑菌剂中只有三氯生和度米芬对 4 种菌株均有抑制作用, 但度米芬的抑菌圈远小于三氯生的抑菌圈结论三氯生是目前较好的牙膏抑菌剂, 应加强安全高效牙膏抑菌剂的研发关键词牙膏 ; 牙膏抑菌剂 ; 抑菌效果 ; 三氯生 Research of bacteriostasis of some toothpastes and bacteriostatic agents of toothpaste LIU Shu-ping 1, JIN Bo 1, LI Zhen 1, LI Pei 1, PU Zhe-xia 1, PAN Qu2 * (1. Medical Imageology Class of Grade 2011, ChengDu Medical College, Chengdu , China;2. Department of Pathogen Biology, ChengDu Medical College, Chengdu , China) Abstract Objective To study bacteriostasis of 10 toothpastes and 6 bacteriostatic agents of toothpaste. Methods The bacteriostasis of toothpastes and bacteriostatic agents were determined by the diameter of bacteriostatic rings using disk diffusion method, Escherichia coli, ampicillin-resistant Escherichia coli, Staphyococcus epidermidis and Bacillus subtilis as the test strains. Results 9 toothpastes can not inhibit the growth of E. coli. 1 toothpaste ( containing triclosan) can inhibit all of the 4 test strains and has the largest bacteriostatic rings. Of the 6 bacteriostatic agents, triclosan and domiphen bromide inhibit all of the 4 test strains. The diameter of bacteriostatic ring of domiphen bromide is far smaller than that of triclosan. Conclusion Triclosan is now good bacteriostatic agents. We should study new efficient and safe bacteriostatic agents for toothpastes. Key words Toothpaste; bacteriostatic agents; bacteriostasis; triclosan 牙膏是常用的口腔卫生用品, 随着人们对口腔卫生要求的提高, 牙膏从普通的清洁型牙膏转变为添加抑菌剂的功能型牙膏抑菌型牙膏可抑制口腔中细菌的滋长, 从而减少龋齿和牙周病等口腔疾病的发生 [1] 通过添加抑菌剂, 增强了牙膏抗菌防龋健齿的功效目前, 牙膏中添加的抑菌剂有三氯生度米芬苯甲酸钠等前期实验室抽查了一部分牙膏, 发现所抽查的牙膏对大肠埃希菌都没有抑制作用而大肠埃希菌是常见的革兰阴性菌, 侵入人体一些部位时, 可引起感染, 具有一定代表性我们对几种畅销的牙膏品牌和常用的牙膏抑菌剂做了进一步的抑菌效果调查, 对抑菌型牙膏的研发工作有所帮助

