5月15期

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宾漫籍
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1 中国农学通报 2012,28(15): Chinese Agricultural Science Bulletin 巢式 PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 检测转基因大豆方法的研究彭新凯, 宋涛平, 谭舸, 陈娜, 胡朝晖, 杨丽霞 ( 长沙市食品质量安全监督检测中心, 长沙 ) 摘要 : 为了建立转基因大豆检测技术, 采用巢式 PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 技术, 检测转基因大豆外源基因 (CaMV35S CP4EPSPS) 结果表明, 利用巢式 PCR 可检测出 1 ng/µl 转基因含量 1% 的大豆中的 CaMV35S 基因, 而第一轮 PCR 的检测限为 100 ng/µl; 利用 SYBR Green Ⅰ 染料能结合双链 DNA 的特点, 应用实时 PCR 技术可检测到 CaMV35S CP4EPSPS 基因扩增所产生的信号, 通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S 基因的检测限为 0.1 ng/µl 同时利用该方法对黄豆炒黄豆豆干等样品进行检测, 样品中未检出 CaMV35S 基因成分巢式 PCR 方法明显提高了 PCR 的检测限, SYBR Green Ⅰ 实时荧光 PCR 方法能有效快速检测 CaMV35S 转基因成分关键词 : 转基因大豆 ; 巢式 PCR;SYBR Green Ⅰ 实时 PCR; 熔解曲线中图分类号 :Q78 文献标志码 :A 论文编号 : The Detection of Exogenous Genes with Nested PCR and SYBR Green Ⅰ Real Time PCR in Genetically Modified Soybean Line Peng Xinkai, Song Taoping, Tan Ke, Chen Na, Hu Zhaohui,Yang Lixia (Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety, Changsha ) Abstract: Nested PCR and fluorescent SYBR Green Ⅰ real time PCR were developed for detection of several foreign genes (CaMV35S, CP4EPSPS) in genetically modified soybean. The results showed that, nested PCR could detect CaMV35S in 1 ng/µl DNA and the detection limit was 100 ng/µl in the first PCR. SYBR Green Ⅰ real time PCR could detect CaMV35S, CP4EPSPS genes and the detection limit was 0.1 ng/µl for CaMV35S. Different kinds of soybean foodstuffs were detected by nested PCR and real time PCR, the results showed that, no CaMV35S gene was detected in all the foodstuffs. Therefore, nested PCR and the SYBR Green Ⅰ real time PCR were the effective methods for detecting GM soybean foodstuffs. Key words: roundup ready soybean (RRS); nested PCR; SYBR Green Ⅰ real-time PCR; melting curves 0 引言转基因作物是指利用重组 DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组, 改变其遗传组成后产生的植物及其后代, 也称为遗传修饰生物体 (Genetically modified organisms,gmos) 转基因技术在农业生产中的应用越来越广泛, 但转基因农产品的生物安全性目前尚无定论, 许多国家要求转基因食品采用标签技术, 如欧盟韩国日本要求转基因成分超过 0.9% 3% 5% 需在标签上说明因此建立一套简便快速准确的检验技术以满足日常检测的要求是十分必要的目前, 转基因检测的方法主要有 PCR [1] 多重 PCR [2] 多重巢式 PCR [3] 环介导恒温 PCR [4] 荧光定量 PCR [5] 基金项目 : 湖南省重大专项湖南省食品安全监控技术体系研究与示范 (2010FJ1009) 第一作者简介 : 彭新凯, 男,1965 年出生, 湖南长沙人, 高级工程师, 学士, 主要从事食品检验研究通信地址 : 长沙市岳麓区银双路 318 号长沙市食品质量安全监督检测中心,Tel: , csfvqs@163.com 通讯作者 : 杨丽霞, 女,1981 年出生, 河南安阳人, 博士, 主要从事食品分子生物学研究通信地址 : 长沙市岳麓区银双路 318 号长沙市食品质量安全监督检测中心,Tel: , yanglixia612@163.com 收稿日期 : , 修回日期 :

2 234 中国农学通报 PCR-ELISA [6] 等, 中国国家标准中规定了 PCR 方法和 Taqman 实时定量 PCR 方法, 但普通 PCR 检测方法的灵敏度较低, 而 Taqman 实时定量 PCR 方法成本较 [7] 高目前, 巢式 PCR 已广泛运用于医学检验, 其灵敏度和特异性均高于普通 PCR SYBR Green Ⅰ 结合染料 PCR 方法与 TaqMan 荧光定量法相比, 价格低, 而且通过溶解曲线可以判断扩增特异性为此, 笔者采用巢式 PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 技术, 检测转基因大豆外源基因 (CaMV35S CP4EPSPS), 旨在探讨成本较低灵敏度较高的转基因大豆及其制品中外源基因的检测方法 1 材料与方法 1.1 试验材料 PBI121 质粒 DNA 由华南师范大学李玲教授馈赠 ; 含量为 1% 的转基因大豆标准品购自北京北化恒信生物技术有限公司 ; 样品 :2 份大豆样品和 1 份豆腐样品购自市场,2 份炒黄豆 1 个腊八豆和 3 份豆干样品是本单位抽检的样品引物序列 ( 表 1) 参考标准并由鼎国生物公司合成,Taq 酶购自鼎国生物公司,SYBR GreenⅠ 实时 PCR 试剂购自 ABI 公司仪器 :Bio-rad PCR 扩增仪,Stepone 实时荧光定量 PCR 仪 (ABI 公司 ),Biodropsis 超微量核酸蛋白分析仪 ( 北京五洲东方科技发展有限公司 ) 1.2 DNA 提取转基因大豆和样品 DNA 提取参照 DNA 抽提试剂盒 ( 大连宝生物工程有限公司 ) 中的操作步骤 1.3 PCR 扩增采用 25 µl PCR 反应体系, 其中含 :10 PCR 缓冲液 2.5 µl,dntp( 各 10 mmol/l)2 µl, 上下游引物 (5 µmol/l) 各 1 µl,taq 酶 1 U,DNA 模板 1 µl, 灭菌双蒸水补足至 25 µl PCR 扩增条件见表 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 反应反应体系 SYBR Green Ⅰ Master Mix (2 ) 10 µl; 上下游引物 5 µmol/l 各 1 µl; 模板 DNA 2 对引表 1 PCR 引物检测基因引物名称引物序列扩增产物长度 /bp 参考文献 Lectin Lectin1 Lectin2 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 118 [8] 35S 35S-F 35S-R 35S-1 35S-2 GCTCCTACAAATGCCATCATTGC GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC TCATCCCTTACGTCAGTGGAG CCATCATTGCGATAAAGGAAA [9] [8] CP4EPSPS CP4EPSPS1 CP4EPSPS2 CTTCTGTGCTGTAGCCACTGATGC CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCC 320 [9] 表 2 PCR 反应条件基因变性扩增循环数后延伸 Lectin 基因 35S 基因第一轮 PCR 95,5 min 95,30 s 60,30 s 72,30 s 30 72,5 min 35S 基因第二轮 PCR 95,5 min 95,30 s 60,30 s 72,30 s 38 72,5 min 100 ng/µl,1 µl; 加灭菌超纯水至总体积 20 µl 基因扩增反应程序预变性的反应条件 :95, 20 s;pcr 反应 :95,3 s;60,30 s, 共 40 个循环熔解曲线分析 95,15 s;60,60 s; 每增加 1 个循环, 退火温度增加 0.3 直至标准曲线的绘制质粒标准品配制 : 将纯化后的参照质粒 PBI121 先稀释成 10 7 拷贝 /µl, 再连续梯度稀释 8 个梯度, 稀释倍数为 10 倍, 分别为拷贝 /µl 2 结果与分析 2.1 PCR 检测 Lectin 基因转基因大豆标准品和 9 个样品提取 DNA 后, 以 100 ng 基因组 DNA 为模板, 用 Lectin1/2 引物进行 PCR 后电泳, 结果见图 1 图中所有样品的 Lectin 基因扩增产物均有目的片段, 说明提取的 DNA 纯度能够满足 PCR 需要 2.2 巢式 PCR 检测 35S 基因取浓度分别为 g/µl 的转基因大豆标准品 DNA 1 µl 做模板, 用 CaMV35S 基因