2 1 材料与方法 1.1 材料大肠埃希菌 DH5α 菌株 (Escherichia coli DH5α) 耐氨苄青霉素的大肠埃希菌 DH5α 菌株 (E. coli DH5α Amp r ) 表皮葡萄球菌 ATCC 菌株 (Staphyococcus epidermidis ATCC 14990) 和枯草芽胞杆菌 CICC 菌株 ( Bacillus subtilis CICC 23579) 来自成都医学院病原生物学实验室培养基为 LB 培养基,37 过夜培养单氟磷酸钠和柠檬酸锌购买自 Sigma-Aldrich; 三氯生度米芬苯甲酸钠十二烷基硫酸钠和山梨醇购买自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司牙膏样品均购自超市 1.2 牙膏的抑菌实验用 LB 平板复苏大肠埃希菌耐氨苄青霉素大肠埃希菌表皮葡萄球菌和枯草芽胞杆菌得到单菌落, 挑取单菌落, 恒温摇床过夜培养得到菌液将菌液涂布 LB 平板上, 将制好的牙膏滤纸片贴于平板中,37 恒温培养 24h 后观察抑菌圈大小 1.3 牙膏抑菌剂的抑菌浓度确定相关文献和牙膏配方显示 [2-7], 三氯生度米芬苯甲酸钠单氟磷酸钠和柠檬酸锌为常用牙膏抑菌剂将牙膏配方中常见的清洁牙齿的添加剂山梨醇和十二烷基硫酸钠做为实验对照列入实验, 共 7 种试剂三氯生的含量在牙膏中不宜超过 0.3%, 在漱口水中不宜超 0.1% [8], 三氯生对大肠埃希菌的 MIC 为 0.2 ppm, 则可将三氯生的浓度范围设为 %~ 0.3% 牙膏中所添加的月桂醇硫酸酯钠又称十二烷基硫酸钠通常用量为 1%~ 3% [9-10], 将十二烷基硫酸钠的浓度范围设置为 0.04%~3% 苯甲酸钠在牙膏中添加量在 0.2%~0.5% [11], 苯甲酸钠的 MIC 为 0.04%, 设置苯甲酸钠的浓度范围为 0.04%~0.5% 单氟磷酸钠的限制浓度为 0.15%( 以氟计 ), 且所选牙膏均明确标出单氟磷酸钠的浓度为 0.14%( 以氟计 ), 故将单氟磷酸钠浓度范围设置为 %~0.15%( 以氟计 ) 度米芬在漱口水的用量一般为 0.25%~0.45% [12], 度米芬浓度范围设置为 0.025%~0.45% 柠檬酸锌在牙膏中的一般用量为 0.2%~ 1.5%, 锌离子对血链球菌的 MBC( 最小杀菌浓度 ) 为 1.25 g/l [13] 柠檬酸锌的浓度范围设为 0.15%~1.5% 山梨醇作为湿润剂在牙膏中的使用范围是 20%~ 40% [14-15] 浓度设定范围为 10%~60% 实验操作同牙膏抑菌实验 1.4 牙膏成分的抑菌实验根据抑菌浓度确定实验的结果, 选择适宜浓度, 研究每种抑菌成分的抑菌效果实验操作同牙膏抑菌实验 2 实验结果种牙膏的抑菌效果 7 种中华牙膏中, 只有中华 ( 多效 + 亮白 ) 对大肠埃希菌有抑制作用, 抑菌圈为 26 mm, 其余 6 种中华牙膏对大肠埃希菌均无抑制作用 ( 图 1) 7 种中华牙膏的成分有三氯生柠檬酸锌十二烷基硫酸钠氟化物山梨醇野菊花提取物金银花提取物氢化蓖麻油芦荟叶汁等, 其中三氯生柠檬酸锌氟化物十二烷基硫酸钠具有抑菌作用, 仅中华 ( 多效 + 亮白 ) 含有三氯生和柠檬酸锌可推测三氯生和柠檬酸锌是较好的抑菌剂

3 图 1 10 种牙膏对 4 种细菌菌株的抑菌效果图 A B 和 C: 大肠埃希菌 DH5α 菌株 ;D: 耐氨苄青霉素的大肠埃希菌 DH5α 菌株 ;E: 表皮葡萄球菌 ATCC 菌株 ;F: 枯草芽胞杆菌 CICC 菌株 a: 中华牙膏 ( 多效 + 亮白 );b: 中华牙膏 ( 皓清 );c: 中华牙膏 ( 双钙防蛀 );d: 中华牙膏 ( 魔力迅白 );e: 中华牙膏 ( 中草药 );f: 中华牙膏 ( 芦荟 );g: 中华牙膏 ( 清芯炫蓝 );h: 无菌水 ;1: 中华牙膏 ( 多效 + 亮白 );2: 云南白药牙膏 ;3: 高露洁牙膏 (360 );4: 冷酸灵牙膏 ( 防菌抗敏 ); 5: 氨苄青霉素滤纸片直径为 7 mm 表 1 4 种牙膏对 4 种细菌的抑菌环统计表大肠埃希菌 DH5α 耐青霉素大肠埃希菌 DH5α 表皮葡萄球菌 ATCC 枯草芽胞杆菌 CICC 中华 ( 多效 + 亮白 ) 云南白药高露洁冷酸灵氨苄青霉素注 : 表中数据单位为 mm; 滤纸片直径为 7 mm, - 表示无抑菌环含三氯生的中华牙膏对大肠埃希菌耐青霉素大肠埃希菌表皮葡萄球菌枯草芽胞杆菌均有较大抑菌环 ( 图 1), 直径分别为 32 mm 28 mm 30 mm 22 mm( 表 1) 云南白药高露洁冷酸灵牙膏仅对表皮葡萄球菌及枯草芽胞杆菌有抑制作用, 对大肠埃希菌和耐氨苄青霉素大肠埃希菌均无抑制作用 ( 图 1) 2.2 牙膏抑菌剂的抑菌浓度