3 彭新凯等 : 巢式 PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 检测转基因大豆方法的研究 bp 200 bp 物进行巢式 PCR, 结果见图 2 从图 2 中可见, 在上述反应体系与扩增条件下, 以转基因大豆标准品 DNA 为模板, 能够很好扩增 CaMV35S 基因, 巢式 PCR 可以扩增出 10-9 g/µl 浓度的 DNA 溶液, 未出现非特异性产物对样品进行 35S 基因检测, 均未检出 ( 结果未呈现 ) M M:50 bp DNA Ladder;1: 空白对照 ;2: 标准品 PCR 结果 ; 500 bp 200 bp 3~11: 样品 PCR 结果图 1 Lectin 基因扩增产物 M M:50 bp DNA Ladder;1: 空白对照 ;2~6:DNA 浓度分别为 g/µl 巢式 PCR 结果图 2 CaMV35S 基因巢式 PCR 扩增产物 2.3 SYBR Green Ⅰ 实时荧光 PCR 及熔解曲线测定以浓度为 10-9 g/µl 的转基因大豆标准品 DNA 1 µl 做模板, 通过荧光检测系统实时检测, 结果表明 Lectin CaMV35S CP4EPSPS 基因均得到了扩增, 扩增图谱呈典型的 S 曲线, 见图扩增产物的熔解曲线分析转基因大豆标准品 DNA 经过 40 个循环的扩增反应后, 对 PCR 产物进行 60~95 熔解, 并对荧光值的变化速率与温度变化求一阶导数, 获得 Lectin CaMV35S CP4EPSPS 扩增产物的熔解曲线图 ( 图 4) 根据熔解曲线特征, 一个峰对应一个扩增产物 Lectin CaMV35S CP4EPSPS 序列分别在出现一个峰 2.5 定量标准曲线的建立以梯度稀释的 PBI121 质粒 DNA 作为模板进行定量 PCR, 得到的扩增曲线如图 5 所示高含量 DNA 模板达到相同的荧光强度所对应的 Ct 值比低含量 DNA 模板的小, 即 Ct 值与 DNA 模板含量呈反比关系 ; 未加 DNA 模板的阴性对照则没有检测到荧光在转换后的标准曲线图中,Ct 值与 DNA 模板扩增拷贝数的对数呈反比,Ct 值越低, 拷贝数越大 ( 图 6) 2.6 灵敏度检验对 PBI121 质粒 DNA 以 10 倍梯度进行稀释, 然后以各稀释液为模板进行扩增, 荧光信号随着样本的浓度逐渐下降, 可检测得范围为 10 2 拷贝 /µl, 相关系数为以 g/µl 转基因大豆标准品 DNA 为模板, 运用 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 方法进行检测, 其 Ct 值分别为 , 其中 g/µl 的 DNA 未检出 3 结论巢式 PCR 是运用第一轮 PCR 的产物作为模板, 进行第二轮 PCR, 显著提高了 PCR 的灵敏度, 在本实验中其检测限可达到 1 ng/µl SYBR Green Ⅰ 荧光染料法相对于普通 PCR 而言, 灵敏度更高, 检测限可达到 0.1 ng/µl, 而且不需要电泳, 节省了检测时间溶解曲线弥补了 SYBR Green Ⅰ 荧光染料法定量 PCR 不能区分非特异性扩增的缺陷, 检测成本明显低于 TaqMan 荧大豆 Lectin 基因扩增曲线 CaMV35S 基因扩增曲线

4 236 中国农学通报 CP4EPSPS 基因扩增曲线图 3 转基因大豆基因扩增曲线大豆 Lectin 基因扩增熔解曲线 CaMV35S 基因扩增熔解曲线 CP4EPSPS 基因扩增熔解曲线图 4 转基因大豆基因熔解曲线４０３５循环次数３０２５２０ｙ４０１９１ｘ４２５１７Ｒ２０９９９３１５１０５００２４６８拷贝数的对数图 5 CaMV35S 基因扩增曲线光定量PCR方法巢式PCR和SYBR Green Ⅰ荧光染料法定量PCR均适合于转基因植物中转基因成分的检测图 6 CaMV35S 基因实时扩增标准曲线 4 讨论巢式 PCR 反应主要应用于分子生物学研究和医

5 彭新凯等 : 巢式 PCR 和 SYBR Green Ⅰ 实时 PCR 检测转基因大豆方法的研究 237 学检测研究中, 由于有 2 次 PCR 扩增, 从而降低了扩增多个靶位点的可能性, 增加了检测的敏感性和可靠 [10] 性传统 PCR 检测需要电泳及凝胶成像系统才能看到结果, 从 PCR 到检测结果出来大约需要 3 h, 而且存在交叉污染的可能性 Real time PCR 有快速检测程序, 而且 PCR 管不要打开就可读出结果, 目前在转基 [11-12] 因检测方面已有较多文献报道 TaqMan 探针实时荧光 PCR 方法采用互补的荧光探针与靶序列特异性杂交, 所以检测特异性高, 但探针合成的价格较昂贵, 并且不同的基因要设计不同的探针, 在一定程度上限制了特异性荧光探针的使用在 Real time PCR 中使用 SYBR Green Ⅰ 等荧光染料也有较多文献报 [13-14] 道虽然该方法没有探针法特异性强, 但通过溶解曲线分析可区分不同产物溶解曲线峰的形状和位置 [15] 与 GC/AT 