4 三氯生柠檬酸锌度米芬苯甲酸钠十二烷基硫酸钠单氟磷酸钠均显示出不同程度的抑菌效果, 山梨醇在任何浓度下对 4 种菌株都没有抑菌作用三氯生在浓度为 0.03% 时对 4 种菌株均有较大抑菌环, 当浓度再往下稀释时, 抑菌作用下降明显柠檬酸锌对枯草芽胞杆菌和表皮葡萄球菌的作用明显强于大肠埃希菌, 仅在浓度为 1.5% 时对大肠埃希菌有轻度抑制作用 ; 度米芬对四种菌均有抑制作用, 抑菌环小而稳定, 选择 0.45% 的度米芬较为合适 ; 苯甲酸钠仅对枯草芽胞杆菌在浓度达 0.408% 时有一较小抑菌环 ; 十二烷基硫酸钠仅对表皮葡萄球菌和枯草芽胞杆菌在浓度达 1.224% 时, 有明显而稳定的抑制作用 2.3 牙膏抑菌剂的抑菌效果三氯生柠檬酸锌度米芬对大肠埃希菌耐青霉素大肠埃希菌表皮葡萄球菌枯草芽胞杆菌均有抑菌环十二烷基硫酸钠苯甲酸钠和单氟磷酸钠均对枯草芽胞杆菌有抑菌环, 对大肠埃希菌和耐青霉素大肠埃希菌无抑菌环, 而十二烷基硫酸钠对表皮葡萄球菌有抑菌环, 苯甲酸钠和单氟磷酸钠对表皮葡萄球菌无抑菌环山梨醇则均无抑菌环 ( 图 2) 图 2 适宜浓度的牙膏抑菌剂对 4 种细菌菌株的抑菌效果图 A 和 B: 大肠埃希菌 DH5α 菌株 ;C 和 D: 耐青霉素大肠埃希菌 DH5α 菌株 ;E 和 F: 表皮葡萄球菌 ATCC 菌株 ;G 和 H: 枯草芽胞杆菌 CICC 菌株 1: 十二烷基硫酸钠 ;2: 苯甲酸钠 ;3: 度米芬 ;4: 山梨醇 ;5: 柠檬酸锌 ;6: 三氯生 ;7: 单氟磷酸钠 ;8: 氨苄青霉素滤纸片直径为 7 mm 三氯生十二烷基硫酸钠苯甲酸钠单氟磷酸钠的抑菌表现均与含有该成分的牙膏吻合当柠檬酸锌浓度为 1.23% 及以下度米芬浓度为 0.11% 及以下时, 与含柠檬酸锌的高露洁牙膏和含度米芬的冷酸灵牙膏抑菌表现一致, 仅对表皮葡萄球菌及枯草芽胞杆菌有抑菌环, 对大肠埃希菌无抑制作用, 说明若要使含柠檬酸锌和度米芬的牙膏抑制大肠埃希菌, 需柠檬酸锌的浓度达到 1.23% 以上, 度米芬的浓度达到 0.11% 以上表 2 适宜浓度的牙膏抑菌剂的抑菌环统计表