比例片段长度和序列有关因此, 通过优化反应条件等可使溶解曲线法对扩增产物进行区分笔者在实验中根据转基因大豆外源基因 CaMV35S 和 CP4-EPSPS, 建立了 CaMV35S 基因的巢式 PCR 检测方法,CaMV35S 基因和 CP4-EPSPS 基因的 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量的检测方法在巢式 PCR 中, 能很好的扩增 CaMV35S 基因, 检测下限可达到 1 ng/µl, 比普通 PCR 方法的检测限提高了 100 倍运用 SYBR Green Ⅰ 为染料进行定量检测时, 检测限可达到 0.1 ng/µl, 标准曲线的相关系数达到 , 因此本方法具有较好的稳定性, 较高的灵敏度希望科研工作者能将这 2 种方法进一步优化, 使其成为标准检测方法, 在转基因食品检验中发挥作用参考文献 [1] 孙红炜, 路兴波, 杨崇良, 等.9 种大豆制品中转基因成分定性 PCR 检测 [J]. 食品科学,2008,29(2): [2] Oguchi T, Onishi M, Mano J, et al. Development of multiplex PCR method for simultaneous detection of four events of Genetically Modified Maize: DAS , MIR604, MON863 and MON88017[J]. Food Hyg Saf Sci,2010,51(3): [3] Zhang M H, Gao X J, Yu Y B, et al. Detection of Roundup Ready soy in highly processed products by triplex nested PCR[J]. Food Control,2007(18): [4] Liu M, Luo Y, Tao R, et al. Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by Loop-Mediated Isothermal Amplification[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(1): [5] Maria C S, Mariolina G, Nelson M. Quantitative detection method for Roundup Ready soybean in food using duplex real-time PCR MGB chemistry[j]. J Sci Food Agric,2010(90): [6] 单宏.PCR-ELISA 方法在转基因大豆检测中的应用 [J]. 大豆通报, 2006(1):37-38,42. [7] 赵祥平, 王玉玲, 侯艳梅. 驽巴贝斯虫病巢式 PCR 检测方法的研究 [J]. 中国动物检疫,2009(10): [8] 覃文, 董洁, 邓鸿铃, 等.SNT , 食用油脂中转基因成分定性 PCR 检测方法 [S]. [9] 蒋原, 祝长青, 林宏.SNT , 大豆中转基因成分的定性 PCR 检测方法 [S]. [10] 陶冉, 刘梅, 王雷, 等. 应用巢式 PCR 技术对水产饲料及食品转基因成分检测的研究 [J]. 饲料工业,2007,28(21): [11] Akiyama H, Sasaki N, Sakata K, et al. Indicated detection of two unapproved transgenic rice lines contaminating vermicelli products [J]. J Agric Food Chem,2007(55): [12] 张淑洁, 张正英.REAL-TIME PCR 方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数 [J]. 中国生物工程杂志,2010(3) [13] Lipsky R H, Mazzanti C M, Rudolph J G, et al. DNA melting analysis for detection of single nucleotide polymorphisms[j]. Clin Chem,2001(47): [14] 张冰冰, 赵魁, 宋德光. 绵羊 IFN-γ 和 IL-2 基因 SYBR Green Ⅰ real-time PCR 检测方法的建立及应用 [J]. 中国兽医科学,2010,40 (11) [15] Ririe K M, Rasmussen R P, Wittwer C T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction[j]. Anal Biochem,1997(245):

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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