5 大肠埃希菌 DH5α 耐青霉素大肠埃希菌 DH5α 表皮葡萄球菌 ATCC 枯草芽胞杆菌 CICC 十二烷基硫酸钠 (1.224%) 苯甲酸钠 (0.408%) 度米芬 (0.45%) 山梨醇 (40%) 柠檬酸锌 (1.5%) 三氯生 (0.03%) 单氟磷酸钠 (0.14%) 氨苄青霉素注 : 表中数据单位为 mm; 滤纸片直径为 7 mm, - 表示无抑菌环 3 讨论大肠埃希菌是人体肠道中常见的革兰阴性菌, 主要寄生在大肠内, 若从一些其他部位侵入人体可致病 [9] ; 表皮葡萄球菌为皮肤及口腔中常见的革兰阳性菌 ; 枯草芽胞杆菌为环境中常见的革兰阳性菌 ; 实验所选菌种均具有一定代表性本实验中, 柠檬酸锌度米芬苯甲酸钠十二烷基硫酸钠单氟磷酸钠均表现出对革兰阳性菌的作用强于革兰阴性菌, 抑菌谱较窄三氯生的抑菌作用明显优于其他抑菌添加剂, 对革兰阳性菌和革兰氏阴性均表现出较强抑制作用口腔里细菌数量多而杂, 口腔里致病菌不仅有链球菌葡萄球菌等革兰阳性菌, 还有奈瑟菌属等革兰阴性菌, 当口腔生态失调, 就易导致口腔疾病因此, 牙膏抑菌成分的添加应考虑对革兰阴性菌和革兰阳性菌的同时抑制抑菌剂种类繁多, 比较多种牙膏抑菌添加剂的抑菌效果, 三氯生最为高效当三氯生浓度低至 0.03% 时, 对大肠埃希菌耐青霉素大肠埃希菌表皮葡萄球菌枯草芽胞杆菌仍表现出很强的抑菌作用, 抑菌圈分别为 22 mm 25 mm 28 mm 16 mm( 表 2) 含三氯生的牙膏也表现出很强的抑菌效果三氯生可以吸附并穿透细菌的细胞壁, 与细胞质中的蛋白质和脂质反应, 产生不可逆的变性, 从而高效迅速地杀灭细菌 [16] 三氯生对革兰氏阳性菌阴性菌酵母及病毒均有杀灭和抑制作用, 是良好的牙膏抑菌添加剂由于其高浓度时具有细胞毒性, 国家要求在低浓度下使用, 国家牙膏用原料规范 (GB ) 规定, 三氯生在牙膏中的含量必须低于 0.3% 用高效液相色谱法测定 10 余批次牙膏产品中, 三氯生的浓度范围为 0.006%~0.036% [17] 本研究表明牙膏中三氯生添加 0.03% 为宜, 可在保证抑菌效果的同时节约成本虽然三氯生抑菌效果显著, 但三氯生对人体的影响还有待研究, 其危害性尚未完全清楚, 价格也较为昂贵目前, 理想的牙膏抑菌添加剂的选择比较局限, 仍需扩展对牙膏抑菌添加剂的开发参考文献 [1] 张振波, 宋宇哲, 陈金锐. 常见老年口腔疾病及其防治 [J]. 中外医疗,2010, 29(6):

6 [2] 田富饶, 杨兰花, 鲍健峰. 三氯生的应用和检测方法研究进展 [J]. 科技信息, 2011,(28): [3] 孟玲宇, 董国力. 消毒防腐剂的作用特点与影响因素 [J]. 中国保健营养,2013,(1): [4] 李菊, 刘淑君, 黄雪琳. 苯甲酸和苯甲酸钠安全性与检测方法研究进展 [J]. 粮食与油脂,2012,(9): [5] 肖燕清, 自卫东, 钱敏. 我国食品防腐剂的发展现状与对策 [J]. 中国调味品,2010,35(11): [6] 杨旸, 唐子圣. 锌与龋病关系的研究进展 [J], 牙体牙髓牙周病学杂志,2012, 22(9): [7] 黄光伟, 罗喆. 美白牙膏的研究 [J]. 口腔护理用品工业,2010,20 (6): [8] 李瑶, 王艾绒, 张智锋. 假奓包叶在牙膏中的应用 [J]. 口腔护理用品工业, 2012,22(4):8-9. [9] 常兵, 刘志强, 王亚峰. 牙膏配方 [J]. 日用化学品科学,2012,35(10): [10] 张星海, 龚恕. 牙膏抑菌效果分析研究 [J]. 广州化工,2010,38(5): [11] 黄宏光, 蒋卫萍, 梁筱洁. 苯甲酸钠在牙膏中的应用 [J]. 口腔护理用品工业,2010,20(6): [12] 李丽华, 方平, 米方林, 李娜, 伏艳, 文宇涵. 口洁素防治正畸牙龈炎的临床效果评价 [J],. 口腔材料器械杂志,2013,22(3): [13] 杨欣, 谕叶玮. 中草药提取物联合应用锌离子对口臭相关致病菌的体外抑菌效果 [J], 口腔材料器械杂志,2013,22(3): [14] 苏国能. 保湿剂与牙膏抗菌关系的研究 [J]. 口腔护理用品工业,2012, 22(10): [15] 廖海. 全山梨醇含盐牙膏的研究 [J]. 口腔护理用品工业,2010,20(1): [16] 杨晓波. 重提三氯生 [J]. 口腔护理用品工业,2010,20(1): [17] 田富饶, 王旭强, 孙文闪. 牙膏中三氯生的高效液相色谱法检测 [J]. 化学研究,2012,23(4):42-44.

材料方法

材料方法生物技术通报陆敏许黎明吴宏宇张继恩李国栋黄青山溶葡萄球菌酶是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑杀菌活性结果显示重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状